视网膜切片中单个神经末梢的膜片钳电容测量与 Ca²⁺ 成像

本实验的总体目标是制备包埋在琼脂中的视网膜切片，用于研究位于突触前双极细胞神经末梢的微环路。该过程首先从经暗适应的金鱼眼球中获取视网膜，并从中切下一小块矩形组织。随后将该视网膜组织浸入透明且低熔点的琼脂溶液中，再将其置于冰冷的切片液中使其凝固。

下一步是使用振动切片机对含有视网膜矩形组织的固体琼脂块进行切片。最后一步是观察、识别并进行膜片钳记录。钳定双极细胞的神经末梢。

最终结果展示了来自离散和完整双极细胞终末的突触前钙电流以及通过膜电容测量得到的突触物理胞吐过程。大家好，我叫 Han Kim，是伯翰研究所 PCO 实验室的博士后。

今天我将介绍金鱼冷面视网膜AGA包埋切片的制备方法，并演示单突触小体的膜片钳电容测量技术。开始该实验前，使用弹簧剪沿金鱼眼球前部均匀剪切，离体取出双眼。随后将眼球杯置于无钙的低温切片溶液中。

如有必要，用镊子取下晶状体。接着，用45度角尖头精细镊子将视网膜从眼杯上剥离，以去除附着在视网膜上的色素上皮。随后，用精细镊子或弹簧剪剪断视神经。

然后使用改良的巴氏吸管或大口径移液吸头进行抽吸。为去除视网膜，需轻柔地清除附着在视网膜上的剩余色素上皮。清洁且健康的视网膜表面应呈现光滑状态。

然后在室温下用约0.03%较高浓度的IDE处理分离的视网膜15至30分钟。去除玻璃体时，应注意在弱光条件下进行操作。下一步，用刀片切除弯曲的边缘，切取一块约2×2毫米、包含视网膜全层厚度的矩形视网膜组织。

然后将视网膜组织转移至盛有琼脂溶液的小容器中，并在将其放入液态琼脂时尽量减少视网膜周围的溶液量。随后，将含有视网膜的琼脂直接浸入冰冻的切片溶液中，以使琼脂凝固。接着，将包含视网膜矩形组织的凝固琼脂块切割成1厘米×1厘米×1厘米的立方体。

将组织块粘附于预冷切片室中切片板的表面，然后在冰冻的切片液中用振动切片机将组织块切成厚度为200至250微米的切片。每次可获得5到10片切片，这些切片在约5至6小时内保持活性。

随后，将其中一片脑片转移至记录室中。在脑片上方放置一个带有尼龙丝网格的U形铂金支架。用持续通入碳合气的记录液以每分钟一到两毫升的流速持续灌注脑片。

在此步骤中，使用带有0.2微米滤膜尖端的注射器将内部溶液注入玻璃膜片电极，液面高度应距电极尾部1至2厘米。随后去除尖端的气泡。将电极固定在电极夹持器中。

使用显微操作器对移液管施加正压，并在将管尖向下穿过切片的同时，将其移向目标终末。以横向扫动的方式移动移液管，以确保切片不会随管尖被牵拉。随后在终末周围移动移液管尖端，以清洁膜表面。

将移液管尖端向下推压至电极边缘，形成凹陷并释放正压。如果未立即形成吉欧姆封接，则对移液管施加轻微负压。一旦形成吉欧姆封接，立即将E PC九通道膜片钳放大器切换至细胞贴附记录模式，并将钳制电位调整为-60或-70毫伏。

应用快速电容补偿，并等待封接电阻稳定在5至10吉欧之间。随后通过短促而轻柔的负压吸引破裂细胞膜，以建立全细胞记录构型。

您也可以使用口吸法代替注射器。在雾化的 MB 末梢上形成全细胞记录构型后，施加一个持续 200 毫秒、从 −70 毫伏到 0 毫伏的去极化阶跃刺激。请注意，在电压钳模式下，去极化前后需施加一个 2 千赫兹的正弦波，以测量膜电容。该去极化刺激可直接测量由电压门控 L 型钙通道开放所激活的内向钙电流，实验使用基于铯的胞内溶液。

与此同时，可以监测由突触小泡的钙依赖性胞吐作用引起的电容跃变，该过程会增加膜表面积。如果在MB双极细胞的突触终末处对其完整细胞进行膜片钳记录，则由于MB双极细胞间存在缝隙连接耦合而产生较大的漏电流，因而无法观察到明显的钙电流。此时所观察到的是一种较大的外向漏电流样信号。

然而，仍可通过在去极化步骤前后激活的高频正弦刺激来监测电容的跃变。以下是I-R-D-I-C成像下M型双极细胞终末的图像示例。完整的终末更倾向于呈现椭圆形，如A和B所示，而C显示的是混合型终末，其形态呈圆形。

染料填充法也可用于对细胞终末进行分类。图中显示了D中具有完整轴突的MBI双极细胞终末、E中轴突部分被切断的MBI双极细胞终末以及F中轴突完全被移除的MBI双极细胞终末的荧光图像。它们的终末由蓝色箭头指示。此处展示了钙成像信号、胞吐作用及抑制性反馈的直接测量结果。

在MB双极细胞终末中，通过电压钳阶跃去极化可激活MB终末端末区的瞬时钙离子浓度升高，相应的MB端末区荧光图像可见于B。C展示了神经递质释放的短期突触抑制的示例。在进行该操作时，需注意尽量减少视网膜周围溶液的量，尤其是在将其放入琼脂试剂盒时，这将有助于提高视网膜从琼脂块上的附着效果。