Name: 成年小鼠心肌细胞的单细胞转录谱 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-12-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 23 s
Description: 学习成年小鼠心肌细胞的单细胞分离与基因表达分析方法，包括胶原酶灌注消化、定量PCR和微阵列技术。该方法可揭示细胞间表达差异，为心血管生物学研究提供高质量数据。

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作者谨此感谢 C. Zambataro 在拍摄本实验方案过程中提供的技术支持。我们衷心感谢 Glenn 医学研究基金会（S.M.）、Hillblom 基金会，以及美国国立卫生研究院对 Nathan Shock 中心奖项（P30AG025708）和 PO1AG025901 项目的支持。J.M.F. 的研究由授予巴克衰老研究研究所的 T32AG000266 项目资助。

1. 步骤1 - 心肌细胞分离
<ol>
<li>按如下方法配制消化缓冲液：
 
 10 x 消化缓冲液（用超纯 H2O 配制）
<table border="1">
<tbody>
 <tr>
 <td>  </td>
 <td> 终浓度</td>
 <td>g/L</td>
 <td>g/500 mL</td>
 <td>10x 溶液 g/L</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>NaCl </td>
 <td>130 mM</td>
 <td>7.597 </td>
 <td>3.3</td>
 <td>75.97 </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>KCl</td>
 <td>5 mM</td>
 <td>0.4 </td>
 <td>0.2</td>
 <td>4.0 </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>丙酮酸（Pyruvic acid）</td>
 <td>3 nM</td>
 <td>0.33</td>
 <td>0.165</td>
 <td>3.30</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>HEPES </td>
 <td>25 mM</td>
 <td>5.96 </td>
 <td>2.85</td>
 <td>59.6</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>MgCl2 </td>
 <td>0.5 mM </td>
 <td>0.101</td>
 <td>0.05</td>
 <td>1.01</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>NaH2PO4monobasic</td>
 <td>0.33 mM</td>
 <td>0.04</td>
 <td>0.02</td>
 <td>0.40 </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>葡萄糖（Dextrose）</td>
 <td>22 mM </td>
 <td>3.96 </td>
 <td>1.98</td>
 <td>39.6 </td>
 </tr>
 </tbody>
</table> 
用 NaOH 将缓冲液 pH 调至 7.4</li>
<li>使用上述 10x 消化缓冲液，为每颗待灌注的心脏配制以下四种溶液（用超纯 H2O 配制）：</li>
</ol>
 消化缓冲液 A（将此溶液分为三份）
 <ul>
 <li>50 mL - 1× 消化缓冲液，包含：
 <ul>
 <li> 75 μL - EGTA 溶液 (100 mM EGTA) </li>
 </ul>
 </li>
 </ul>
 消化缓冲液 B（配制以下其中一种）
 <ul>
 <li>25 mL - 1× 消化缓冲液，包含：
 <ul>
 <li>1.25 μL - CaCl2 溶液 (1 M) </li>
 <li>1 mg - 蛋白酶</li>
 <li>25 mg - 胶原酶（也可使用该量的75% = 18.75 mg）** </li>
 </ul>
 </li>
 </ul>
 收集缓冲液（配制以下其中一种）
 <ul>
 <li>2.5 mL - 含有以下成分的1×消化缓冲液：
 <ul>
 <li>1.25 μL - CaCl2 溶液 (1 M)</li>
 <li>0.5 mg - 蛋白酶</li>
 <li>15 mg - 胶原酶 (75% = 11.25 mg)**</li>
 <li>125 mg - BSA </li>
 </ul>
 </li>
 </ul>
中和洗涤缓冲液（配制以下其中一种）
<ul>
 <li>25 mL - 含有以下成分的 1 倍消化缓冲液：
 <ul>
 <li>6.25 μL - CaCl2 溶液 (1 M)</li>
 <li>250 mg BSA</li>
 </ul>
 </li>
</ul>
** 根据胶原酶的来源和批次不同，酶活性可能存在差异。可能需要优化加入该缓冲液的酶量，以防止过度消化。
<ol start="3">
<li>按照先前详细描述的方法1,2设置分离系统：在冰上放置三个装有消化缓冲液A的15 mL离心管，准备一个装有50 mL消化缓冲液A的离心管和一个装有25 mL消化缓冲液B的离心管用于灌流（至少需用5 mL消化缓冲液A冲洗管路），将收集缓冲液在水浴中预热至37°C，中和洗涤缓冲液置于室温备用。</li>
<li>用冰冷的消化缓冲液A填充灌流套管以及用于清洗心脏并将其结扎在灌流尖端上的解剖皿。在套管上端松松地打一个结（使用4-0至6-0规格的缝合线），之后可用于固定主动脉，防止心脏从套管滑脱。</li>
<li>通过腹腔注射麻醉剂（0.25 mL戊巴比妥钠溶液）对小鼠实施终末镇静，并确认小鼠已失去意识且对疼痛刺激无反应。沿胸廓边缘小心切开膈肌以打开胸腔（见图2）。向上方剪开并翻起前部肋骨（这些切口在图2中分别标记为B和A）。关键步骤：在进行上述切口前，小鼠必须仍保持呼吸状态。</li>
<li>使用一段剪裁合适的塑料移液管，轻柔地将心脏吸入管内。从胸腔中取出心脏时应注意保留足够长度的主动脉，以便清晰识别主动脉分支（见图3）。使用移液管是为了尽量减少对心脏的损伤。</li>
<li>将心脏放入一个装有冰冻消化缓冲液A的离心管中，冲洗去除血液。15–45秒后，将心脏转移至第二个装有冰冻消化缓冲液A的离心管中再次短暂冲洗。随后将心脏转移至同样盛有冷消化缓冲液A的培养皿中。</li>
<li>在解剖显微镜下观察培养皿中的心脏，仔细分离主动脉及其分支。在最远端分支稍下方进行精细修剪（见图4）。</li>
<li>在解剖显微镜下的操作台上，将套管尖端插入主动脉，并使用4-0至6-0缝合线结扎固定。确保套管在主动脉内的位置不过低，且位于冠状动脉上方（见图4）。</li>
<li>当消化缓冲液A持续流经灌流装置时，将灌流尖端连接至系统，开始对心脏进行灌流，直至大部分血液被冲洗干净，流出液体变得澄清。关键点：灌流液从导管流出时的温度应尽可能接近37°C。若溶液过热或过冷，会导致组织死亡。从心脏取出到开始灌流的时间也非常关键，必须控制在5–10分钟以内。心脏必须在麻醉状态下取出，不得使用CO2窒息或颈椎脱位方式。</li>
<li>当血液完全冲洗干净后，将灌流液由消化缓冲液A切换为消化缓冲液B，确保消化缓冲液B开始流经心脏。此时溶液将逐渐呈现淡黄色。等待2–3分钟，直至心脏开始变形并趋于圆润，表明消化过程正在起效。随着灌流进行，心肌组织应逐渐变亮。</li>
<li>用剪刀剪下心室，放入含有15 mL 37°C收集缓冲液的50 mL锥形管中。在将组织置入收集缓冲液的同时，轻柔地将心室剪成小块。使用塑料移液管轻轻吹打混匀，以解离细胞间连接，形成单个心肌细胞悬液。</li>
<li>当大部分组织已溶解（少于1分钟）时，让较大的组织碎片自然沉降至管底。小心吸出上清液并转移至15 mL锥形管中保存。在室温下静置10–20分钟（推荐15分钟），依靠重力使上清液中的细胞形成沉淀。</li>
<li>弃去上清液。向沉淀中加入5 mL中和洗涤缓冲液，轻柔混匀以重悬细胞。此时细胞即可直接用于单细胞分析（进入步骤2）。</li>
</ol>
2. 步骤2 - 单细胞分离
<ol>
 <li>使用火焰和玻璃毛细管制备显微操作器，用于细胞操作。该显微操作器由一根极细的毛细管制成，连接一段长的柔性管，通过施加负压可移动或拾取细胞。</li>
 <li>立即在显微镜（Nikon Eclipse TS100，20x）下使用显微操作器进行单个细胞的选择，该操作器由拉制的移液毛细管和防污染气锁装置构成，以防止物质污染单细胞样品。确保细胞群体健康（存活率70%）且未因分离过程受损。</li>
 <li>将细胞稀释至小型培养皿中，以便进行单细胞挑选。挑选时应确保将细胞捕获于小体积（小于2 μL）中。仅选择具有典型正常心肌细胞形态的健康细胞（图5）。</li>
 <li>将单个细胞分别放入PCR管底部，并立即置于干冰上速冻。这些细胞随后在-80°C保存，直至用于基因表达分析。</li>
</ol>
3. 步骤 3A - 单细胞 qPCR 基因表达

对单个细胞进行qPCR时，采用一种由Fluidigm公司为其Biomark纳米流体qPCR阵列开发的单细胞基因表达方案改进而来的实验流程（Fluidigm - 高级开发方案 #30）3,4。
<ol>
 <li>逆转录-特异性靶标扩增（RT-STA）的制备。首先，将目的基因的所有引物对重新悬浮（我们已成功使用多达125对引物），引物对的终浓度为 100 μM 在1× DNA悬浮缓冲液（10 mM Tris，pH 8.0，0.1 mM EDTA）中，混合并进一步稀释正向与反向引物对至 20 μM 每项检测。最后，将所有引物对混合稀释为单一溶液，使每项检测在RT-STA反应中的终浓度为200 nM。具体操作为：将每对引物分别稀释1:100。例如，若含有30个检测的引物对 20 μM，你需要添加 1 μL 每对中的一个30 μL 总量），然后用 70 μL DNA悬浮缓冲液，以达到最终的稀释体积 100 μL. </li>
 <li>引物溶液制备完成后，配制逆转录-STA反应主混合液。根据需要扩增的单个细胞数量，准备相应体积的主混合液。 
<table border="1">
<tbody>
 <tr>
 <td>试剂 </td>
 <td>体积在 μL （每反应）</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>CellsDirect 2x 反应混合液</td>
 <td>5.0</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>SuperScript III RT Plantinum Taq 混合液</td>
 <td>0.2</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>RT-STA 引物混合物（每种检测 200 nM）</td>
 <td>2.5</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>无核酸酶水2O（或1× DNA悬浮缓冲液）</td>
 <td>1.3</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>总计</td>
 <td>9.0</td>
 </tr>
 </tbody>
</table>
表1. RT-STA 起始混合液 
 </li>
 <li>立即取出冻存的细胞，以最大相对离心力（RCF）离心30秒，确保细胞沉降至管底。加入 9 μL 将RT-STA混合液加入管中，随后在热循环仪中进行反应。
 <ol class="lalpha">
 <li>50°C 15 分钟</li>
 <li>95°C - 2 分钟</li>
 <li>18 个循环
 <ol class="lroman">
 <li>95°C 15 秒</li>
 <li>60°C 4 分钟</li>
 </ol>
 </li>
 <li>保持在 4°C </li>
 </ol>
 </li>
 <li>从PCR仪中取出试管并加入 4 μL 向反应中加入 ExoSAP-IT。ExoSAP-IT 是一种 PCR 产物纯化试剂，可去除 RT-STA 反应中过量的引物和酶。将离心管放入 PCR 仪中，运行以下反应程序。
 <ol class="lalpha">
 <li>37°C - 15 分钟</li>
 <li>80°C - 15 分钟</li>
 <li>保持在 4°C </li>
 </ol>
 </li>
 <li>ExoSAP-IT 处理完成后，用 DNA 悬浮缓冲液将样品稀释至 1:5。样品现可进行 qPCR 分析。我们采用该样品与 Fluidigm 的基因表达 qPCR 芯片（48.48 或 96.96 芯片）联合使用。此方法也可用于更传统的 qPCR 仪器（96 孔或 384 孔板格式）。然而，这些仪器通常需要更多的样品投入量，从而限制了从单个细胞中可开展的检测数量。 </li>
</ol>
3. 步骤 3B - 单细胞全转录组扩增与微阵列分析
提取与扩增
<ol>
 <li>使用 Sigma 的 WTA2 试剂盒（货号：WTA2）对来自细胞沉淀和单个细胞的双链 cDNA 进行扩增。单个细胞按照 Sigma WTA2 试剂盒说明书中的第一步进行“提取”。在该第一步中，将样品与文库合成缓冲液孵育，孵育条件为 37°C 5分钟可破坏单个细胞的膜结构，并“提取”出用于扩增的遗传信息。 </li>
 <li>使用Sigma-Aldrich的WTA2试剂盒说明书进行两轮单细胞扩增。按照生产商的方案进行文库制备步骤；然后将文库样品的1/5加入 70 μL WTA2 扩增的 

 
 预混液。使用推荐的循环参数对样品进行25个循环的扩增。 </li> 
 <li>使用Qiagen的QIAquick PCR纯化试剂盒（货号# 28104）对样品进行纯化，并在Qiagen的Qiacube上采用“Cleanup QIAquick PCR Amplification Reactions Standard V4”程序进行处理。 </li>
 <li>将纯化的样品浓缩至 5 μL使用真空离心浓缩仪干燥后，进行第二轮17个循环的扩增（重复WTA2扩增程序及循环参数）。 </li>
 <li>使用 QIAquick PCR 纯化试剂盒纯化样品，并按照生产商方案，利用 NanoDrop 分光光度计和 Agilent 的 BioAnalyzer DNA 7500 试剂盒检测样品质量。 </li>
</ol>
 标记与NimbleGen基因表达芯片
 <ol start="6">
 <li>根据制造商说明书，使用 NimbleGen 的单色标记试剂盒（货号：05223555001）对每个扩增细胞样本的 2 μg 双链 cDNA 进行标记。</li>
 <li>将 5 μg Cy3 标记的样本杂交至 Mus musculus 12x135k NimbleGen 基因表达芯片（货号：05543797001），具体操作依据制造商说明书进行。样本与芯片杂交后，需对芯片切片进行洗涤和干燥，然后方可使用激光扫描仪成像。</li>
 <li>使用激光扫描仪对基因表达芯片进行扫描。本实验采用 Molecular Devices GenePix 4200A 扫描仪，设置为 100POW 和 300-350PMT。随后使用 NimbleGen 的 NimbleScan 软件为每张芯片生成 pair 文件，并进一步分析各个单细胞芯片的全转录组表达（典型稳定表达的心肌细胞转录本表格作为补充材料提供；表 S1）。</li>
</ol>
如果心脏灌注效果良好，则分离后应有较高比例的健康心肌细胞保留其典型的矩形形态。如果灌注过程不理想，则会出现大量死亡细胞（见图5中的图像）。如果使用WTA2或RT-STA方法正确进行了扩增，则最终产物应能通过NanoDrop和BioAnalyser对mRNA样本质量进行的后续质控检测（图6）。对于微阵列工作流程，该检测在WTA扩增完成后进行，此时mRNA需经NanoDrop和Bioanalyzer双重检测。此分析的代表性阳性结果如图6所示。WTA2样品应在NanoDrop分光光度计读数以及Bioanalyzer（BA）芯片的电泳图谱输出中均显示出强烈的扩增信号（图6）。表S1列出了通过单细胞微阵列稳定检测到的一组基因，作为示例。对于qPCR过程，可通过在PCR反应结束后进行熔解曲线分析来评估数据质量，以确保引物组扩增的是目标产物（图7）。若结果正确，该熔解步骤应产生单一特异的熔解峰。为说明这一点，图8以热图形式展示了部分纳米流体qPCR数据的熔解峰温度8。可通过PCR产物的熔解温度评估其质量，以确认无非特异性产物的存在5。该图中每一行代表一个细胞样本（S1-S40），每个样本进行了43个独立的qPCR检测（A1-A43）。从图中可以明显看出，某些检测结果变异较大，其可靠性可能低于那些PCR特异性更高、更稳定的检测。
<img src="/files/ftp_upload/3302/3302fig1.jpg" alt="显示从组织到微阵列结果的RNA分析流程的qPCR表达检测示意图。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图1"> 
图1. 单细胞分离与基因表达分析流程示意图。该实验流程将演示小鼠心脏的手术摘除以及单个心肌细胞的分离。本实验所涉及的方法包括在全转录组扩增（WTA）后进行qPCR或微阵列分析的方法。WTA流程首先进行细胞裂解（A），随后Sigma的通用引物（B）与mRNA群体结合。引物的延伸（C）及扩增（D）阶段可产生微克级的扩增产物。该扩增过程随后再次重复（E），以生成足量材料用于微阵列实验。
<img src="/files/ftp_upload/3302/3302fig2.jpg" alt="人体呼吸系统示意图；膈肌运动，肋骨结构；解剖学研究。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 2"> 
图 2. 小鼠心脏摘除切口位置示意图。沿肋骨侧壁进行切割（A），然后沿肋骨下缘切割（B）。切断心脏上方和下方的血管可使心脏完整摘除，同时保留足够长度的主动脉以便插管。图片改编自 M.J. Cook 6。
<img src="/files/ftp_upload/3302/3302fig3.jpg" alt="显示主动脉弓、肺动脉和肺部附近静脉的心血管系统示意图。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图3"> 
图3. 小鼠胸腔解剖示意图。虚线表示在不损伤心肌组织的情况下，从胸腔中切除心脏时的切口位置（A）。图像改编自 MJ Cook 6。
<img src="/files/ftp_upload/3302/3302fig4.jpg" alt="主动脉弓解剖图，显示升主动脉和降主动脉，以及导管插入位置。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 4"> 
图 4. 主动脉弓及其分支的示意图。灰色线条表示主动脉修剪的理想位置（A）。将仍连接心脏的剩余主动脉进行插管，使插管尖端（B）到达主动脉内的适当位置（C）。图像改编自 F. Gaillard 7。
<img src="/files/ftp_upload/3302/3302fig5.jpg" alt="用于矿物样品分析的晶体学显微镜图像，箭头指示结构。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 5"> 
图 5. 用于基因表达分析的单细胞筛选。每张图显示在光学显微镜下观察到的心肌细胞，呈现心肌细胞的典型形态。绿色箭头指示健康的心肌细胞。红色箭头指示死亡或濒死的细胞。这些死亡细胞不应用于分析。
<img src="/files/ftp_upload/3302/3302fig6.jpg" alt="用于蛋白质定量的紫外-可见吸收光谱；图中显示吸光度与波长的关系。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 6"> 
图 6. 单细胞扩增的全转录组扩增（WTA）质量控制结果。（A）NanoDrop 分光光度计读数图像，适用于 WTA 反应中扩增的转录产物。（B）BioAnalyzer 芯片读数显示了三个扩增细胞的结果。
<img src="/files/ftp_upload/3302/3302fig7.jpg" alt="qPCR扩增、熔解曲线；图表；DNA定量、温度分析、荧光数据。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图7"> 
图7. qPCR扩增曲线（左图）和熔解峰温度曲线（右图）。(A) 质量检测的表达结果显示出单一的熔解峰，尽管扩增曲线存在差异。(B) 低质量引物组的熔解曲线，其熔解峰高度可变，不适合用于表达分析。
<img src="/files/ftp_upload/3302/3302fig8.jpg" alt="用于数据聚类分析的热图及树状图；包含颜色编码的Z分数直方图。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图8"> 
图8. 单细胞qPCR反应的质量控制结果。该热图以颜色梯度显示熔解温度。图中展示了40个单细胞（S1–40）中每个qPCR检测（A1–A43）的峰值熔解温度。qPCR检测根据其熔解温度进行聚类。通过观察每列检测的垂直分布，可了解各检测在所有样本中的熔解温度变异情况。该图表明，部分qPCR检测具有高度特异性，而另一些则变异较大，因此不适合用于单细胞分析。
表 S1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3302/TableS1_array.csv"> 芯片数据的补充表格。</a> 本表所列基因依据其在大量数据集中单个心肌细胞中的检测稳健性排序。该基因列表反映了多个通常在单个心肌细胞中表达的基因的检测灵敏度。

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</ol>

本文的免费访问和出版由 Sigma-Aldrich 赞助。

该方法有可能生成心肌细胞，用于多种功能研究以及基因表达研究。单细胞检测是基因表达分析中的一个新兴领域。在单细胞水平上检测转录水平的优势在于，能够分析纯化的细胞群体，而这是从整体组织样本中无法实现的。此外，单细胞分析还可检测单个细胞中mRNA水平的随机变异，从而界定过去被认为具有同质性的细胞群体8,9。除了鉴定在基因表达上可能具有随机性的基因外10,11,12，该方法还可用于鉴定由其基因表达谱所定义的稀有细胞群体。
尽管该方法在基因表达分析中具有多种令人期待的潜在应用，但在使用单细胞时仍需注意一些局限性和考虑因素。单细胞分析的主要限制在于实验中需收集足够数量的细胞，以针对感兴趣的指标（例如方差）达到统计学显著性。当从目标组织中分离的细胞数量不受限制时，可采用下一代测序或纳米流体阵列等方法，对每组数百个细胞进行分析。然而，在某些情况下，可能难以从目标组织中获得足够的细胞，部分原因在于靶向细胞类型的收集过程具有特殊性且耗时较长。尽管如此，只要在进行单细胞收集前进行周密的规划和准备，仍有可能在技术误差有限的情况下完成严谨的单细胞分析。在分析结果时必须考虑到，尽管该细胞分离方法已在多项研究（包括显微成像、电生理学等）中被使用，但分离过程本身仍可能影响基因表达。与任何操作生物样本的方法一样，应对研究结果进行仔细验证，以确保单细胞的表达情况能够真实反映组织本身的特性，而非受到技术偏差的影响。原位杂交等方法可用于在完整组织中验证这些结果。最后，必须严格确保所生成的数据经过仔细的质量控制检查。图8所示数据表明，qPCR检测在特异性方面可能非常稳健，例如检测#13（A13），但也可能存在高度变异性，从而导致技术性差异，如检测#34（A34）。

<table><tbody><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71378</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>60128</td><td></td></tr><tr><td>丙酮酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4562</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>54457</td><td></td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1020</td><td></td></tr><tr><td>磷酸二氢钠（NaH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; monobasic）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9791</td><td></td></tr><tr><td>葡萄糖</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G6721</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>72068</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>O3777</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>21115</td><td></td></tr><tr><td>蛋白酶，XIV型</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5147</td><td></td></tr><tr><td>胶原酶，I型</td><td>Worthington Biochemical</td><td>C9891</td><td></td></tr><tr><td>1× DNA 悬浮缓冲液（10 mM Tris，pH 8.0，0.1 mM EDTA）</td><td>TEKnova, Inc.</td><td>PN T0221</td><td> </td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B8667</td><td></td></tr><tr><td>戊巴比妥钠</td><td>Henry Schein</td><td>联系供应商获取订购信息</td><td>*必须通过兽医或实验动物专业人员采购</td></tr><tr><td>ExoSAP IT</td><td>Affymetrix</td><td>78201</td><td></td></tr><tr><td>CellsDirect 2× 反应混合液</td><td>Invitrogen</td><td>11737-030</td><td></td></tr><tr><td>SuperScript III RT Platinum Taq 混合液</td><td>Invitrogen</td><td>10928-042</td><td></td></tr><tr><td>RT-STA 引物混合液</td><td>IDT</td><td>定制</td><td></td></tr><tr><td>无核酸酶水</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>W4502</td><td></td></tr><tr><td>WTA2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>WTA2-50rxn</td><td></td></tr><tr><td>Qiaquick PCR 纯化试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td></td></tr><tr><td>Qiacube</td><td>Qiagen</td><td>9001292</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop 分光光度计</td><td>NanoDrop</td><td>2000c</td><td></td></tr><tr><td>BioAnalyzer DNA 7500 试剂盒</td><td>Agilent Technologies</td><td>7500 kit</td><td></td></tr><tr><td>单色标记试剂盒</td><td>Roche Group</td><td>5223555001</td><td></td></tr><tr><td>小鼠（Mus Musculus）12×135k 芯片</td><td>Roche Group</td><td>5543797001</td><td></td></tr><tr><td>GenePix 4200A 扫描仪</td><td>Molecular Devices</td><td>4200A</td><td></td></tr><tr><td>TransPlex 完整转录组扩增试剂盒（WTA2 试剂盒）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>WTA2-50RXN</td><td> </td></tr></tbody></table>

成年小鼠心肌细胞的单细胞转录谱分析

Single Cell Transcriptional Profiling of Adult Mouse Cardiomyocytes

尽管已有大量研究通过心脏组织匀浆物来分析基因表达变化，但这种方法无法研究组织内单个细胞之间的固有随机变异。通过对小鼠心脏进行胶原酶灌注以分离出纯的心肌细胞群体，可进一步构建单细胞微阵列用于全转录组基因表达分析，或利用纳米流体芯片阵列对特定靶标进行qPCR检测。本文描述了一种从心脏中分离心肌细胞后分析其单细胞基因表达谱的实验流程。该方法能够评估一些不依赖于均值的参数（例如组织内细胞间的表达差异），而这些参数在使用传统全组织工作流程进行基因表达分析时是无法获得的（图1）。我们已实现对单细胞转录组的稳定扩增，获得微克级的双链cDNA，从而支持在单个细胞上应用微阵列技术。在本实验流程中，我们采用了NimbleGen芯片，因其使用简便且可定制设计。此外，也可采用逆转录-靶标特异性扩增（RT-STA）反应，结合纳米流体PCR技术，实现对数百个靶标的qPCR检测。通过上述任一方法，均可分析细胞间的表达异质性，以及组织中稀有细胞类型的表达谱。总体而言，单细胞基因表达分析方法能够产生揭示特异性表达模式的数据，而这些模式在分析由完整组织制备的典型匀浆样本中数百万细胞的表达时通常会被平均化而掩盖。

单细胞表达谱分析可对单个细胞进行详细的基因表达分析。我们描述了心肌细胞的分离方法，以及对所得裂解液进行全转录组微阵列分析或特定靶标qPCR检测的制备步骤。

尽管已有大量研究通过心脏组织匀浆物来检测基因表达变化，但这阻碍了对内在随机变异的研究……

本演示的主要目标是首先展示如何分离出具有活性的成年小鼠心肌细胞，然后演示两种单细胞基因表达分析方法。从小鼠体内取出心脏后，用胶原酶消化液对心脏进行灌注，以获得单个细胞。对于单细胞的定量PCR分析，纯化后的细胞可直接用于QPCR检测。分离的心肌细胞也可用于微阵列分析。单细胞微阵列分析包括 mRNA 提取、通过多重文库进行全转录组扩增，随后进行有限扩增，最后对微阵列芯片进行标记和杂交。这两种方法的最后一步均为确保获得高质量的数据。这些实验步骤表明，可以从单独分离的成年心肌细胞中实现可靠的基因表达分析。与现有方法（如对整个组织匀浆进行基因表达谱分析）相比，该方法的优势在于单细胞基因表达分析能够让您获取单个细胞内的表达信息，以及细胞间表达水平的变异性。首先准备一个完整的分离系统，包括所需的各种溶液和缓冲液；通过腹腔注射0.25毫升戊巴比妥钠溶液，对小鼠实施终末麻醉，并确保小鼠已失去意识，且对疼痛刺激无反应。在小鼠尚未停止呼吸前，不得使用二氧化碳或颈椎脱臼法对小鼠实施安乐死。小心剪开横膈膜，沿胸缘打开胸腔。然后向上方剪开并翻转前部肋骨 cage。用预切的塑料移液管轻轻吸取心脏，并从胸腔中切除心脏。将心脏放入冰浴消化液中。在15至45秒后用缓冲液A冲洗以去除血液，再用缓冲液A进行第二次短暂冲洗，然后将心脏转移至含有缓冲液A的培养皿中，并置于解剖显微镜下。仔细分离主动脉及其分支。将主动脉修剪至最后一支分支的稍下方。将套管尖端插入冠状动脉上方的主动脉，并用4-0或6-0缝线固定。开始使用消化缓冲液A进行灌注。随着血液从心脏中被冲洗出来，流出液将由红色变为透明。从处死动物到将心脏连接至灌注装置之间所用的时间至关重要。理想情况下，操作时间应控制在5到10分钟以内。此外，流经灌注装置的液体温度必须保持在37摄氏度。如果温度过高或过低，都会破坏组织。当血液从心脏中冲洗干净后，改用消化液。用缓冲液 B 灌注心脏 2 至 3 分钟，直至心脏开始失去原有形态并呈现圆形。随着灌注的进行，心肌组织应逐渐变浅，此时将心室剪下，并将其剪碎成更小的组织块。将心室组织放入含有15毫升预热收集缓冲液的50毫升锥形管中。用塑料移液管轻轻吹打混匀，制成单细胞心肌细胞悬液。一分钟后，将混合液转移至新管中，待沉淀形成后静置。弃去上清液并重悬。将沉淀的细胞悬浮于五毫升中和洗涤缓冲液中。此时细胞已准备好进行单细胞分析筛选。将细胞稀释至小型培养皿中，以便进行单个细胞的挑选。在显微镜下，使用连接至气密装置的拉制毛细管选择健康的单个细胞。挑选细胞时，务必避免污染，并将捕获体积控制在两微升以下。将单个细胞置于各自的PCR管底部，立即在干冰上冷冻。然后将细胞于-80摄氏度保存，以开始对目的基因的所有引物对进行重悬，使用100微摩尔和1×DNA悬浮缓冲液，将引物对混合并稀释至20微摩尔。最后，将所有引物对稀释成单一溶液，终浓度为200纳摩尔。引物溶液配制完成后，立即配制预混液，同时从冰箱中取出冻存的细胞，以最大转速离心30秒。然后向每根试管中加入9 µL预混液，并立即进行PCR反应。从PCR仪中取出试管，向每个反应体系中加入4 µL ExoS。然后在37摄氏度下每种反应运行15分钟，接着在80摄氏度下运行15分钟。最后在4摄氏度下保存。接下来，用DNA悬浮缓冲液将样品按1:5比例稀释。样品现已准备好进行定量 PCR 分析。我们目前使用该材料和液体 IMS BIOMARK 系统，结合 48 点 48 或 96 点 96 基因表达芯片。也可采用更传统的 QPCR 格式，如 96 孔和 3 84 孔板。然而，这种孔板格式限制了从单个细胞中可进行的检测数量。该过程采用 Sigma 的 WTA two 试剂盒，能够从细胞沉淀和单个细胞中扩增双链 cDNA。该试剂盒首先裂解单个细胞的细胞膜，随后通过两轮扩增反应对 mRNA 进行扩增。完成文库制备步骤后，将文库样品的五分之一加入70 µL的WTA二轮扩增主混合液中，并按照试剂盒的参数进行25个循环的扩增。接着，使用Kayak快速PCR纯化试剂盒对样品进行纯化，并在Cain's Kayak Cube上进行后续处理。完成后，使用真空浓缩仪将纯化后的样品浓缩至5 µL，并使用WTA二轮试剂盒，按照与前次扩增相同的参数对样品进行额外17个循环的扩增。按照之前的方法纯化样品，并使用NanoDrop分光光度计和Agilent的Bioanalyzer DNA 7500试剂盒检测其质量。现在，使用NimbleGen的一色标记试剂盒对每个扩增细胞样品中的双链cDNA各取两微克进行标记，然后将五微克CY3标记的样品杂交至NimbleGen基因表达芯片。杂交后，洗涤并干燥芯片，以便进行成像。使用Molecular Devices的GenePix 4200扫描仪，将设置校准为100 POW和300至350 PMT。分析基因芯片，然后使用NimbleGen的NimbleScan软件为每个芯片生成配对文件，并继续进行数据分析。灌流成功的 hearts 可获得高比例的健康心肌细胞，这些细胞保持了典型的矩形形态。如果灌流效果不佳，大量细胞将会死亡。通过WTA两轮方法对细胞进行扩增，并对终产物的质量进行了检测。样品在NanoDrop分光光度计读数以及Bioanalyzer芯片的电泳图谱输出中均显示出强烈的扩增信号。总之，大量基因在心肌细胞中表现出稳健的表达。然而，并非所有检测方法都具有相同的可靠性，这一点在此纳米流体 QPCR 数据的部分峰值熔解温度热图中可见。该图中的每一行代表一个单细胞样本在 43 次独立 QPCR 检测中的结果。某些检测结果变异较大，其可靠性可能低于那些具有较高 PCR 特异性的检测。在完成此操作步骤时，重要的是要记住，必须在前期获得高质量的细胞，这将确保后续基因表达谱分析的质量。一旦掌握，单细胞分离操作可在两个半小时内完成，而对这些细胞进行的基因表达谱分析可在两天内完成。

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Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

成年小鼠心肌细胞的单细胞转录谱

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成年小鼠心肌细胞的分离、培养与功能表征

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成年小鼠心肌细胞的分离与培养用于细胞信号转导研究 体外 心脏肥大

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成年小鼠心肌细胞的分离、培养与转导

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出生后心肌细胞细胞周期变异的可视化及核形成确定

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从小鼠心脏前体细胞中分离细胞核用于单细胞分辨率下的表观基因组和基因表达谱分析

原代小鼠心肌细胞培养是研究肌原纤维结构与功能的关键工具之一。以下方案描述了从新生小鼠心脏中分离和培养原代心肌细胞的步骤。所获得的心肌细胞培养物可进一步用于多种生物力学、生物化学及细胞生物学检测。...

新生小鼠心肌细胞的分离与培养

为了研究心肌细胞的收缩功能和钙瞬变，可从野生型和突变型小鼠心脏中分离出单个心肌细胞。这有助于表征由任何原因引起的心功能障碍中细胞功能障碍所起的作用。...

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成年小鼠心肌细胞的单细胞转录谱分析

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