膜片钳电容测量和Ca 2 +单神经末梢成像在视网膜切片
January 19th, 2012
在这里，我们描述了一个协议，准备琼脂嵌入式适合电和Ca2 +成像视网膜切片。这种方法允许一个研究使用录音单突触前神经末梢的直接膜片钳视网膜微型带状型突触。
该程序的总体目标是准备琼脂包埋的视网膜切片，用于研究位于突触前双极细胞神经末梢中的微回路。这是通过首先从深色适应的金鱼眼中获得视网膜并切割该视网膜的一小块矩形来实现的。然后将视黄醛片浸入透明且低熔点的琼脂溶液中，然后在良好的冷切片溶液中固化。
下一步是使用振动器切片包含矩形视网膜片的固体琼脂块。最后一步是可视化、识别和修补。夹住双极细胞神经末梢。
最终，结果显示突触前钙电流和突触物理胞吐作用，以及来自雾化和完整双极细胞末梢的膜电容测量。嗨，我是 Han Kim。我是 Burham Institute 实验室 PCO 的博士后。
今天我将介绍冷面部视网膜的 AGA 嵌入式切片制备，并演示单管道的膜片钳电容测量。要开始此过程，请用弹簧剪刀均匀地切割金鱼的每只眼睛。然后将眼罩放入不含钙的冰镇切片溶液中。
如有必要，用镊子取下镜头。接下来，用一对 45 度角尖细镊子将视网膜从眼罩上剥离，去除附着在视网膜上的色素上皮。之后，用一把细镊子或弹簧剪刀剪断视神经。
然后用改良的意大利面移液管或大吸头移液管进行吸力。要去除视网膜，请轻轻去除附着在视网膜上的其余色素上皮。清洁和健康的视网膜表面应该看起来光滑。
然后在室温下用约 0.03% 高 IDE 处理分离的视网膜 15 至 30 分钟。要去除玻璃体，请注意手术应在弱光下进行。在下一步中，用剃须刀片去除弯曲的边缘，切下一块约 2 x 2 毫米的矩形视网膜，其中包含视网膜的整个厚度。
然后将视黄醛片转移到装满琼脂溶液的小容器中，并在将其放入液体琼脂中时尽量减少视网膜周围的溶液量。随后，将带有琼脂的视网膜直接浸入冰冷的切片溶液中，以使琼脂凝固。接下来，将包含矩形视网膜片的固体琼脂块切成一个接一个的厘米立方体。
将块粘在 preco 切片室中的切片板表面。然后在冰冷的切片溶液中将块状切成厚度为 200 至 250 微米的切片。使用颤音，总共可以获得 5 到 10 片，可以存活约 5 到 6 小时。
之后，将其中一个切片转移到记录室。在切片顶部放置一个带有尼龙线网格的 U 形铂金框架。以每分钟 1 至 2 毫升的速率用含碳素鼓泡的记录溶液连续灌注切片。
在此步骤中，使用带有 0.2 微米过滤嘴头的注射器将内部溶液填充到玻璃贴片移液器中，距离移液器背面 1 到 2 厘米。然后去除尖端的气泡。将移液器固定在支架中。
对移液器施加正压，并使用微型纵器将其移向目标末端，同时将尖端向下移动穿过切片。沿横向扫掠方向移动移液器，以确保切片不会与吸头一起被拉扯。然后，在终端周围移动移液器吸头以清洁膜表面。
将尖端向下推靠端子边缘，形成一个凹坑并释放正压。如果未形成千兆欧姆密封，请立即对移液器施加轻微的负压。一旦形成千兆欧姆密封，将 E PC 9 膜片钳放大器切换到 onsell 记录模式，并将保持电位更改为负 60 或负 70 毫伏。
应用快速电容校正并等待密封稳定在 5 到 10 GHz 之间。然后用尖锐、轻柔的抽吸使膜破裂。建立全小区记录配置。
您也可以使用口腔抽吸代替注射器。在原子化 MB 端子上建立整个电池配置后，应用从负 70 毫伏到零毫伏的 200 毫秒步长去极化。请记住，在此去极化之前和之后，会施加电压钳位模式下的 2 kHz 正弦波 为了测量膜电容，去极化允许直接测量由电压门控 L 型钙通道打开而激活的向内钙电流，该电流由基于铯的内部溶液激活。
同时，人们能够监测由突触小泡的钙依赖性胞吐作用引起的电容跳跃，这增加了膜表面积。如果用移液管在突触末端修补完整的 MB 双极细胞，则不会观察到明显的钙电流，因为 MB 双极细胞的 do 权限中的间隙连接耦合会导致大泄漏电流。人们观察到的是像电流一样向外的大泄漏。
然而，在所示的去极化步骤之前和之后，人们仍然能够通过激活高频正弦刺激来监测电容跳跃。以下是 I-R-D-I-C 的示例，M 双极电池端子的图像。完整的端子更有可能呈椭圆形，如 A 和 B 所示，而 C 显示中间的端子，呈圆形和圆形。
染料填充方法也可用于对细胞末梢进行分类。以下是 MBI 双极细胞末梢的荧光图像示例，其中 D 轴突完整，e 轴突部分切割，F 轴突完全移除。这里显示了钙成像信号胞吐作用和抑制反馈的直接测量。
在 MB 双极细胞末梢中，MB 终末节中瞬时升高的钙浓度被电压钳步去极化激活，MB 讯息的相应荧光图像可以在 B 中看到。C.在尝试此过程时， 重要的是要记住，当 Retina 放入试剂盒琼脂中时，应尽量减少 Retina 周围的溶液量。这将改善来自琼脂块的拉丁化的附着。
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概述
本文描述了一种准备琼脂嵌入视网膜切片的协议，适用于研究突触前双极细胞神经末梢的微电路。该方法能够直接进行单个突触前神经末梢的膜片钳记录，有助于研究视网膜电路中的带状突触。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 电生理学
- 成像技术
背景
- 视网膜微电路在视觉处理中起着至关重要的作用。
- 理解突触机制对神经科学研究至关重要。
- 琼脂嵌入为薄切片提供结构支持。
- 膜片钳技术允许精确的电测量。
研究目的
- 为电生理分析准备视网膜切片。
- 研究带状突触的功能。
- 增强对视网膜微电路动力学的理解。
使用的方法
- 从适应黑暗的金鱼眼中获取视网膜。
- 将视网膜片段嵌入低熔点琼脂中。
- 使用振动切片机切割固态琼脂块。
- 可视化并进行双极细胞神经末梢的膜片钳。
主要结果
- 成功准备琼脂嵌入视网膜切片。
- 证明了直接膜片钳记录的可行性。
- 在视网膜电路中识别了带状突触。
- 该方法允许详细研究突触功能。
结论
- 该协议提供了一种研究视网膜微电路的可靠方法。
- 直接膜片钳记录可以揭示突触动力学。
- 这种方法可能推动视觉神经科学研究的进展。
常见问题
Executive Industry Relevance
This protocol enables direct electrophysiological and optical interrogation of presynaptic nerve terminals in retinal microcircuits, supporting mechanistic de-risking of synaptic targets involved in visual signal processing. By quantifying calcium-dependent exocytosis and inhibitory feedback at ribbon-type synapses, it provides predictive confidence in target validation for neuroscience discovery programs. The approach addresses a key inflection point in early discovery where functional validation of presynaptic mechanisms informs go/no-go decisions for modulator development.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by measuring presynaptic calcium currents and capacitance changes linked to vesicle exocytosis.
- Operational Value: Enables biological de-risking of ribbon-type synapse function through direct access to isolated nerve terminals.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by quantifying short-term plasticity of excitatory and inhibitory neurotransmitter release.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Prepares validated biological systems for downstream compound screening by stabilizing retinal slices for electrophysiology and imaging.
- Quantitative Outputs: Generates reproducible membrane capacitance and calcium imaging readouts enabling compound effect comparison.
- Scalability: Supports platform reuse across multiple terminals per slice, enhancing throughput for synaptic mechanism interrogation.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Aligns with retinal neurodegenerative disease models where synaptic dysfunction precedes cell loss.
- Translational Continuity: Bridges discovery through preclinical validation by preserving native microcircuit architecture in agar-embedded slices.
- Risk-Adjusted Advancement: Informs decisions on modulator efficacy by capturing reciprocal feedback inhibition dynamics from amacrine cells.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from target validation through lead identification by providing functional readouts of presynaptic activity in a disease-relevant system.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of presynaptic mechanisms via direct measurement of calcium influx and exocytosis.
- Screening: Delivers assay readiness through standardized slice preparation and stable terminal access for repeated recordings.
- Analytics: Enables quantitative comparison of conditions using membrane capacitance jumps and calcium imaging as dependent variables.
- Translational Research: Maintains preclinical continuity by preserving synaptic microcircuits in retinal slices for longitudinal study.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable capability for probing synaptic function across multiple experimental sessions per preparation.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity in presynaptic signaling.
- Operational Value: Enhances reproducibility through standardized agar embedding and slicing procedures.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by delivering quantitative data on synaptic plasticity and feedback inhibition.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of compounds modulating presynaptic calcium channels or vesicle release machinery.
Implementation Considerations
- Requires expertise in patch-clamp electrophysiology and calcium imaging techniques.
- Depends on vibratory slicing equipment and low-melting-point agar for tissue stabilization.
- Necessitates cross-team standardization for consistent slice quality and terminal identification.
- Involves adaptation considerations when transferring to other model systems with different synaptic architectures.
- Limited by tissue viability window of 5–6 hours post-slicing, requiring same-day experimental execution.
