Name: 丰富的少突胶质细胞培养和Myelinating产后小鼠组织联合培养的少突胶质细胞/神经元的推导 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-08-21T12:00:00.000+00:00
Duration: 18 min 17 s
Description: 了解从小鼠脑组织中分离和纯化少突胶质细胞前体细胞的方法，并学习建立与背根神经节神经元共培养形成髓鞘化共培养体系的技术。该方案为研究髓鞘形成机制提供可靠模型。

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本项目由加拿大多发性硬化症协会资助，资助对象为 R.K。R.W.O 获得了加拿大多发性硬化症协会的研究生奖学金。S.D.R 获得了加拿大多发性硬化症协会和加拿大卫生研究院的博士后奖学金。

<ol><li>Avellana-Adalid, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expansion+of+rat+oligodendrocyte+progenitors+into+proliferative+%22oligospheres%22+that+retain+differentiation+potential%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Res%22%5BJournal%5D)">Expansion of rat oligodendrocyte progenitors into proliferative "oligospheres" that retain differentiation potential.</a> J Neurosci Res. 45, 558-570 (1996).</li>
<li>McCarthy, K. D., de Vellis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+separate+astroglial+and+oligodendroglial+cell+cultures+from+rat+cerebral+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Preparation of separate astroglial and oligodendroglial cell cultures from rat cerebral tissue.</a> J Cell Biol. 85, 890-902 (1980).</li>
<li>Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+death+and+control+of+cell+survival+in+the+oligodendrocyte+lineage%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cell death and control of cell survival in the oligodendrocyte lineage.</a> Cell. 70, 31-46 (1992).</li>
<li>Chan, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NGF+controls+axonal+receptivity+to+myelination+by+Schwann+cells+or+oligodendrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">NGF controls axonal receptivity to myelination by Schwann cells or oligodendrocytes.</a> Neuron. 43, 183-1891 (2004).</li>
<li>Camara, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrin-mediated+axoglial+interactions+initiate+myelination+in+the+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Integrin-mediated axoglial interactions initiate myelination in the central nervous system.</a> J Cell Biol. 185, 699-712 (2009).</li>
<li>Ishibashi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocytes+promote+myelination+in+response+to+electrical+impulses%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Astrocytes promote myelination in response to electrical impulses.</a> Neuron. 49, 823-832 (2006).</li>
<li>Chen, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+rat+and+mouse+oligodendrocyte+precursor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of rat and mouse oligodendrocyte precursor cells.</a> Nat Protoc. 2, 1044-1051 (2007).</li>
<li>Pedraza, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production%2C+characterization%2C+and+efficient+transfection+of+highly+pure+oligodendrocyte+precursor+cultures+from+mouse+embryonic+neural+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Production, characterization, and efficient transfection of highly pure oligodendrocyte precursor cultures from mouse embryonic neural progenitors.</a> Glia. 56, 1339-1352 (2008).</li>
<li>Lewin, G. R., Ritter, A. M., Mendell, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+role+of+nerve+growth+factor+in+the+development+of+myelinated+nociceptors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">On the role of nerve growth factor in the development of myelinated nociceptors.</a> J Neurosci. 12, 1896-1905 (1992).</li>
<li>Greene, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+in+vitro+studies+on+the+nerve+growth+factor+%28NGF%29+requirement+of+neurons.+II.+Sensory+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Quantitative in vitro studies on the nerve growth factor (NGF) requirement of neurons. II. Sensory neurons.</a> Dev Biol. 58, 106-113 (1977).</li>
</ol>

无利益冲突声明。

本报告描述了一种分离小鼠少突胶质前体细胞（OPC）的方法，可用于在少突胶质细胞富集培养体系或少突胶质细胞/背根神经节神经元（OL/DRGN）共培养体系中进行分化。当单独培养时，OPC可分化为髓鞘碱性蛋白阳性（MBP+ve）的少突胶质细胞，并形成类似髓鞘的膜样结构。当接种至背根神经节神经元（DRGN）的神经突网络上时，少突胶质细胞会以MBP+ve膜结构包绕DRGN的神经突。该模型有助于研究调控少突胶质细胞介导的轴突髓鞘形成的复杂机制。
尽管此类培养体系具有重要价值，但其建立过程在技术上具有较大挑战性。其中关键技术难点主要包括组织消化/解离的效率、培养基pH值的平衡维持以及背根神经节神经元（DRGN）的换液操作。需要注意的是，消化时间的长短、被消化组织的量以及吹打次数均会影响组织解离的效率和最终结果。即使是经验丰富的研究人员，从解离的神经系统组织中获得较低的细胞得率也并不罕见。此外，小鼠少突胶质前体细胞（OPCs）对培养基pH值的变化较为敏感，尤其在碱性条件下更为明显。将培养体系维持在8.5% CO2环境中旨在避免这一问题，因为OPCs似乎更耐受偏酸性而非偏碱性的环境。在DRGN培养过程中，换液操作必须迅速以防止神经元干燥，但同时又必须轻柔，以免破坏正在形成的神经突网络。剧烈的换液操作可能导致神经突网络从基质上脱落，并很可能造成其完全从盖玻片上解离。
该模型系统的潜在优势远超过其技术上的复杂性。该系统的一个优点是利用出生后小鼠进行细胞培养的建立，从而避免了为获取胚胎组织而牺牲繁殖期雌鼠的需要。另一个优点是在少突胶质前体细胞（OPC）扩增过程中无需添加生长因子（GFs）。混合胶质细胞培养提供了一种支持OPC增殖的环境，这可能是由于星形胶质细胞来源的营养因子的存在。其他方法，例如通过神经球进行分离7,8，依赖于生长因子（GFs）的有丝分裂特性，例如碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）、表皮生长因子（EGF）和血小板源性生长因子（PDGF），以促进少突胶质前体细胞（OPC）的扩增。同样，使用出生后（P5-10）小鼠获取背根神经节神经元（DRGNs）可避免在培养基中添加神经生长因子（NGF）——一种支持神经元存活和生长所必需的神经营养因子。 体外 胚胎期背根神经节神经元的存活 9, 10值得注意的是，应避免使用NGF，因为当OL与DRGN共培养时，NGF会负面影响OL的髓鞘形成能力。 4避免使用添加生长因子的培养基还具有经济优势，因为这些试剂在大规模使用时成本较高。
该培养模型最重要的优势或许在于其完全来源于小鼠组织，从而提供了从多种转基因小鼠品系中同时获取少突胶质前体细胞（OPC）和背根神经节神经元（DRGN）的机会。这使得研究人员能够探究调控髓鞘形成的DRGN和/或OPC特异性特性。这对于阐明调控少突胶质细胞介导的轴突髓鞘形成的受体/配体相互作用尤为重要。总体而言，由于该技术可用于研究髓鞘形成背后的分子信号机制，因此在神经科学研究领域具有重要价值。

<table><tbody><tr><td>杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）</td><td>多细胞</td><td>319-005-CL</td><td></td></tr><tr><td>Hank's 平衡盐溶液（HBSS）</td><td>Invitrogen</td><td>14170-112</td><td></td></tr><tr><td>最低必需培养基（MEM）</td><td>GIBCO，Life Technologies 公司旗下品牌</td><td>12360-038</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清（FBS）</td><td>GIBCO，Life Technologies 公司旗下品牌</td><td>10091-148</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素（Pen/Strep）</td><td>GIBCO，Life Technologies 公司旗下品牌</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>Invitrogen</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>聚-L-赖氨酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2636</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白（BSA）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4503</td><td></td></tr><tr><td>人源层粘连蛋白-2（merosin纯化蛋白，LN2）</td><td>EMD Millipore</td><td>CC085</td><td></td></tr><tr><td>重组大鼠睫状神经营养因子（CNTF）</td><td>PeproTech Inc</td><td>450-50</td><td></td></tr><tr><td>L-甲状腺素</td><td>Biochemika</td><td>89430</td><td></td></tr><tr><td>全转铁蛋白</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T0665</td><td></td></tr><tr><td>B27 补充剂</td><td>GIBCO，Life Technologies 公司旗下品牌</td><td>0080085-SA</td><td></td></tr><tr><td>牛胰岛素</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I6634</td><td></td></tr><tr><td>3,3',5-三碘-L-甲状腺原氨酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I6634</td><td></td></tr><tr><td>孕酮</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8783</td><td></td></tr><tr><td>腐胺</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7505</td><td></td></tr><tr><td>亚硒酸钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5261</td><td></td></tr><tr><td>5-氟-2'-脱氧尿苷（FuDR）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F0503</td><td></td></tr><tr><td>木瓜蛋白酶溶液</td><td>沃辛顿生化</td><td>LS003126</td><td></td></tr><tr><td>DNaseI</td><td>罗氏集团</td><td>1010159001</td><td></td></tr><tr><td>L-半胱氨酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7352</td><td></td></tr><tr><td>24孔组织培养板</td><td>Cellstar</td><td>662-160</td><td></td></tr><tr><td>带通气盖的T25组织培养瓶</td><td>康宁</td><td>430639</td><td></td></tr><tr><td>10 cm 组织培养皿</td><td>康宁</td><td>430167</td><td></td></tr><tr><td>10 cm 培养皿</td><td>Fisher Scientific</td><td>0875713</td><td></td></tr><tr><td>胶原酶A</td><td>罗氏集团</td><td>103578</td><td></td></tr><tr><td>CellTrics 50 &amp;mu;m 滤膜（可选）</td><td>PARTEC</td><td>04-004-2327</td><td></td></tr><tr><td>髓鞘碱性蛋白（MBP）抗体</td><td>AbD Serotec</td><td>MCA409S</td><td></td></tr><tr><td>NG2抗体</td><td>EMD Millipore</td><td>AB5320</td><td></td></tr><tr><td>髓鞘相关糖蛋白（MAG）抗体</td><td>EMD Millipore</td><td>MAB1567</td><td></td></tr><tr><td>2',3'-环核苷酸3'-磷酸二酯酶（CNP）抗体</td><td>科文斯</td><td>SMI-91R-100</td><td></td></tr><tr><td>泛肌动蛋白Ab-5抗体 </td><td>Fitzgerald</td><td>10R-A106AX</td><td></td></tr><tr><td>神经丝蛋白-200（NF）抗体</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N4142</td><td></td></tr><tr><td>微管蛋白β-3链（Tuj1）抗体</td><td>EMD Millipore</td><td>MAB5544</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 山羊抗兔 IgG（H+L）二抗</td><td>Invitrogen</td><td>A11008</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 555 山羊抗小鼠 IgG（H+L）二抗</td><td>Invitrogen</td><td>A21422</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 山羊抗大鼠（IgG）（H+L）二抗</td><td>Invitrogen</td><td>A21247</td><td></td></tr><tr><td>辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠IgG（H+L）二抗</td><td>Bio-Rad</td><td>170-6516</td><td></td></tr><tr><td>山羊抗大鼠 IgG（H+L）-HRP 标记二抗</td><td>Santa Cruz Biotechnology, Inc.</td><td>SC-2065</td><td></td></tr><tr><td>4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9542</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;p class=&quot;jove_step&quot;&gt;培养基配方&lt;/p&gt; &lt;p class=&quot;jove_content&quot;&gt;&lt;strong&gt;100X OL-补充剂* &lt;/strong&gt;&lt;/p&gt; &lt;表格 边框=&quot;1&quot;&gt; &lt;tbody&gt; &lt;tr&gt;&lt;td&gt;&lt;strong&gt;成分&lt;/strong&gt;&lt;/td&gt;&lt;td&gt;&lt;strong&gt;添加量&lt;/strong&gt;&lt;/td&gt; &lt;/tr&gt; &lt;tr&gt;&lt;td&gt;DMEM&lt;/td&gt;&lt;td&gt;100 mL&lt;/td&gt; &lt;/tr&gt; &lt;tr&gt;&lt;td&gt;BSA&lt;/td&gt;&lt;td&gt;1.02 g&lt;/td&gt; &lt;/tr&gt; &lt;tr&gt;&lt;td&gt;孕酮&lt;/td&gt;&lt;td&gt;0.6 mg&lt;/td&gt; &lt;/tr&gt; &lt;tr&gt;&lt;td&gt;腐胺&lt;/td&gt;&lt;td&gt;161 mg&lt;/td&gt; &lt;/tr&gt; &lt;tr&gt;&lt;td&gt;亚硒酸钠&lt;/td&gt;&lt;td&gt;0.05 mg&lt;/td&gt; &lt;/tr&gt; &lt;tr&gt;&lt;td&gt;3,3',5-三碘-L-甲状腺原氨酸&lt;/td&gt;&lt;td&gt;4 mg&lt;/td&gt; &lt;/tr&gt; &lt;/tbody&gt; &lt;/table&gt;&lt;p class=&quot;jove_content&quot;&gt;*储存于 -80 &amp;deg;C in 250 &amp;mu;L 等分试样&lt;/p&gt; &lt;p class=&quot;jove_content&quot;&gt;&lt;strong&gt;OL培养基&lt;/strong&gt;&lt;/p&gt;&lt;表格 边框=&quot;1&quot;&gt; &lt;tbody&gt; &lt;tr&gt;&lt;td&gt;&lt;strong&gt;成分&lt;/strong&gt;&lt;/td&gt;&lt;td&gt;&lt;strong&gt;添加量&lt;/strong&gt;&lt;/td&gt; &lt;/tr&gt; &lt;tr&gt;&lt;td&gt;DMEM&lt;/td&gt;&lt;td&gt;23.75 mL&lt;/td&gt; &lt;/tr&gt; &lt;tr&gt;&lt;td&gt;100倍 OL-添加剂&lt;/td&gt;&lt;td&gt;250 &amp;mu;L&lt;/td&gt; &lt;/tr&gt; &lt;tr&gt;&lt;td&gt;牛胰岛素（来自 1 mg/mL 储液）&lt;/td&gt;&lt;td&gt;125 &amp;mu;L&lt;/td&gt; &lt;/tr&gt; &lt;tr&gt;&lt;td&gt;GlutaMAX&lt;/td&gt;&lt;td&gt;250 &amp;mu;L&lt;/td&gt; &lt;/tr&gt; &lt;tr&gt;&lt;td&gt;全转铁蛋白（来自 33 mg/mL 储液）&lt;/td&gt;&lt;td&gt;37.5 &amp;mu;L&lt;/td&gt; &lt;/tr&gt; &lt;tr&gt;&lt;td&gt;B27 补充剂&lt;/td&gt;&lt;td&gt;500 &amp;mu;L&lt;/td&gt; &lt;/tr&gt; &lt;tr&gt;&lt;td&gt;FBS&lt;/td&gt;&lt;td&gt;125 &amp;mu;L&lt;/td&gt; &lt;/tr&gt; &lt;tr&gt;&lt;td&gt;CNTF（来自50 ng/&amp;mu;L 储液&lt;/td&gt;&lt;td&gt;25 &amp;mu;L&lt;/td&gt; &lt;/tr&gt; &lt;/tbody&gt; &lt;/table&gt;&lt;p class=&quot;jove_content&quot;&gt;&lt;strong&gt;混合胶质细胞培养基（用DMEM配制）&lt;/strong&gt;&lt;/p&gt;&lt;表格 边框=&quot;1&quot;&gt; &lt;tbody&gt; &lt;tr&gt;&lt;td&gt;&lt;strong&gt;成分&lt;/strong&gt;&lt;/td&gt;&lt;td&gt;&lt;strong&gt;终浓度 &lt;/strong&gt;&lt;/td&gt; &lt;/tr&gt; &lt;tr&gt;&lt;td&gt;FBS&lt;/td&gt;&lt;td&gt;10%&lt;/td&gt; &lt;/tr&gt; &lt;tr&gt;&lt;td&gt;青霉素/链霉素（来自储备液的0.33%）&lt;/td&gt;&lt;td&gt;33 单位/毫升青霉素和 33 &amp;mu;g/mL 链霉素&lt;/td&gt; &lt;/tr&gt; &lt;tr&gt;&lt;td&gt;GlutaMAX&lt;/td&gt;&lt;td&gt;1%&lt;/td&gt; &lt;/tr&gt; &lt;/tbody&gt; &lt;/table&gt; &lt;p class=&quot;jove_content&quot;&gt;&lt;strong&gt;DRGN 培养基（用 DMEM 配制）&lt;/strong&gt;&lt;/p&gt; &lt;表格 边框=&quot;1&quot;&gt; &lt;tbody&gt; &lt;tr&gt;&lt;td&gt;&lt;strong&gt;成分&lt;/strong&gt;&lt;/td&gt;&lt;td&gt;&lt;strong&gt;终浓度 &lt;/strong&gt;&lt;/td&gt; &lt;/tr&gt; &lt;tr&gt;&lt;td&gt;FBS&lt;/td&gt;&lt;td&gt;10%&lt;/td&gt; &lt;/tr&gt; &lt;tr&gt;&lt;td&gt;青霉素/链霉素（1% 工作浓度，来自储备液）&lt;/td&gt;&lt;td&gt;100 单位/毫升青霉素和 100 &amp;mu;g/mL 链霉素&lt;/td&gt; &lt;/tr&gt; &lt;/tbody&gt; &lt;/table&gt;&lt;p class=&quot;jove_step&quot;&gt;消化液配方：&lt;/p&gt; &lt;p class=&quot;jove_content&quot;&gt;&lt;strong&gt;OPC 木瓜蛋白酶溶液（用 MEM 配制）&lt;/strong&gt;&lt;/p&gt;&lt;表格 边框=&quot;1&quot;&gt; &lt;tbody&gt; &lt;tr&gt;&lt;td&gt;&lt;strong&gt;成分&lt;/strong&gt;&lt;/td&gt;&lt;td&gt;&lt;strong&gt;终浓度 &lt;/strong&gt;&lt;/td&gt; &lt;/tr&gt; &lt;tr&gt;&lt;td&gt;木瓜蛋白酶溶液&lt;/td&gt;&lt;td&gt;1.54 mg/mL&lt;/td&gt; &lt;/tr&gt; &lt;tr&gt;&lt;td&gt;L-半胱氨酸&lt;/td&gt;&lt;td&gt;360 &amp;mu;g/mL&lt;/td&gt; &lt;/tr&gt; &lt;tr&gt;&lt;td&gt;DNaseI&lt;/td&gt;&lt;td&gt;60 &amp;mu;g/mL&lt;/td&gt; &lt;/tr&gt; &lt;/tbody&gt; &lt;/table&gt; &lt;p class=&quot;jove_content&quot;&gt;&lt;strong&gt;DRG 木瓜蛋白酶溶液（用 HBSS 配制）&lt;/strong&gt;&lt;/p&gt; &lt;表格 边框=&quot;1&quot;&gt; &lt;tbody&gt; &lt;tr&gt;&lt;td&gt;&lt;strong&gt;成分&lt;/strong&gt;&lt;/td&gt;&lt;td&gt;&lt;strong&gt;终浓度 &lt;/strong&gt;&lt;/td&gt; &lt;/tr&gt; &lt;tr&gt;&lt;td&gt;木瓜蛋白酶&lt;/td&gt;&lt;td&gt;1.54 mg/mL&lt;/td&gt; &lt;/tr&gt; &lt;tr&gt;&lt;td&gt;L-半胱氨酸&lt;/td&gt;&lt;td&gt;360 &amp;mu;g/mL&lt;/td&gt; &lt;/tr&gt; &lt;/tbody&gt; &lt;/table&gt; &lt;p class=&quot;jove_content&quot;&gt;&lt;strong&gt;DRG 胶原酶 A 溶液（用 HBSS 配制）&lt;/strong&gt;&lt;/p&gt; &lt;表格 边框=&quot;1&quot;&gt; &lt;tbody&gt; &lt;tr&gt;&lt;td&gt;&lt;strong&gt;成分&lt;/strong&gt;&lt;/td&gt;&lt;td&gt;&lt;strong&gt;终浓度 &lt;/strong&gt;&lt;/td&gt; &lt;/tr&gt; &lt;tr&gt;&lt;td&gt;胶原酶A&lt;/td&gt;&lt;td&gt;4 mg/mL&lt;/td&gt; &lt;/tr&gt; &lt;/tbody&gt; &lt;/table&gt;</td></tr></tbody></table>

从出生后小鼠组织中分离富集的少突胶质细胞培养物及少突胶质细胞/神经元髓鞘形成共培养物

Derivation of Enriched Oligodendrocyte Cultures and Oligodendrocyte/Neuron Myelinating Co-cultures from Post-natal Murine Tissues

阐明少突胶质细胞（OL）发育背后的分子机制，不仅对于深化我们对OL生物学的认识至关重要，而且有助于理解多发性硬化症（Multiple Sclerosis, MS）等脱髓鞘疾病的发病机制。细胞发育通常通过原代细胞培养模型进行研究。原代细胞培养通过提供一个可控的环境，排除体内存在的各种干扰变量，从而促进对特定细胞类型的评估 在体内尽管源自大鼠的少突胶质细胞（OL）培养已为OL生物学研究提供了大量见解，但建立小鼠OL培养体系的类似尝试却面临重大障碍。开发培养小鼠原代OL的方法对于充分利用现有的转基因小鼠品系至关重要。 
已报道多种从啮齿类动物组织中提取少突胶质前体细胞（OPC）的方法，包括神经球衍生法、差异贴壁纯化法以及免疫纯化法1-3。尽管许多方法均能取得成功，但大多需要较长的培养周期和/或昂贵的设备与试剂。为克服这些问题，优选采用McCarthy与de Vellis最初描述的方法的改良版，用于从小鼠组织中纯化OPC2。该方法通过物理分离的方式，从新生啮齿类动物大脑皮层来源的混合胶质细胞培养物中分离出OPC。最终获得高纯度的OPC群体，可进一步分化为富含少突胶质细胞（OL）的培养体系。该方法的优势在于培养周期相对较短，且无需添加生长因子或免疫筛选抗体。
尽管在纯化培养体系中研究少突胶质细胞（OL）发育机制具有重要信息价值，但其并不能为评估髓鞘形成提供最具生理相关性的环境。将少突胶质细胞与神经元共培养，有助于揭示调控少突胶质细胞介导的轴突髓鞘化的分子基础。在多数少突胶质细胞/神经元共培养研究中，背根神经节神经元（DRGNs）已被证明是首选的神经元类型。由于其易于提取、污染细胞极少，并能形成密集的神经突网络，因此非常适合与少突胶质细胞进行共培养。尽管已有使用大鼠/小鼠髓鞘化异种共培养体系的研究发表4-6，但尚未有从出生后小鼠组织建立此类少突胶质细胞/DRGN髓鞘化共培养体系的方法报道。本文中，我们详细介绍了有效建立此类共培养体系的方法，并提供了预期结果的示例。这些方法适用于探讨与少突胶质细胞发育及髓鞘化功能相关的问题，是神经科学领域中的有力工具。

本文介绍了在原代培养中获得富集的小鼠少突胶质细胞前体细胞（OPCs）的方法，这些细胞可分化为成熟的少突胶质细胞（OLs）。此外，本文还描述了一种通过将小鼠OPCs接种于小鼠背根神经节神经元（DRGNs）的神经突网络上，以建立小鼠髓鞘形成共培养体系的技术。

揭示少突胶质细胞（OL）发育的分子机制不仅对于深化我们对OL生物学的认识至关重要，而且有助于理解多发性硬化症（Multiple Sclerosis, MS）等脱髓鞘疾病的发病机制。细胞发育通常通过原代细胞培养模型进行研究。原代细胞培养通过提供一个不受体内复杂变量干扰的可控环境，便于对特定细胞类型进行评估。尽管源自大鼠的OL培养体系已为OL生物学研究提供了大量信息，但建立小鼠来源的OL培养体系却面临诸多挑战。开发小鼠原代OL的培养方法至关重要，以便充分利用现有的转基因小鼠品系资源。已有多种从小鼠和大鼠组织中提取少突胶质前体细胞（OPCs）的方法被报道，包括神经球培养、差速贴壁纯化和免疫纯化等1-3。尽管这些方法在一定程度上均能成功，但大多数需要较长的培养周期和/或昂贵的设备与试剂。为克服这些问题，优选采用McCarthy与de Vellis最初描述方法的改良版来从小鼠组织中纯化OPCs2。该方法通过物理分离的方式，从新生啮齿类动物大脑皮层来源的混合胶质细胞培养物中分离出OPCs。最终获得的高纯度OPC群体可进一步分化为富含OL的培养体系。该方法的优势在于培养周期相对较短，且无需添加生长因子或免疫筛选抗体。尽管在纯化的培养体系中研究OL发育机制具有重要价值，但其并不能为髓鞘形成过程提供最接近生理状态的环境。将OL与神经元共培养，有助于揭示OL介导轴突髓鞘化过程中的分子调控机制。在众多OL/神经元共培养研究中，背根神经节神经元（DRGNs）已被证明是首选的神经元类型。其优势在于易于分离、污染细胞少，并能形成密集的神经突网络。尽管已有使用大鼠/小鼠髓鞘化异种共培养体系的研究发表4-6，但目前尚未见从小鼠出生后组织建立OL/DRGN髓鞘化共培养体系的方法报道。本文将详细介绍如何有效建立此类共培养体系，并提供预期结果的示例。这些方法适用于探究与OL发育及髓鞘化功能相关的问题，是神经科学领域的重要研究工具。

大家好，我是来自渥太华大学和渥太华医院研究所的博士生 Ryan O'Mara。本实验方案将介绍如何从小鼠中获得富集的少突胶质前体细胞群体，这些细胞可单独培养分化，也可与小鼠背根神经节神经元共培养，以建立可形成髓鞘的体外培养体系。接下来，让我们简要概述一下实验流程。将新生小鼠脑组织解离后接种至T 25培养瓶中。经过9天培养后，在培养瓶底部形成一层星形胶质细胞，其上少突胶质前体细胞正在增殖。随后可获取并纯化少突胶质前体细胞，并在富集培养条件下进一步分化为成熟的少突胶质细胞。如果需要建立髓鞘化共培养体系，可将出生后5至10天小鼠的背根神经节神经元与混合胶质细胞共同培养。在9天的培养期间，这些神经元会形成致密的神经突网络，可供少突胶质前体细胞接种生长。这使得少突胶质细胞能够包裹神经突，从而形成可髓鞘化的低温培养体系。首先，将出生后第0至第2天小鼠的完整脑组织置于冰冻的MEM培养基中，并用手术刀在解剖显微镜下沿每个大脑皮层的纵向切开脑膜层，然后将脑膜从下方的皮层上剥离。接下来，在脑腹面朝上的情况下，移除嗅球。在大脑皮层与腹侧头端交界处做深部纵向切口。将脑组织背侧朝上，撬下皮层，然后将每个心状体（cordis）切成约四小块。将皮层组织转移至含有每脑350微升冰上预冷的MEM的15毫升锥形管中。将相同基因型的脑组织置于同一管中，因此四个脑组织需要1400微升MEM。解剖完成后，将合并的脑组织放入37摄氏度水浴中孵育三分钟。接着，在无菌细胞培养操作台中，用P1000移液器枪头反复吹打脑组织，使其分散成更小的碎片。向锥形管中加入每脑75微升预热的OPC Pap痛解离液。然后在37摄氏度水浴中孵育20分钟，每隔2分钟颠倒混匀一次，以防止组织聚集。孵育完成后，向每份脑组织消化液中加入2毫升混合胶质细胞培养基，静置10分钟。10分钟后，将组织悬液分装至5毫升塑料离心管中。试管的数量应与制备过程中脑组织的数量相匹配。使用火焰抛光的玻璃巴斯德移液管，先缓慢吹打每支试管中的内容物，随后随着组织块开始解离，逐渐加大吹打力度。当悬浮液中不再有可见的组织碎片时，停止吹打。将每支试管中的内容物合并至一个含有4毫升混合胶质细胞培养液的50毫升锥形管中。轻轻翻转试管数次使液体混合均匀后，将细胞悬液分装至15毫升锥形管中。分装管数应与制备的脑组织数量一致。在300 × g条件下离心5分钟，弃上清，将沉淀物重悬于1毫升混合胶质细胞培养基中。将每根锥形管中重悬的细胞加入预先用5毫升混合胶质细胞培养基平衡过的、经多聚-L-赖氨酸包被的T25培养瓶中。培养瓶的数量应与解剖的脑组织数量相等，将培养瓶置于37摄氏度、8.5% CO2的培养箱中孵育。孵育3至4小时后，细胞应已贴附于基质上。然而，培养基中仍会存在大量碎片，可能对细胞活力产生不利影响。为避免此情况，应每隔三到四小时更换一次培养基，替换为新鲜的混合胶质细胞培养基。这种换液操作可去除大部分细胞碎片。第二天。培养瓶底部应可见大量细胞。第三天时，培养瓶底部应开始形成星形胶质细胞单层。此时，进行三分之二的培养基更换，移除四毫升培养基，并加入四毫升新鲜培养基。此步骤应每隔三天重复一次。第六天时，应能清晰观察到星形胶质细胞单层，其上少突胶质前体细胞正在增殖。此时，在第九天向培养基中添加胰岛素，使其终浓度为每毫升5微克，此时少突胶质前体细胞已准备好从星形胶质细胞单层中分离。为此，将培养瓶置于摇床和含5% CO2的培养箱中。让培养瓶在培养箱中平衡一小时。随后以50 RPM的速度振荡细胞45分钟。此步骤可去除大量松散附着的污染细胞。通过移除全部培养基并加入四毫升新鲜培养基，进行完全换液。将培养瓶放回5%CO2培养箱中，平衡三小时。三小时时检查培养基的颜色。培养基应呈红色，表明pH值平衡。如果颜色偏橙色或紫色，应相应调整培养箱的CO2浓度。在过夜振荡过程中，维持平衡的pH值对于少突胶质前体细胞的存活至关重要。一旦达到平衡的pH值，将锥形瓶以220 RPM的速度振荡约16小时。次日早晨，从振荡器上取下锥形瓶，并将培养基从锥形瓶转移至10厘米的组织培养皿中。这些培养皿将用于通过差异贴壁进一步纯化少突胶质前体细胞。每个培养皿应加入来自两个培养瓶的培养基，在5% CO2条件下孵育30分钟。在孵育15分钟时，轻轻摇动每个培养皿，以防止少突胶质前体细胞贴附于塑料表面。30分钟孵育后，在相差显微镜下观察培养皿。少突胶质细胞前体细胞表现为小的细胞团块，其中部分细胞可能已贴附于培养皿上。通过轻柔振荡使贴壁的少突胶质前体细胞从培养皿上松脱。注意操作轻柔。过度振荡可能导致污染的其他细胞类型脱落。将细胞悬液转移至15毫升锥形管中，在300 × g条件下离心5分钟。使用P1000移液器枪头轻轻重悬沉淀，随后使用P200移液器枪头通过血细胞计数板对细胞进行计数。纯化的少突胶质细胞可在第1天接种于层粘连蛋白包被的盖玻片上，以诱导分化为富集的少突胶质细胞培养物。接种后，富集的少突胶质细胞前体细胞具有相对简单的形态，仅延伸出少量突起。到第3天，正在分化的少突胶质细胞已延伸出大量突起，类似于未成熟少突胶质细胞。到第6天，少突胶质细胞在任何时间点均可延伸出类似髓鞘的膜样结构。可将培养皿盖玻片固定并进行免疫细胞化学处理。纯化的少突胶质细胞前体细胞可不接种于铺有层粘连蛋白的盖玻片上，而接种于背根神经节神经突床上，以建立可形成髓鞘的共培养体系。下一节将介绍此类培养体系的制备方法。首先，从出生后5至10天的小鼠中分离完整的脊柱，并将其转移至解剖显微镜下，使用解剖剪进行操作。沿脊柱腹侧中线纵向剪开。用尖端精细的镊子小心地逐步去除背根神经节（DRGs）。将神经节转移至培养皿中的Hank's平衡盐溶液中。修剪背根神经节过长的神经根。使用P 1000宽口吸头。将神经节转移至一个1.5毫升离心管中。在所有小鼠处理完毕前，将离心管置于冰上保存。背根神经节（DRG）分离完成后，以约300 × g离心该离心管。将离心管转移至无菌细胞培养操作台，移除上清液。向离心管中加入500 µL预热的DRG木瓜蛋白酶溶液，在37°C水浴中孵育10分钟。木瓜蛋白酶消化完成后进行离心，随后更换木瓜蛋白酶溶液。加入500 µL预热的胶原酶A溶液，于37°C孵育10分钟。重复离心步骤，并将胶原酶A溶液替换为1 mL DRGN培养基。完成最后一次离心后，加入1 mL DRGN培养基，并使用火焰抛光的玻璃巴斯德吸管轻柔吹打悬浮细胞。首先缓慢吹打神经节，随后随着组织开始解离，逐渐增加吹打强度。当肉眼观察不到组织块时，将细胞悬液转移至含有7 mL DRGN培养基的培养皿中。将培养皿置于37°C、8.5% CO₂的培养箱中孵育1.25小时。孵育结束后，观察培养皿。在相差显微镜下，背根神经节（DRG）神经元表现为胞体较大的细胞。许多污染细胞应已牢固地贴附在培养皿上。将培养基转移至15毫升锥形管中，并用4毫升DRGN培养基冲洗培养皿，以收集残留的神经元。在300 × g下离心5分钟。将所得沉淀重悬于500微升DRGN培养基中。使用HEO细胞计数器对细胞进行计数。务必仅计数DRG神经元，并将每毫升DRGN培养基中30,000至50,000个神经元接种到12毫米的层粘连蛋白包被的盖玻片上。将细胞置于含8.5% CO2的组织培养孵箱中培养。次日早晨，通过将 DRGN 培养基更换为添加了 10 µM FUDR 的 OL 培养基进行完全换液，此后每两天更换一次。此后，使用添加 FUDR 的 OL 培养基进行四分之三换液。在第 1 天用相差显微镜观察时，神经元已开始延伸出少量突起；到第 3 天，神经元突起已明显延长。在第6天，已形成由大量相互交织的突起构成的神经突网络。到第9天，该神经突网络密度进一步增加，已准备好接受来自生长中的混合脑培养物的少突胶质细胞。与此同时，在神经元培养的第9天，可对少突胶质前体细胞进行纯化。随后可将细胞接种至神经突床中，每孔加入 50,000 个细胞至 24 孔板的每个孔内。在共培养第 6 天，可见类似少突胶质细胞的细胞与背根神经节神经元发生相互作用。现在可以对这些培养物进行固定并进行免疫细胞化学处理。当富集的少突胶质细胞培养物用针对少突胶质细胞标志物 NG2 和 MAG 的抗体标记时，可观察到免疫阳性细胞呈现出阶段特异性的形态。这些培养物最初由 NG2 阳性的少突胶质细胞前体细胞群体组成，在六天的分化过程中，逐渐产生 MAG 阳性的成熟少突胶质细胞。对少突胶质细胞富集培养物获得的裂解液进行SDS-PAGE时，可见少突胶质细胞在六天的时间过程中表达CNPP和MVP。在添加少突胶质细胞之前观察背根神经节（DRG）神经元时，第9天可见密集的Tau-1阳性及神经丝蛋白阳性神经突网络。在少突胶质细胞与DRG神经元共培养的第6天，高倍镜下可见大量MBP阳性少突胶质细胞与神经元的神经突发生相互作用。少突胶质细胞被观察到以 MBP 阳性膜包裹这些神经突，类似于髓鞘形成过程；数字放大图像显示了 MVP 阳性膜与神经丝蛋白阳性突起之间的重叠程度。大家好，我是 Scott Ryan，来自渥太华医院研究所的博士后研究员。这些技术提供了一种从小鼠中建立少突胶质细胞、星形胶质细胞和背根神经节神经元共培养系统的方法。该技术在研究实验性诱导的和转基因的髓鞘形成疾病模型方面具有重要价值，同时也适用于筛选新的治疗化合物。

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Research

科研

JoVE Journal

Neuroscience

神经科学

丰富的少突胶质细胞培养和Myelinating产后小鼠组织联合培养的少突胶质细胞/神经元的推导

本方案概述了从胎儿脊髓中分离胶质限制性前体细胞，并在体外进行培养，用于移植或少突胶质细胞谱系研究。...

从小鼠E13胚胎中分离少突胶质细胞限制性前体细胞

原代人胎儿脑来源的多能性前体细胞增殖 体外...

人胎儿脑来源的前体细胞衍生少突胶质细胞培养体系

本视频演示了从成年小鼠脑组织中分离侧脑室壁并进行酶解组织解离以获得单细胞的详细实验方案。随后，这些细胞在特定培养条件下进行培养，可选择性地促进神经干细胞的增殖，并诱导其分化为少突胶质细胞与星形胶质细胞的共培养体系。...

从成年小鼠神经干细胞获得少突胶质细胞与星形胶质细胞混合培养物

本视频展示了如何从人类胚胎干细胞生成少突胶质细胞前体细胞（OPCs），随后将OPCs成熟为少突胶质细胞。该少突胶质细胞生成过程为改善包括阿尔茨海默病在内的神经退行性疾病的研究与治疗开辟了众多途径。...

将人类胚胎干细胞分化为少突胶质细胞

本视频展示了人源诱导神经元（iNs）与诱导少突胶质前体细胞（iOPCs）共培养体系的建立。将iNs与iOPCs混合后进行共培养，并孵育以促进iNs向神经元、iOPCs向少突胶质细胞的成熟。神经元与其他神经元及少突胶质细胞形成突触连接，而少突胶质细胞则在神经元轴突周围发育出髓鞘结构。...

一种用于模拟神经元-少突胶质细胞相互作用的共培养方法

该视频展示了一种将少突胶质前体细胞（OPCs）分化为少突胶质细胞，并在与背根神经节（DRG）神经元共培养体系中诱导髓鞘形成的实验方案。OPCs通过编码调控髓鞘形成的信号蛋白的慢病毒载体进行转导。转导后的OPCs与DRG神经元共培养，以评估其向少突胶质细胞的分化情况以及信号蛋白诱导的髓鞘形成能力。...

少突胶质前体细胞体外转导诱导髓鞘化检测方法

少突胶质细胞是中枢神经系统的髓鞘形成细胞。本方案描述了一种从大鼠大脑皮层分离和培养其前体细胞——少突胶质前体细胞的方法，以及一种快速、可靠的定量评估少突胶质细胞生成的方法 体外...

大鼠少突胶质细胞前体培养物的制备及利用双红外荧光扫描定量少突胶质生成

我们描述了原代小鼠少突胶质细胞的免疫磁珠分离方法，该方法可快速、特异性地分离出细胞用于 体外...

小鼠原代少突胶质细胞的快速特异性免疫磁珠分离

本文展示了一种高效纯化少突胶质细胞并制备少突胶质细胞条件培养基的方法，该培养基可用于共培养实验。...

少突胶质细胞的生成及其条件培养基的制备用于共培养实验

由于缺乏足够的工具和方法，神经退行性疾病中神经元与胶质细胞之间的相互作用尚未被充分理解。在此，我们描述了从人多能干细胞获得诱导神经元、少突胶质前体细胞以及少突胶质细胞的优化方案，并举例说明这些方法在理解阿尔茨海默病中细胞类型特异性贡献方面的应用价值。...

由多能干细胞生成人神经元和少突胶质细胞以模拟神经元-少突胶质细胞相互作用

多能干细胞, 神经元, 少突胶质细胞, 细胞分化, 神经发育, 共培养, 神经退行性疾病, 人源细胞模型, 髓鞘形成, 神经胶质生物学

我们描述了由胎儿或成体神经干细胞分化而来的星形胶质细胞与少突胶质前体细胞的混合培养体系，以及体外模拟有害刺激的方法。结合基于细胞的高内涵筛选技术，可构建一个可靠且稳健的药物筛选系统。...

高内涵筛选分析胎儿与成体神经干细胞来源的少突胶质前体细胞培养物的分化与成熟

了解从小鼠脑组织中分离和纯化少突胶质细胞前体细胞的方法，并学习建立与背根神经节神经元共培养形成髓鞘化共培养体系的技术。该方案为研究髓鞘形成机制提供可靠模型。

从出生后小鼠组织中分离富集的少突胶质细胞培养物及少突胶质细胞/神经元髓鞘形成共培养物

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