利用基于降解决定子（dgn）不稳定的绿色荧光蛋白（GFP）报告蛋白在活细胞中监测泛素-蛋白酶体活性

本实验的总体目标是利用GFP-Dron融合蛋白在活细胞中检测蛋白酶体活性。首先，针对Dron及其移码突变体设计并克隆定制的寡核苷酸片段，将其插入pE-GFP-C1载体中，并按照Invitrogen Gateway系统的操作流程进行后续实验。随后，利用HEK 293FT细胞为每种构建体产生相应的慢病毒。在测定病毒滴度后，用病毒感染目标细胞并施加抗生素筛选，最终扩增获得稳定表达GFP-Dron或GFP-Dron移码突变体的细胞系。

该技术通过荧光信号检测，有助于开展监测细胞对特定处理反应的实验。例如，可轻松利用落射荧光显微镜或流式细胞术评估蛋白酶体活性。与使用全细胞酸性物质的传统方法（如化学发光或荧光生成检测法）相比，该技术的主要优势在于可在活细胞中直接测量蛋白酶体活性。进行转染时，将36 µL Lipofectamine 2000试剂溶于1.5 mL DMEM培养基中；另取一个15 mL Falcon离心管，将DNA质粒构建物溶于1.5 mL DMEM培养基中。

五分钟后，将两者混合并在室温下孵育20分钟。现在，将T75培养瓶中汇合的HEK 293 FT细胞的培养基更换为7毫升DMEM。然后将DNA-脂质体混合物加入培养瓶中，通过前后轻轻摇动混匀。

在37摄氏度、5% CO2培养箱中过夜孵育培养瓶。次日，更换为10毫升DMEM培养基。48小时后，收集上清液，将含有病毒的上清液通过0.45微米PVDF滤膜过滤。

为浓缩病毒，将一体积的 PEG 溶液加入四体积的上清液中，于 4°C 条件下孵育两小时，期间定期通过倒置混匀。吸取上清液后，收集白色沉淀物，再次离心以去除残留的 PEG 溶液，从而收获病毒。将最终沉淀物用 PBS 重悬，用移液器吹打混匀，然后剧烈涡旋 20 至 30 秒。

将病毒以100微升分装，于-80摄氏度保存。在6孔板中接种U2 OS细胞，过夜培养。转染时，将培养基更换为含8微克/毫升Polybrain的1毫升DMEM。留出一孔作为阳性对照，其余各孔测试一系列病毒浓度。

次日继续孵育过夜。将培养基更换为2 mL DMEM，孵育24小时。使用10 µg/mL博来霉素开始筛选，并每隔两天继续更换含抗生素的培养基。

大约六到七天后，检测未转导细胞的死亡情况。然后用 PBS 洗涤细胞三次，以进行染色。加入结晶紫覆盖细胞，室温孵育 5 到 10 分钟，随后吸除染料，用双蒸水冲洗细胞 2 次，并将培养板自然晾干。

最后，计数菌落以计算每毫升病毒的转染单位。在六孔板中接种人二倍体成纤维细胞，每毫升加入八微克聚溴化物作为转导增强剂。

以总容量为一毫升、感染复数为二进行操作。更换培养基。在培养细胞达到70%至80%融合度的次日进行。

从每毫升10微克开始进行慢性筛选。在数天内持续观察，直至细胞死亡现象完成，表明筛选已结束。扩增稳定转导的细胞，以建立稳定表达GFP DERON或GFP Deron移码融合蛋白的细胞系。于次日，在处理前3小时，开始接种携带GFP DRON或GFP DRON移码突变的细胞。

用蛋白酶体抑制剂处理对照细胞。用 PBS 洗涤两次，并使用 0.5 毫升胰蛋白酶消化收集细胞。终止胰蛋白酶反应。

使用 4.5 毫升培养基，将细胞转移至 15 毫升 Falcon 管中。离心收集细胞，用 PBS 洗涤一次后，将沉淀重悬于 400 微升 fax 缓冲液中。将细胞转移至 fax 管中，置于冰上。

现在通过流式细胞术检测样品。GFP Deron 融合蛋白携带一段可被靶向输送至蛋白酶体并立即降解的序列。相比之下，移码突变体 GFP Deron FS 不会被蛋白酶体降解。

因此，当年轻的人类定植成纤维细胞（预期具有较高的蛋白酶体活性）被GFP Dron转导后，在落射荧光下显示出较低的荧光信号。而被GFP Dron移码突变体转导的相同细胞中，阳性细胞比例为39.7%。用蛋白酶体抑制剂ll和L处理细胞后，GFP Dron和GFP Dron移码突变体细胞的信号均增加，最高分别达到约63%。

从年轻、中年和老年供者分离的皮肤成纤维细胞中进行的类似测量显示，年轻个体与中年供者之间GFP信号显著增加，表明来自老年供者的样本中蛋白酶体活性下降。观看本视频后，您应能够充分理解如何制备慢病毒颗粒、转染细胞，以及如何测定活细胞中的蛋白酶体活性。