构建低成本激光轴突切断系统以研究轴突再生 秀丽隐杆线虫

本实验的总体目标是展示如何组装和校准激光消融系统，以研究线虫（CL gans）中轴突的再生。首先，将激光器、格兰-汤普森偏振器、半波片、转向镜、潜望镜导轨和导轨镜安装至光学平台。接下来的步骤是将激光光束与显微镜聚光镜出射的光束进行准直对准。

然后安装、校准并调整激光扩束透镜，使激光束居中并实现零发散。该操作步骤的最后一步是通过精细调节，使激光消融光斑与图像焦点重合。最终，当XY方向的NC对准不完全时，仍可利用衍射极限的激光束精确切割半微米级的轴突，同时将对周围组织的损伤降至最低。

与飞秒激光等现有方法相比，该技术的主要优势在于成本相对较低，仅为15,000。该方法几乎无需维护，并能实现非常精确的轴突切割。尽管该方法可用于研究海兔轴突再生，也可应用于其他系统，如果蝇、斑马鱼、小鼠、周围神经系统以及体外培养细胞。

基本上，任何位于表面30至50微米范围内的细胞。首先将组件放置在面包板上，并用螺栓固定激光潜望镜支架和抬高的导轨支撑。该系统使用的是3B类激光器，可能对眼睛造成严重损伤，因此请务必认真遵守激光安全规范。

请与您所在单位物理系的人员交流，了解如何安全操作自由光束激光器。在调整光路的整个过程中，务必始终将激光器设置为最低功率。当您通过目镜观察时，必须确保激光器已通过机械快门关闭，并且激光器已关闭电源。

首先，放置显微镜，使其与导轨轴线对齐；其次，将其与显微镜聚光镜透镜的透射光束对齐；第三，使用固定在导轨上的可调光阑或透镜，将导轨两端与聚光镜光束对齐。

继续操作前，使用水平仪和实验室千斤顶调整导轨高度。确保导轨两端对齐。现在，确保激光束穿过腺体、汤普森棱镜和半波片，且未接触到它们的边缘或发生旋转。

当所有组件固定在光学平台上后，使用半波片调节激光器的功率。打开激光器，将脉冲频率设置为100连续模式，并通过半波片将功率降至最低。使用便签纸或镜头纸观察激光光束。

现在将激光束从光学平台引出。从激光器开始，依次调整并固定运动学安装的反射镜，将光束引导至安装在抬高导轨末端的反射镜。完成时，激光束应大致对准各反射镜的中心，且反射镜相对于激光束轴线的取向应大致为45度，之后再将激光束与显微镜的透射光束进行准直。

移除或打开中间模块中的所有中性密度滤光片和光圈。现在我们开始进行最关键的步骤，即在不造成过度附带损伤的情况下精确切断轴突。我们将使用最低的激光功率，精确地在 x、y 和 z 轴上对准激光，以获得最小的消融光斑。

激光束与透射光束可同时在纸面上观察到。将纸张放置在显微镜端口附近以开始操作。现在开始使用潜望镜顶部的反射镜以及导轨末端的反射镜上的粗调装置来调整激光的准直。

将一张纸置于已对准的聚光镜与打开的物镜转盘之间。继续使用导轨镜上的微调装置，将激光束对准透射光束中心。此时，用夹具将显微镜固定到位。

有关评估激光准直的更多步骤，请参见书面稿件。必须安装双伽利略式扩束器，将300微米的激光束扩大33倍，以充满10毫米物镜的后光阑。首先将四个透镜安装到镜座上。

然后将透镜安装到导轨上，确保所有透镜位于同一光轴上，并且与激光束严格正交。打开激光器，将其调至最低功率并设为连续工作模式。粗略调整光束，使其通过每个透镜时对准。

使用纸张观察光束。现在关闭激光器。为激光器安装安全快门，并将显微镜从激光光路中移开。

重新打开激光器，并通过附近墙面观察激光光斑。使用透镜的微调装置扩展光束。然后调节最后两个运动学安装的反射镜，使光束在物镜后孔径的估计位置处形成一个亮度均匀的圆形光斑。

将纸张置于光束路径中，观察光束的尺寸和均匀性。然后通过移动纸张远离透镜，观察光束尺寸的变化，调节光束至零会聚状态。关闭激光器，并启用机械快门。

使用固定夹具将显微镜滑回激光光路中，以确定正确的对准位置。在显微镜的自由端重新安装夹具，但不要完全拧紧。现在打开激光器。

移除安全快门，使用载物台上的纸张将物镜转盘旋转至开放位置，并确保扩束且均匀的激光束与聚光镜透射的光束中心对齐，此时应可见光束。若未对准中心，请松开显微镜夹具，轻轻推动显微镜以调整光束居中。随后合上安全快门，并将激光器设置为触发模式。

将60倍物镜旋转到位。现在对目标载玻片表面的划痕进行成像。移除安全快门，触发消融激光，并调节激光功率以获得最小的消融光斑。

光斑应呈圆形，并位于图像中心、消融光斑中心的五到十微米范围内。通过精密调节运动学安装的导轨反射镜，保持光斑居中且光束轮廓均匀，需要反复调整导轨安装的反射镜和顶部棱镜反射镜。通过以一微米为步长系统地上下移动激光焦点，并在每一步触发消融激光，来评估激光的Z轴聚焦效果。

如果光束已正确扩束和准直，并且会聚角度调整恰当，那么在成像焦平面上应达到最大消融效果，而在焦点上方或下方一微米处则应几乎无消融或消融很弱。如果最大消融位置位于成像焦平面之上或之下，则需通过移动伽利略望远镜的第三片透镜L3，对扩束后光束的Z轴焦点进行最终调节，直至激光消融位置与成像焦点重合。线虫被固定在定制的载玻片上，使用构建的系统进行激光消融，轴突的消融以及轴突再生的时间序列成像结果均非常理想。

使用电动载物台，可以在单张载玻片上常规且精确地切割并成像五个不同动物中的轴突。轴突的成像时间是限制因素。

约有10%的实验获得了高质量的时间序列成像视频。其余实验均提供了良好的数据，但由于线虫在固定五到八小时后通常会出现轻微的抖动，导致图像美观性稍差。在进行该操作时，始终需要准确评估激光在x、y和z轴上的对准情况。

人们在尝试切断轴突时最常见的问题是附带损伤或完全无法切断轴突，而这几乎总是由于激光未对准所致。该激光消融系统及用于在秀丽隐杆线虫（C. elegans）中观察轴突再生的技术，可使您常规检测任何基因突变对轴突再生的影响。NCL C. elegans。