Name: 构建一个低预算的激光干切断系统研究轴突再生 C。线虫 /em (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-11-15T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 5 s
Description: 了解如何组装低成本激光消融系统以研究C. elegans轴突再生。该方法通过精确对准激光束实现微创切割，为神经科学研究提供经济高效的实验工具。

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本研究由美国国家科学基金会、麦克奈特神经科学捐赠基金、克里斯托弗和戴娜·里夫基金会以及阿梅里塞慈善基金会资助。

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</ol>

未声明任何利益冲突。

已有若干文献对使用不同激光系统进行激光显微手术进行了良好论述3,5-11。飞秒红外激光是亚细胞水平激光消融的“金标准”12，若与成像设备联用则尤为便利，但其成本通常过高，不适合个人用户。如果由于成像深度要求而需要使用飞秒红外激光对样品进行成像，则进行激光轴突切断术时可能也需要该设备。对于透明组织，若目标轴突位于表面下30-50 µm范围内，使用蓝光和绿光脉冲激光（能量约20 µJ/脉冲），并通过高数值孔径的浸液物镜聚焦，通常可实现有效切割。与飞秒激光相比，纳秒和皮秒激光造成的旁侧损伤更大，尤其当目标轴突深度增加时更为明显。C. elegans具有透明性，所有轴突均位于表面下20-30 µm范围内。我们常规切割距离表面5 µm以内的运动神经轴突，也已轻松完成位于神经环内、距角质层表面约20 µm的轴突切割。我们发现，在成年线虫体径范围内，轴突切割的深度极限约为30-50 µm。可以预期，本文所述的激光消融系统适用于多种满足透明性和目标轴突深度要求的样品制备。然而，尽管飞秒红外激光在理论上具有优势，纳秒和皮秒波长为355 nm和532 nm的激光在C. elegans中的轴突切断效果却同样出色，这一点仍略显意外6,13。我们未观察到使用纳秒440 nm、纳秒532 nm或飞秒红外激光进行激光轴突切断后，在轴突再生反应方面存在任何差异。
固态355 nm紫外激光器的成本与532 nm半导体泵浦被动调Q固态激光器大致相同，但需要更高的功率或能够高效透过更短波长的光学元件。大多数光学元件的设计旨在对可见光范围（400–700 nm）的光实现良好性能。355 nm激光器具有一些优势6，例如降低等离子体阈值、实现更小的光斑尺寸，并且长通二向色镜可高效地将全部消融激光导向目标，同时允许在不损失样品信号的前提下同步成像GFP。蓝光440 nm激光器则保留了使用可见光激光器的优势（与标准光学元件兼容性好且更安全）。然而，目前同等功率下，DPP调Q固态440 nm激光器的成本是355 nm或532 nm激光器的三倍。如果我们正在为C. elegans设计一套新系统（其目标深度极小），我们将选择紫外透射镜头（在355 nm处透光率为50–70%的40X 1.3na油镜，成本约3000美元）以及输出为5–10 µJ/脉冲、重复频率1–20 kHz的355 nm激光器。
轴突消融被认为是由等离子体形成所致。更短的脉冲可在较低功率下产生等离子体阈值，且等离子体体积更小6。目标是通过将脉冲能量调节至最低功率，产生体积最小且持续时间最短的等离子体。较大且持续时间较长的等离子体会生成空化气泡，从而损伤周围细胞。我们通常发现，以最高频率（即 2.5 kHz）使用约 50–100 次脉冲进行消融可获得最佳效果。这表明，通过一系列脉冲可逐步累积损伤，从而更精确地控制损伤范围。如果激光光束准直和扩束准确，此处描述的激光消融系统具有较高的容错性。我们在成年线虫中进行轴突切割时，起始激光功率为 10%（在 2500 Hz 下测得平均功率为 0.3 mW，估计单脉冲能量为 1 uJ），在不超过 14% 功率的情况下即可实现局限性损伤较小的切割。在 15–39% 激光功率下可观察到更大范围的损伤，但只有当功率超过 40%（在 2500 Hz 下测得平均功率约为 1 mW）时，线虫才会因产生大型空化气泡及角质层损伤而发生爆裂。
Steinmeyer 等人于2010年发表的论文2是构建激光消融系统的优秀参考资料。Leon Avery 也提供了一个基于低成本氮气337 nm激光器的激光消融系统的实用描述，并给出了许多实用建议（elegans.swmed.edu/Worm_labs/Avery/）。在设计您自己的系统时，应首先与显微镜供应商代表沟通，以确定如何将消融激光引导至显微镜物镜。您的显微镜应安装在隔振平台上（如 Newport、TMI 或 Thor 品牌）。带光具座顶板的平台最为理想，但坚固的钢制顶板也可配合磁性定位器使用。在直立式显微镜上配备专用的中间模块较为理想，因为所有光学元件均可保持固定位置。然而，使用相机端口（倒置显微镜）或连接到落射荧光端口的“合束器”可能更经济且方便。您需要了解拟使用物镜的后孔径尺寸及其在消融激光波长下的透射率。选定激光器（例如 Crylas、TEEM、Crystal 或 CRC）后，应联系 Thor 或 Newport 公司，以获取有关选择合适光学元件、硬件及安全设备的帮助。我们选择采用双伽利略式光束扩束器以节省空间，但也可选用更简单的开普勒式扩束器（f2/f1 = 扩束倍率）。定制的光束扩束器成本最低，但 Newport、Thor 以及多家激光器制造商也提供高质量的商用光束扩束器。一些激光器制造商还提供手动或电子控制的衰减器，可能更具成本效益并节省空间，但其灵活性不如格兰-汤普森偏振器和半波片。您还需确定如何控制激光器。可设计基于 LabView 的控制器，使用商用 TTL 信号发生器，或采用激光器公司提供的软件。请与具体的激光器制造商讨论各种选项。
我们提供的硬件列表仅作为一般性参考。该系统在添加到我们现有的成像系统时，成本约为15,000美元。您所在机构的物理系通常会有人员愿意提供有关安全操作自由光束激光器的实践指导。
最近已有关于C. elegans固定和延时成像的替代方法的描述。14
故障排除
最难且最关键的一步是将居中扩束后的光束与显微镜的光轴对齐。在通过伽利略式扩束透镜实现光束居中和扩束后，应尽量在使用转向镜进行最终中心对准时，先将光束对准至显微镜光轴5 µm以内。过度依赖转向镜来对准光束会导致光束在扩束系统中偏离轴线。务必格外小心，可使用合适的中性密度（ND）滤光片衰减激光束，并直接在反射靶（前表面反射镜）上观察激光束的光斑轮廓。可轻微移动显微镜，以精确地将光束中心置于60倍物镜的视场中央（若上下方向无法居中，则需调节导轨高度）。利用光束轮廓可精确对齐显微镜光轴，使光束居中、呈圆形且“发散”对称。若发散不对称，表明显微镜光轴未完全对准（或导轨不水平）。最后，调节透镜L3，观察光束是否均匀且对称地扩展和收缩。将显微镜精确聚焦于靶表面，再调节L3使激光束聚焦至最小光斑。此时通过激光扫描共聚焦显微镜（LSCM）或CCD系统成像，应可发现激光束位于中心5 µm范围内，且消融光斑的Z轴聚焦位置偏差在1 µm以内。
如果你发现线虫总是被“炸开”，或持续产生较大的空化气泡来切断轴突，问题很可能出在消融激光的精细校准上。请确保消融光斑最小（&lt;500 nm）时位于Z轴焦平面内（通过L3透镜调节会聚），并准确对准XY方向的参考标记点（通过最后一个运动学安装的反射镜进行调节）。
靶向更靠近表面的轴突所需的激光功率较低。同样，与在成年个体中靶向相同轴突相比，对较小的动物（L1和L2阶段）进行轴突切断所需的激光功率也较低。
如果野生型轴突未发生再生或轴突出现漂白现象，应尝试降低成像激光功率或减少采样频率。如果线虫死亡或状态不佳，请以1%为梯度逐步降低琼脂糖的浓度。在固定线虫后，请确保不再移动盖玻片，因为在使用高浓度琼脂糖和微球时，移动盖玻片常会导致线虫死亡。
如果蠕虫在延时成像过程中发生破裂或死亡，原因可能是：1. 琼脂糖浓度过高。2. 消融激光对角质层造成损伤。3. 封片后盖玻片发生移动。如果问题是由于角质层受损所致，则仅会影响经消融激光照射过的已封片蠕虫。
如果线虫在延时成像过程中活动过多，可尝试以0.5%为梯度逐步增加琼脂糖的浓度。健康线虫中的健康轴突始终处于“活跃”状态，并表现出稳定的荧光水平。若观察到荧光信号或活动性突然下降，则表明线虫正在死亡或已经死亡。出现多个串珠状或断裂的轴突是线虫即将死亡或已死亡的明确征象。
如果在整段时间序列成像过程中难以使轴突始终保持在焦平面内，可能存在多种不同问题。首先，可通过在玻璃载玻片上对惰性样品进行持续10小时的成像来检查载物台的漂移情况。数微米的漂移可能源于热不稳定，但超过5 µm的漂移通常与显微镜的机械问题有关。更常见的问题是样品安装不当。在开始时间序列成像前，应让已安装的线虫在显微镜载物台上平衡30分钟。检查您的凡士林密封在成像过程中是否出现泄漏。

<table><tbody><tr><td>试剂名称</td><td>公司</td><td>目录编号</td><td>备注（可选）</td></tr><tr><td>535 nm 激光器</td><td>Crylas</td><td>FDSS532Q3</td><td>（TEEM、Crystal 和 CRC 也提供可比激光器）</td></tr><tr><td>所有光学元件和硬件</td><td></td><td></td><td>（Thor 提供可比的光学元件和硬件）</td></tr><tr><td>SUPREMA 光学支架，1.0 英寸直径</td><td>Newport Corp.</td><td>SS100-F2KN</td><td>2</td></tr><tr><td>1&quot; 直径立柱，1&quot; 高度</td><td>Newport Corp.</td><td>PS-1</td><td>1</td></tr><tr><td>1&quot; 直径立柱叉</td><td>Newport Corp.</td><td>PS-F</td><td>1</td></tr><tr><td>消色差零级波片，&amp;frac12; 波延迟，400–700 nm</td><td>Newport Corp.</td><td>10RP52-1</td><td>1</td></tr><tr><td>旋转台，1&quot; 孔径</td><td>Newport Corp.</td><td>RSP-1T</td><td>1</td></tr><tr><td>1&quot; 直径立柱，1&quot; 高度</td><td>Newport Corp.</td><td>PS-1</td><td>1</td></tr><tr><td>1&quot; 直径立柱叉</td><td>Newport Corp.</td><td>PS-F</td><td>1</td></tr><tr><td>Glan-激光方解石偏振器，430–700 nm</td><td>Newport Corp.</td><td>10GL08AR.14</td><td>1</td></tr><tr><td>偏振器旋转支架</td><td>Newport Corp.</td><td>RM25A</td><td>1</td></tr><tr><td>&amp;#188;&quot; 间隔件，用于 1&quot; 直径立柱</td><td>Newport Corp.</td><td>PS-0.25</td><td>1</td></tr><tr><td>&amp;frac12;&quot; 高度，1&quot; 直径立柱</td><td>Newport Corp.</td><td>PS-0.5</td><td>1</td></tr><tr><td>叉式接头，1&quot; 直径立柱</td><td>Newport Corp.</td><td>PS-F</td><td>1</td></tr><tr><td>光束吸收器</td><td>Newport Corp.</td><td>PL15</td><td>1</td></tr><tr><td>显微镜物镜支架</td><td>Newport Corp.</td><td>LH-OBJ1</td><td>1</td></tr><tr><td>1&quot; 直径立柱，1&quot; 高度</td><td>Newport Corp.</td><td>PS-1</td><td>1</td></tr><tr><td>1&quot; 直径立柱叉</td><td>Newport Corp.</td><td>PS-F</td><td>1</td></tr><tr><td>高能量 Nd:YAG 激光反射镜，25.4 mm 直径，45&amp;#x00B0;，532 nm</td><td>Newport Corp.</td><td>10Q20HE.2</td><td>4</td></tr><tr><td>SUPREMA 光学支架，1.0 英寸直径，通孔安装</td><td>Newport Corp.</td><td>SN100C-F</td><td>2</td></tr><tr><td>高精度旋钮调节螺钉，12.7 mm 行程，100 TPI</td><td>Newport Corp.</td><td>AJS100-0.5K</td><td>4</td></tr><tr><td>螺纹适配器，&amp;#188;-20 外螺纹，8-32 内螺纹</td><td>Newport Corp.</td><td>SS-1-B</td><td>2</td></tr><tr><td>1.5 英寸直径杆用夹具</td><td>Newport Corp.</td><td>340-RC</td><td>2</td></tr><tr><td>杆，14 英寸（35.5 cm）高</td><td>Newport Corp.</td><td>40</td><td>1</td></tr><tr><td>X26 用导轨滑座，方形，40 mm 长</td><td>Newport Corp.</td><td>CN26-40</td><td>4</td></tr><tr><td>钢制导轨，384 mm（15&quot;）长</td><td>Newport Corp.</td><td>X26-384</td><td>1</td></tr><tr><td>1.5 英寸直径杆用平台</td><td>Newport Corp.</td><td>300-P</td><td>2</td></tr><tr><td>杆，14 英寸（35.5 cm）高</td><td>Newport Corp.</td><td>40</td><td>2</td></tr><tr><td>平凹透镜，12.7 mm 直径，-25 mm 有效焦距，430–700 nm</td><td>Newport Corp.</td><td>KPC025AR.14</td><td>2</td></tr><tr><td>平凸透镜，25.4 mm 直径，50.2 mm 有效焦距，430–700 nm</td><td>Newport Corp.</td><td>KPX082AR.14</td><td>1</td></tr><tr><td>平凸透镜，25.4 mm 直径，62.9 mm 有效焦距，430–700 nm</td><td>Newport Corp.</td><td>KPX085AR.14</td><td>1</td></tr><tr><td>固定透镜支架，0.5&quot; 直径，1.0&quot; 光轴高度</td><td>Newport Corp.</td><td>LH-0.5</td><td>2</td></tr><tr><td>固定透镜支架，1.0&quot; 直径，1.0&quot; 光轴高度</td><td>Newport Corp.</td><td>LH-1</td><td>2</td></tr><tr><td>0.1 μm 微球</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>00876</td><td></td></tr><tr><td>琼脂糖</td><td>Research Products International Corp.</td><td>A20090</td><td>EEO 有影响</td></tr><tr><td>蝇蕈醇</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1523</td><td></td></tr></tbody></table>

构建低成本激光轴突切断系统以研究轴突再生 秀丽隐杆线虫

Constructing a Low-budget Laser Axotomy System to Study Axon Regeneration in C. elegans

激光轴突切断结合延时显微成像是检测 C. elegans 轴突再生表型的一种敏感实验方法1。该实验的主要难点在于人们普遍认为实施激光消融系统所需的成本较高（25,000 至 100,000 美元）且需要专业技术2,3。然而，中等成本（&lt;10,000 美元）的固态脉冲激光器在透明样本中即可实现稳定的激光消融效果，尤其适用于目标轴突靠近组织表面的情况。系统的搭建与光路校准可在一天内完成。聚焦聚光镜发出的光线至消融激光之间的光路为系统校准提供了便捷的参考指引。中间模块可移除所有光学元件，专用于激光消融，确保在激光消融过程中无需移动任何光学组件。中间模块中的二向色镜可实现成像与激光消融的同步进行。将激光光束与聚焦显微镜聚光镜发出的光束中心对齐，有助于系统的初始校准。通过多种透镜调节并扩束激光，使其充满所选物镜的后光圈。最终的校准与测试使用前表面反射镜玻璃片作为靶标进行。调节激光功率，使消融斑点达到最小尺寸（&lt;1 µm）。通过精细调节最后一个运动学安装的反射镜，将消融斑点精确对准成像窗口中固定的十字叉丝中心。用于轴突切断的激光功率通常约为靶标玻璃片上产生最小消融斑点所需功率的 10 倍（具体数值可能因所用靶标不同而有所变化）。线虫可通过置于琼脂糖垫（或微流控芯片4）上实现固定，以便进行激光轴突切断和延时成像。琼脂糖垫可使用 10% 琼脂糖溶于平衡盐溶液中，经微波炉加热熔化后制备。取一滴熔化的琼脂糖置于载玻片上，再用另一张载玻片压平，形成厚度约为 200 µm 的垫片（相邻载玻片上粘贴一层定时胶带作为间隔物）。使用“Sharpie”笔帽切割出直径统一为 13 mm 的圆形琼脂糖垫。在垫片中央加入麻醉剂（1 µl，20 mM Muscimol）和微球（Chris Fang-Yen 个人交流）（1 µl，水中含 2.65% 聚苯乙烯，粒径 0.1 µm），随后放置 3–5 条线虫，并使其侧卧于左侧。加盖盖玻片后，使用凡士林密封盖玻片边缘，防止样品蒸发。

激光轴突切断结合延时成像是一种灵敏的方法，可用于检测秀丽隐杆线虫（C. elegans）中基因突变对轴突再生的影响。一种高质量但成本低廉的激光消融系统可轻松添加到大多数显微镜上。进行长达15小时的延时成像需要对线虫进行精细的固定处理。

激光轴突切断结合延时显微成像是检测秀丽隐杆线虫（C. elegans）轴突再生表型的一种敏感实验方法¹。该实验的主要难点在于……

本实验的总体目标是展示如何组装和校准激光消融系统，以研究线虫（CL gans）中轴突的再生。首先，将激光器、格兰-汤普森偏振器、半波片、转向镜、潜望镜导轨和导轨镜安装至光学平台。接下来的步骤是将激光光束与显微镜聚光镜出射的光束进行准直对准。然后安装、校准并调整激光扩束透镜，使激光光束居中并实现零发散。该操作步骤的最后一步是通过精细调节，使激光消融光斑与图像焦点重合。最终，当XY方向的数控定位存在轻微偏差时，仍可利用衍射极限激光束精确切割半微米级的轴突，同时将对周围组织的损伤降至最低。与飞秒激光等现有方法相比，该技术的主要优势在于成本相对较低，仅为15,000。该方法几乎无需维护，并能实现非常精确的轴突切割。尽管该方法可用于研究海兔轴突再生，也可应用于其他系统，如果蝇、斑马鱼、小鼠、周围神经系统以及体外培养细胞。基本上，任何位于表面30至50微米范围内的细胞。首先将组件放置在面包板上，并用螺栓固定激光潜望镜支架和抬高的导轨支撑。该系统使用的是3B类激光器，可能对眼睛造成严重损伤，因此请务必认真遵守激光安全规范。请咨询您所在单位物理系的相关人员，了解如何安全地操作自由光束激光器。在进行光路准直时，务必始终将激光器设置为最低功率。当您通过目镜观察时，必须确保激光器已通过机械快门关闭，并且激光器已关闭电源。首先，放置显微镜，使其与导轨轴线对齐；其次，将其与显微镜聚光镜透镜的透射光束对齐；第三，使用固定在导轨上的可调光阑或透镜，将导轨两端与聚光镜光束对齐。继续操作前，使用水平仪和实验室千斤顶调整导轨高度。确保导轨两端对齐。现在，确保激光束穿过光腺、汤普森偏振器和半波片，且未触及它们的边缘或使其发生旋转。当所有组件已固定在光学平台上时，使用半波片调节激光器的功率。打开激光器，将脉冲频率设置为100连续模式，并通过半波片将功率降至最低。使用便利贴或镜头纸观察激光光束。现在将激光束从光学平台引出。从激光器开始，依次调整并固定运动学安装的反射镜，将光束引导至安装在抬高导轨末端的反射镜。完成时，激光束应大致对准各反射镜的中心，且反射镜相对于激光束轴线的取向应大致为45度，之后再将激光束与显微镜的透射光束进行准直。移除或打开中间模块中的所有中性密度滤光片和光圈。现在我们开始进行最关键的步骤，即在不造成过度附带损伤的情况下精确切断轴突。我们将使用最低的激光功率，精确地在 x、y 和 z 轴上对准激光，以获得最小的消融光斑。激光束与透射光束可同时在纸面上观察到。将纸张置于显微镜端口附近以开始操作。现在使用潜望镜顶部的反射镜以及导轨末端反射镜上的粗调装置，开始对激光进行准直。将一张纸置于已对准的聚光镜与打开的物镜转盘之间。继续使用导轨镜上的微调装置，将激光束对准透射光束中心。此时，用夹具将显微镜固定到位。有关评估激光准直的更多步骤，请参见书面稿件。必须安装双伽利略式扩束器，将300微米的激光束扩大33倍，以充满10毫米物镜的后光阑。首先将四个透镜安装到镜片支架上。然后将透镜安装到导轨上，确保所有透镜位于同一光轴上，并且与激光束严格正交。打开激光器，将其调节至最低功率并设为连续工作模式。粗略调节光束，使其通过每个透镜时对准。使用纸张观察光束。现在关闭激光器。为激光器安装安全快门，并将显微镜从激光束的光路中移开。重新打开激光器，并通过附近墙面观察激光光斑。使用透镜的微调装置扩展光束。然后调节最后两个运动学安装的反射镜，使光束在物镜后焦面的估计位置形成一个亮度均匀的圆形光斑。将纸张置于光束前，观察光束的尺寸和均匀性。然后通过移动纸张远离透镜，观察光束尺寸的变化，将光束调节至零会聚状态。关闭激光器，并开启机械快门。使用固定夹具将显微镜滑回激光光路中，以确定正确的对准位置。在显微镜的自由端重新安装夹具，但暂不拧紧。现在打开激光器。移除安全快门，使用载物台上的纸张将物镜转盘旋转至开放位置，并确保扩束且均匀的激光束与聚光镜透射出的光线中心对齐，此时应可见光束。若未对中，请松开显微镜夹具，轻轻推动显微镜以调整光束至中心位置。随后合上安全快门，并将激光器设置为触发模式。将60倍物镜旋转到位。现在对目标载玻片表面的划痕进行成像。移除安全快门，触发消融激光，并调节激光功率以获得最小的消融光斑。光斑应呈圆形，并位于图像中心、消融光斑中心的五到十微米范围内。通过精密调节运动学安装的导轨反射镜，保持光斑居中且光束轮廓均匀，需反复调整导轨安装的反射镜和顶部棱镜反射镜。通过以一微米为步长系统地上下移动激光焦点，并在每一步触发消融激光，来评估激光的Z轴聚焦情况。如果光束已正确扩束和准直，并且会聚角度调整恰当，那么其在成像焦平面上的消融作用应达到最强，而在焦平面之上或之下一微米处则应极弱或完全没有消融。如果最大消融位置位于成像焦平面的上方或下方，则需通过移动伽利略望远镜的第三透镜L3，对扩束后光束的Z轴焦点进行最终调节，直至激光消融位置与成像焦平面完全重合。线虫被固定于定制的载玻片上，使用构建的系统进行轴突消融。激光消融及轴突再生的时间序列成像结果非常理想。使用电动载物台，可以在单张载玻片上常规且精确地切割并成像五只不同动物中的五条轴突。轴突的成像时间是主要限制因素。约有10%的实验获得了高质量的时间序列成像视频。其余实验均提供了良好的数据，但由于线虫在固定五到八小时后通常会出现微小的抖动，导致图像美观性稍差。在进行该操作时，始终需要准确评估激光在x、y和z轴上的对准情况。人们在尝试切断轴突时最常见的问题是附带损伤或完全无法切断轴突，而这几乎总是由于激光未对准所致。该激光消融系统及用于在秀丽隐杆线虫（C. elegans）中观察轴突再生的技术，可使您常规地检测任何基因突变对轴突再生的影响。NCL C. elegans。

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构建低成本激光轴突切断系统以研究轴突再生秀丽隐杆线虫

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