建立爱泼斯坦-巴尔病毒生长转化的淋巴母细胞样细胞系

本实验的总体目标是生成EB病毒永生化的人B淋巴细胞系，即淋巴母细胞样细胞系（LCL）。该过程首先从人外周血中分离单个核细胞。

接下来，在感染 EB 病毒后的三到四天，在 FK506 和免疫抑制剂存在的条件下，用 eps EB 病毒感染细胞，此时会出现一个细胞亚群，其标志为 CD23 高表达、CD58 阳性，并预测将发生 CD23 高表达的增殖。可通过流式细胞术对 CD23 高表达、CD58 阳性细胞进行计数，以预测实验成功结果。增殖的细胞还可通过成功转化的细胞培养物中形成的淋巴母细胞系簇，在显微镜下及肉眼水平进一步识别。

最后一步是扩增淋巴母细胞系以进行冷冻保存。在我的实验室中，我们建立淋巴母细胞系（LCLs）以研究宿主与EB病毒之间的相互作用。淋巴母细胞系在科学界也具有广泛的普遍意义，尤其对病毒学家、免疫学家和癌症生物学家而言。

作为 Macintosh 实验室的一名博士后 O 学者，我将演示建立淋巴母细胞系的操作流程。从供者体内抽取 10 毫升血液后，将含肝素的血液加入一个 50 毫升的锥形管中，然后以 1:2 的比例稀释。向管中加入 20 毫升室温 PBS，随后在稀释后的血液下方轻缓加入 15 毫升 FICO HIA 淋巴细胞分离液，然后在室温下以 225 × g 离心 30 分钟（不使用刹车），以形成密度梯度。

接下来，移除血沉棕黄层，并将其转移至一个新的50毫升锥形管中。用PBS补足体积至50毫升，然后在600 × g离心10分钟，使细胞沉淀。倒掉上清液，将沉淀重新悬浮于50毫升PBS中，再在相同条件下洗涤细胞两次。

现在将细胞重悬于1毫升完全RPMI培养基中。取5微升细胞与台盼蓝按1:10比例稀释，用血细胞计数板计数活细胞，然后用完全RPMI培养基调整体积，使细胞浓度达到每毫升2×10⁶个细胞，并将细胞转移至25平方厘米的组织培养瓶中。

将EB病毒（Epstein-Barr virus）加入含有FK 506的组织培养瓶中，使其终浓度为20 µM，然后将培养瓶置于37°C、5%二氧化碳培养箱中孵育1小时。在细胞即将完成孵育时，迅速解冻一份从B95-8细胞中收获的EB病毒等分试样。随后将培养瓶从培养箱中取出，以1:10的稀释比例将EB病毒加入细胞中，轻轻晃动培养瓶使EB病毒充分混入溶液，然后将瓶盖稍松（若使用非透气型培养瓶）并直立放回培养箱中，继续培养2至3周，之后进行细胞扩增并用于冷冻保存。

EB病毒（Epstein Barr virus）感染一周后，通过光学显微镜可观察到细胞簇，如本图所示的早期显微细胞簇。随着时间推移，显微镜下的细胞簇逐渐增大，最终在培养瓶中肉眼可见团块状结构，如本图所示，可观察到较大的淋巴母细胞样细胞系（LCL）簇。在第12天，为维持细胞生长，应将培养瓶中的支持性培养基体积加倍。当培养基变为黄色时（通常约为每周一次），即需进行换液，以促进细胞扩增，此时应将培养液体积增加两至三倍。

在接下来的几周内，使用完全RPMI培养基将培养物体积扩增至70至100毫升，置于75平方厘米的培养瓶中，以获得可用于冷冻保存的细胞。成功的培养结果可通过CD23阳性及高表达CD58的细胞存在来预测，如该散点图所示：在暴露于EB病毒（Epstein-Barr virus）后的第3至第4天，约有2%至3%的活细胞具有此表型。在暴露于EB病毒后，其他CD23阳性、CD23阴性、CD58阳性及CD58阴性亚群细胞的增殖极为有限；而未感染的细胞或感染了非永生化型EB病毒的细胞则不表现出高表达CD23。

CD58 阳性细胞。也可通过光学显微镜观察这些细胞。如前所述，在感染 Epstein-Barr 病毒一周内，通过光学显微镜即可在培养瓶中观察到成簇的小群细胞。

随着时间推移，细胞逐渐发育为淋巴母细胞样细胞系（LCL），显微镜下的细胞簇会变得越来越大，以至于在培养瓶中可肉眼观察到细胞团块。好了。通过观看本视频，您应已充分了解如何从人血液中分离外周血单个核细胞，以及如何从人B细胞生成EB病毒转化的淋巴母细胞样细胞系，尽管其他实验室也已报道过淋巴母细胞样细胞系的建立方法。

本方案的优势在于，它为研究人员提供了一种方法，可在B细胞感染EB病毒后三到四天内，尽早预测实验是否成功。