Name: 膜片钳电容测量和Ca 2 +单神经末梢成像在视网膜切片 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-01-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 16 s
Description: 学习制备琼脂包埋视网膜切片技术，用于研究双极细胞神经末梢突触微环路。该方法结合膜片钳记录与膜电容测量，可在金鱼视网膜中直接检测突触前钙电流及囊泡胞吐过程，为视觉神经科学研究提供可靠的电生理学手段。

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我们感谢Fred Rieke博士在我们实验室刚开始使用该方案时，对琼脂包埋视网膜切片制备方法所做的详细讲解。我们还要感谢Lori Vaskalis绘制示意图概览，感谢Veeramuthu Balakrishnan博士和Soyoun Cho博士对文稿和视频提出的有益意见。本研究得到了美国国立眼科研究所-国立卫生研究院RO1基金的资助，同时也部分得到了由韩国政府资助的韩国研究基金会基金[KRF-2008-357-E00032]的支持。

1. 外部溶液与内部溶液
<ol>
 <li>使用10倍浓缩液配制切片液（低钙），每日添加MgCl2、CaCl2和D-葡萄糖。最终1倍溶液的成分为（单位：mM）：119 NaCl、2.5 KCl、3.2 MgCl2、0.25 CaCl2、12 D-葡萄糖、0.2 L-抗坏血酸、12 HEPES。用NaOH调节pH至7.4，并通过H2O和10倍浓缩液调节渗透压至260 mOsm。</li>
 <li>称取3%低凝胶温度琼脂（Agarose type VII-A, A0701, Sigma; Rieke, 2001），与切片液混合。将含琼脂的溶液在微波炉中加热1–2分钟，或直至完全溶解，随后将琼脂置于水浴（30–33°C）中孵育，以防止快速凝固（凝胶相变温度：26 ± 2°C）。</li>
 <li>使用10倍浓缩液配制记录液（正常钙），每日添加MgCl2、CaCl2和D-葡萄糖。最终1倍溶液的成分为（单位：mM）：100 NaCl、2.5 KCl、1 MgCl2、25 NaHCO3、0.2 L-抗坏血酸、2.5 CaCl2、12 D-葡萄糖。用95% O2 / 5% CO2（碳合气）鼓泡5–10分钟后，用NaOH调节pH至7.4，并通过H2O和10倍浓缩液调节渗透压至260 mOsm。</li>
 <li>提前分装内液（每份1 ml），并储存在-20°C冰箱中。通常使用两种不同的电极内液以分离双极细胞的钙电流（单位：mM）：
 <ol>
 <li>40 CsCl、60 Cs-葡萄糖酸盐、10 四乙基铵（TEA）-Cl、28 HEPES、3 Mg-ATP、1 Na-GTP和2 EGTA。用CsOH调节pH至7.2，渗透压设定为250 mOsm。这种高氯内液通常可获得较低的串联电阻记录（更佳的电压钳制条件），并在双极细胞静息膜电位为-60 mV时产生更大的抑制性突触后电流（IPSCs）。</li>
 <li>95 Cs-葡萄糖酸盐、10 TEA-Cl、25 HEPES、3 Mg-ATP、0.5 Na-GTP和0.5 EGTA。用CsOH调节pH至7.2，渗透压设定为250 mOsm22。这种低EGTA内液通常可引发去极化阶跃脉冲下更大的膜电容变化，从而便于研究囊泡池耗竭和短期突触抑制。</li>
 </ol>
 </li>
</ol>
2. 膜片钳移液电极
<ol>
 <li>使用厚壁（外径1.5 mm）硼硅酸盐玻璃管（1B150F-4；World Precision Instruments，Sarasota，FL），并用垂直拉制仪（Narishige，PP830；Tokyo，Japan）拉制记录电极。当电极充满内液溶液#1时，在记录溶液中敞口电极的电阻为7–8 MΩ。</li>
 <li>用牙科蜡（Cavex，West Chester，PA）均匀涂覆记录电极，从尖端至插入电极夹持器的杆部位置。此步骤可最大限度降低电极电容和电噪声，从而实现更精确、低噪声的电容测量。较低的电极电容也有助于EPC-9（或EPC-10）膜片钳放大器的快速电容（C-fast）电子补偿。</li>
</ol>
3. 琼脂包埋视网膜切片的制备
<ol>
 <li>选取一条金鱼（Carassius auratus；8–16 cm），置于黑暗房间中带盖的桶内，进行30分钟暗适应。麻醉后，通过快速断头并双重损毁脊髓和脑干处死已镇静的金鱼。随后使用弯头剪刀和弯头镊子摘除眼球。上述操作已获得俄勒冈健康与科学大学机构动物护理与使用委员会（IACUC）的批准。</li>
 <li>使用弹簧剪刀（15003-08，Fine Science Tools；先用剪刀尖刺破组织以起始切割）沿眼球前部均匀环切，将每个眼球切成两半，并将眼杯放入冰浴切片液（低钙）中。如有必要，用镊子移除晶状体（晶状体通常随眼球前部一起脱落）。使用一对45°角尖端精细镊子（11251-35，Fine Science Tools）从眼杯上缓慢剥离附着色素上皮的视网膜，沿360°方向逐步进行。用精细镊子或弹簧剪刀切断或剪断视神经。结合使用角形尖端精细镊子和经改造的巴斯德移液管或转移移液管（大口径）施加的轻柔吸力，小心取出视网膜。使用角形尖端精细镊子去除仍附着在视网膜上的残余色素上皮。清洁且健康的视网膜表面应呈深色、光滑且呈红色。为彻底清除所有深色色素上皮细胞，需将视网膜暗适应1小时（8, 1992）。</li>
 <li>将分离的视网膜置于约0.03%（质量/体积；相当于1×切片液中约0.36 mg/mL）的透明质酸酶（3；H6254，Sigma）中，在室温（20–23°C）下处理15–30分钟，以去除玻璃体。在此孵育期间，可准备冰浴切片液。</li>
 <li>将一片小刀片（Personna，双刃，用70%乙醇和H2O清洗）固定在1 mL塑料注射器体上，用其切除视网膜边缘弯曲部分，获得一块矩形视网膜组织（约2×2 mm，包含完整视网膜厚度），并将该视网膜组织转移至盛有琼脂溶液（按(1.2)制备）的小容器中。将视网膜放入液态琼脂时，应尽量减少其周围的溶液量。直接浸入冰浴切片液（按(3.3)制备）中，使琼脂凝固20, 18, 9。我们使用一种小型自制容器：简而言之，将一个小型圆柱形管（Fisherbrand，聚乙烯样品瓶 2.5 ml，03-338-1B）两端剪开，并用Parafilm（PM-996，Pechiney Plastic Packaging）封口。</li>
 <li>将凝固的琼脂块切割成1×1×1 cm的立方体，其中包含矩形视网膜组织。</li>
 <li>将琼脂块转移至切片室，并将其粘附于切片板表面。切片室预先在冷冻箱（-20°C）中冷却。在冰浴切片液中，使用振动切片机（VT1000S 或 VT1200S，Leica）将琼脂块切成200–250 μm厚的切片。总共可获得5至10片切片，其活性可维持约5至6小时。</li>
 <li>将其中一片切片转移至记录室。将固定在U形铂金框架上的尼龙丝网格19置于切片上方，并持续灌流经95% O2/5% CO2（碳合气）饱和的记录液（流速为每分钟1–2 mL）。</li>
</ol>
问题排查：
如果包埋在琼脂块中的视网膜组织在切片过程中脱落或从琼脂中移出，可将切片厚度从200 μm逐步增加至300 μm，每次增加20 μm。此外，在将视网膜转移并放入液态琼脂时，应尽量减少其周围的溶液量，可通过使用卷成尖头的“Kimwipe”纸巾吸除多余液体。另一种避免此问题的方法是减小最初放入琼脂中视网膜组织的尺寸。由于玻璃体阻碍琼脂与视网膜组织充分粘附，可能需要重新配制新鲜的透明质酸酶或调整孵育时间（步骤 (3.3)）。
4. 视网膜切片中双极细胞突触终末的鉴定
<ol>
 <li>将视网膜切片置于直立显微镜下（例如 BX51WI，Olympus）。我们通过60倍水浸物镜（NA 0.90，Olympus）和CCD相机（XC-75，Sony）使用红外微分干涉差（IR-DIC）光学系统观察视网膜切片。CCD相机的输出信号被送至相机控制器（C2400，Hamamatsu）进行对比度增强，然后在模拟的Sony 13英寸黑白显示器上显示。显微镜安装在X-Y平移台上，记录室则置于固定台面上14。</li>
 <li>寻找完整或轴突切断（轴突被切断）的双极细胞终末，这些终末可通过其大小、形状及在切片中的位置进行识别（图1）。轴突切断与完整的终末还可通过其电容性瞬态电流衰减时间（分别为单指数衰减与双指数衰减）以及Ca2+电流加以区分（图2；12, 14, 15）。Mb终末位于金鱼视网膜内丛状层的b亚层最靠近内核层的一层（ON型层；邻近节细胞层）。Mb终末表面暗淡、形态扁平，易于与相位明亮且呈球形的节细胞和移位无长突细胞胞体相区分。此外，Mb终末边缘密布突触接触点，与节细胞和无长突细胞光滑洁净的表面相比，其表面显得粗糙且不规则（图1a-c）。轴突切断的Mb终末呈圆形或近似圆形（图1c），而完整的终末则呈椭圆形并被拉长，通常一端变窄，指向视网膜的内核层（图1a,b）。</li>
 <li>受损或不健康的终末常表现为肿胀，并在表面出现多个小颗粒状结构。虽然可能在这些终末上获得吉欧姆（GΩ）级封接，但它们在破膜后很快可能发生破裂。其他不健康终末的表现包括空心状外观、对比度和/或亮度与周围切片组织相同，有时位于切片表面。既可在切片深层的健康终末上进行记录（优点：突触回路更完整），也可在切片表面附近进行记录（优点：灌流药物更快到达细胞外液；更容易形成封接）。</li>
</ol>
5. 电生理记录与Ca2+成像
<ol>
 <li>使用带有 0.2 μm 滤尖（Nalgene），用内液填充玻璃膜片电极，液面距电极后端1-2厘米。去除尖端气泡后，将电极固定于电极夹持器中，施加正压（1.2-1.6 psi），并使用显微操作器（MPC-200，Sutter Instrument）将其移向目标终末。当下移电极穿过脑片时，应同时进行横向扫动，以确保脑片不随电极尖端被牵拉。</li>
 <li>移动移液管尖端在电极周围以清洁膜表面。将尖端向下推压电极边缘形成一个小凹陷（压痕），并释放正压。如果未立即形成吉欧（GΩ）封接，可施加轻微负压。</li>
 <li>形成 GΩ 级封接后，切换至 EPC-9 膜片钳放大器的细胞贴附记录模式，并将钳制电位更改为 -60 或 -70 mV。应用 C-fast（快电容）补偿，等待封接电阻稳定在 5-10 GΩ 之间，然后通过口吸管施加短促而轻柔的负压以破膜，建立全细胞记录构型。若全细胞构型已正确建立，串联电阻应在 14-30 MΩ 之间。输入电阻方面，完整末梢为 200-500 MΩ，轴突切断末梢为 1-3 GΩ。 14.</li>
 <li>观察电容性瞬态电流（图2a和2c），以区分完整的和轴突切断的双极细胞终末。完整的和轴突切断的Mb终末的静息膜电容分别为9-16 pF和3-8 pF。</li>
 <li>对轴突切断的Mb终末施加一个持续时间为200 ms、从-70 mV到0 mV的电压钳阶跃。这将允许直接测量大（约200–600 pA）、分离的内向Ca2+ 由电压依赖性L型Ca通道开放所激活的电流2+ 通道（图2b）。同时，可以监测由突触小泡胞吐引起的电容跃变，以及快速的pH介导的Ca2+ 胞吐后电流 15，以及GABA能的相互反馈抑制（图3c; 22）。如果对完整的Mb双极细胞终末进行膜片钳记录，结果将如所示 图2c和2d。无明显的Ca2+ 由于Mb双极细胞树突间存在缝隙连接耦合，导致较大的“漏”电流，因而观察到电流 1.</li>
 <li>使用时间分辨膜电容测量的“正弦波+直流”法，可通过从保持电位 -70 mV 阶跃去极化至 0 mV 来诱发膜电容变化 6膜电容的跳跃表明突触囊泡与质膜的融合。在-70 mV的保持电位基础上施加一个2 kHz的正弦电压钳制指令（峰峰值30 mV）。采用EPC-9膜片钳放大器软件模拟锁相放大器（HEKA，Lambrecht，德国）在两个正交相位角分析记录电流。在完整末梢中 图 2d，高频（2 kHz）正弦刺激可将分析的膜电容限制在终末和轴突，这些区域的基础电容Cm约为6.8 pF。双极细胞的胞体和树突膜因此被高频电压钳正弦波滤除 13.</li>
 <li>对于 Ca2+成像实验，将细胞内式膜片钳电极液与 Ca 充分混合2+-敏感的荧光染料（例如 Oregon Green 488 BAPTA-1（100-200 μM；O-6806，Invitrogen）并从步骤5.1至5.5重复实验流程。这将实现荧光成像与电生理记录的联合应用。例如，可对Ca2+ 与Mb终末小端树突突起中从-70 mV到0 mV、持续200 ms的电压阶跃相关的瞬态电流图3a,b）。我们将奥林巴斯倒置显微镜与转盘激光共聚焦显微镜系统（CSU-X1，Yokogawa）相结合。该共聚焦显微镜采用声光可调滤波器调节的488 nm和561 nm激光线。数据通过Slidebook软件（3i；Intelligent Imaging Instruments）采集。有关使用金鱼视网膜神经元进行钙成像技术的更多细节，请参见 24, 17, 3.</li>
</ol>
问题排查：
如果在形成稳定的吉欧姆（GΩ）封接后仍经常无法建立全细胞记录模式，可以尝试降低用于穿破终末膜的负压。此外，建立全细胞记录模式所需的最佳吸力可能随膜曲率的不同而变化（胞体 > 末梢）。也可使用“zap”程序（幅度：400 mV，持续时间：100 μs）进入全细胞记录模式，可单独使用或与短暂的负压脉冲联合使用。我们发现，当移液管尖端在浴液中的电阻超过12 MΩ时，zap程序在破膜过程中尤为有效。
6. 代表性结果
<img alt="视网膜神经元的显微成像，内核层、内丛状层和神经节细胞层中标记区域；荧光分析" src="/files/ftp_upload/3345/3345fig1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图1"> 
图1. 在金鱼视网膜切片中鉴定 Mb 双极细胞终末。a-c红外微分干涉对比成像下的Mb双极细胞终末。我们可以在红外微分干涉对比图像中识别出可能是轴突切断的（轴突被切断）和完整的终末。轴突切断的终末呈圆形或环状，如图所示。 c 而完整的末端更可能呈椭圆形，如图所示 a 和 b。该分类可通过瞬态电容测量法（见图2）或染料填充法加以验证（d-f。红色箭头指示完整末梢中轴突与轴突末梢交界处的位置 a 和 b红色虚线表示Mb双极细胞终末的轮廓。d-f). 具有完整轴突的Mb双极细胞终末的荧光图像（d），部分切断的轴突（e)，或完全移除的轴突（f。记录前，将 Alexa 555（A20501MP，Invitrogen）荧光染料加入内液中。膜片钳记录完成后，立即将视网膜切片转移至含 4%（wt/vol）多聚甲醛（P6148，Sigma）的磷酸盐缓冲液（70013，GIBCO）中，固定 30 分钟。随后将切片置于含抗荧光淬灭剂的水性封片剂（Biomeda corp）中，贴附于 Superfrost 载玻片（Fisher Scientific）上。使用共聚焦激光扫描显微镜（LSM 710，Carl Zeiss）配备 40 倍水浸物镜，以 555 nm 激光线（红色）观察含 Alexa 555 的 Mb 双极细胞终末。注意轴突终末处伸出的小型端树突突起（蓝色箭头）。比例尺表示 10 μm (a-f）。INL：内核层，IPL：内丛状层，GCL：节细胞层。
<img alt="轴突切断与完整终末的电生理图，显示电压钳制下的电流反应。" src="/files/ftp_upload/3345/3345fig2.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 2"> 
图 2. 轴突切断和完整 Mb 双极细胞终末的电学特性。（a，c）通过电压钳制阶跃超极化从钳制电位 -60 mV 变为 -70 mV 所激活的瞬时电流反应。-10 mV 电压钳制阶跃引起的短暂电流反应可能表现为：1）在 -70 mV 时具有高输入电阻的单相快速指数衰减（提示为轴突切断的终末；图 a）；或 2）在 -70 mV 时具有低输入电阻的双指数衰减（提示为完整的终末；图 c；另见12, 14, 15）。（b，d）通过从 -70 mV 阶跃去极化至 0 mV 诱发 Ca2+ 电流和膜电容跳跃。时间分辨的膜电容测量采用叠加在 -70 mV 静息钳制电位上的 2-kHz 正弦波刺激6。红色轨迹为电容数据点的平均值。注意图 2b 和 2d 中的电容跳跃均约为 200 fF。
<img alt="电生理学示意图；膜片钳技术、去极化反应、双极细胞分析。" src="/files/ftp_upload/3345/3345fig3.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 3"> 
图 3. 在 Mb 双极细胞末梢中对 Ca2+ 成像信号、胞吐作用及抑制性反馈的直接测量。（a）通过电压钳阶跃去极化（从 -70 mV 至 0 mV，持续 200 ms，箭头所示），激活了 Mb 末梢端树突中 Ca2+ 浓度的瞬时升高。Oregon Green 488 BAPTA-1（100 μM），一种 Ca2+ 指示荧光染料，被加入记录电极内液中。（b）Mb 端树突对应的荧光图像（感兴趣区域由红色虚线标示）。（c）神经递质释放（胞吐作用）的短期突触抑制。由一对持续 20 ms、间隔 200 ms 的去极化脉冲（上迹线）诱发的 Ca2+ 电流（中迹线）和膜电容变化（下迹线）。箭头指示了胞吐释放的质子对 Ca2+ 电流的影响，以及来自邻近无长突细胞的 GABA 能反馈性抑制作用15, 21。注意，质子介导的 Ca2+ 电流抑制以及 GABA 能反馈性抑制仅出现在第一次去极化反应中，该反应同时伴随因突触囊泡胞吐所引起的电容跳跃。

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<li>Bergstrom, L., Christensson, I., Folkesson, R., Stenstrom, B., Terenius, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+ion+exchange+chromatography+and+radioimmunoassay+procedure+for+measuring+opioid+peptides+and+substance+P%5BTitle%5D)+AND+%22Life.+Sci%22%5BJournal%5D)">An ion exchange chromatography and radioimmunoassay procedure for measuring opioid peptides and substance P.</a> Life. Sci. 33, 1613-1619 (1983).</li>
<li>Falth, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuropeptidomics+strategies+for+specific+and+sensitive+identification+of+endogenous+peptides%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Neuropeptidomics strategies for specific and sensitive identification of endogenous peptides.</a> Mol. Cell. Proteomics. 6, 1188-1197 (2007).</li>
<li>Falth, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((a+database+designed+for+endogenous+peptides+and+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Proteomics%22%5BJournal%5D)">a database designed for endogenous peptides and mass spectrometry.</a> Mol. Cell. Proteomics. 5, 998-1005 (2006).</li>
</ol>

我们没有需要披露的竞争利益。

本方案中的一个关键且困难的步骤是将视网膜组织转移至琼脂溶液中（方案 3.4）。必须仔细去除视网膜组织上的玻璃体以及残留的切片溶液，并在转移过程中避免组织发生扭曲或弯曲。为实现这一目标，我们使用一种尖端弯成90°角的小铲（21-401-25B，Fisherbrand）以及弯头镊子（11251-35，Fine Science Tools），在切片溶液中全程辅助定位视网膜组织。视网膜切片及小铲表面残留的溶液可通过折叠或卷起的Kimwipes（Kimberly-Clark）纸巾一角轻轻蘸拭去除。
制备视网膜横切片的另一种常用方法是基于滤纸的方案23。简言之，将整片视网膜倒置并贴附于一片Millipore滤膜（节细胞层紧贴滤纸，感光细胞层朝上），然后使用手动垂直“拇指”切片器（例如Narishige ST-20）切成250 μm厚的切片。我们发现，基于滤纸的方案优势在于可获得更健康的感光细胞，并提高轴突切断的Mb终末与完整Mb终末的比例。因此，我们采用这种滤纸法来诱发嵌于视网膜切片中的单个Mb终末的光反应。
<p class="...

<table><tbody><tr><td>低凝胶温度琼脂</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A0701</td><td>琼脂糖VII-A型</td></tr><tr><td>膜片钳移液管</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>1B150F-4</td><td>厚壁（外径1.5 mm）硼硅酸盐玻璃</td></tr><tr><td>垂直拉制仪</td><td>Narishige International</td><td>PP830</td><td></td></tr><tr><td>牙科蜡</td><td>Cavex</td><td></td><td></td></tr><tr><td>弹簧剪刀</td><td>Fine Science Tools</td><td>15003-08</td><td></td></tr><tr><td>45&amp;#x00B0; 斜角精细镊子</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-35</td><td></td></tr><tr><td>剃须刀片</td><td>Personna Medical Care</td><td></td><td>双刃，用70%乙醇和H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O清洗</td></tr><tr><td>圆柱形管</td><td>Fisher Scientific</td><td>03-338-1B</td><td>2.5 ml聚乙烯样品瓶</td></tr><tr><td>透明质酸酶</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H6254</td><td></td></tr><tr><td>振动切片机</td><td>Leica Microsystems</td><td>VT1000S 或 VT1200S</td><td></td></tr><tr><td>直立显微镜</td><td>Olympus Corporation</td><td>BX51WI</td><td></td></tr><tr><td>60倍水浸物镜</td><td>Olympus Corporation</td><td>LUMPlanFl</td><td>数值孔径 0.90</td></tr><tr><td>CCD相机</td><td>Sony Corporation</td><td>XC-75</td><td></td></tr><tr><td>相机控制器</td><td>Hamamatsu Corp.</td><td>C2400</td><td></td></tr><tr><td>显示器</td><td>Sony Corporation</td><td></td><td>13&amp;#8221;黑白显示器</td></tr><tr><td>注射器滤器</td><td>Nalge Nunc international</td><td></td><td>0.2 &amp;#x03BC;m</td></tr><tr><td>微操纵器</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>MPC-200</td><td></td></tr><tr><td>锁相放大器</td><td>HEKA Instruments</td><td></td><td>EPC-9/10放大器具有软件模拟功能</td></tr><tr><td>转盘激光共聚焦显微镜</td><td>Yokogawa</td><td>CSU-X1</td><td>膜片钳全细胞记录后的活细胞成像</td></tr><tr><td>Slidebook软件</td><td>Intelligent Imaging Instruments (3i)</td><td></td><td>成像数据采集与分析</td></tr><tr><td>对苯二甲醛</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>70013</td><td></td></tr><tr><td>Superfrost载玻片</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td>载玻片</td></tr><tr><td>抗荧光淬灭剂</td><td>Biomeda corp.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>共聚焦激光扫描显微镜</td><td>Carl Zeiss, Inc.</td><td>LSM 710</td><td>固定组织成像</td></tr><tr><td>刮勺</td><td>Fisher Scientific</td><td>21-401-25B</td><td></td></tr><tr><td>手动垂直切片器</td><td>Narishige International</td><td>ST-20</td><td></td></tr><tr><td>Oregon Green 488 BAPTA-1</td><td>Invitrogen</td><td>O-6806</td><td>Ca&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;敏感型荧光染料</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 555 肼</td><td>Invitrogen</td><td>A-20501MP</td><td>荧光染料</td></tr></tbody></table>

视网膜切片中单个神经末梢的膜片钳电容测量与 ca2+ 成像

Patch-clamp Capacitance Measurements and Ca2+ Imaging at Single Nerve Terminals in Retinal Slices

在脊椎动物视网膜中，特化的神经元能够在广泛的光强动态范围和频率变化下检测并传递视觉刺激。视网膜中的两类神经元——光感受器和双极细胞——通过使用带状突触活性区实现了长时间持续且高通量的神经递质释放。金鱼视网膜中的ON型混合双极细胞（Mb）末梢在受到光刺激时发生去极化，并接收来自视杆和视锥光感受器的混合输入，因其体积较大（直径约10–12 μm）以及与无长突细胞树突之间存在大量侧向和相互突触连接，非常适合用于研究带状突触。利用膜片钳技术直接记录金鱼视网膜切片中Mb双极细胞末梢，可测量突触前Ca2+电流、膜电容变化，以及由末梢上表达的GABAA和GABAC受体介导的相互突触反馈抑制。通过突触前膜电容测量胞吐作用，可研究兴奋性神经递质释放的短期可塑性14,15。此外，通过记录到达Mb末梢的相互反馈抑制信号，也可探究无长突细胞抑制性神经递质释放的短期和长期可塑性21。在较短时间内（例如约10秒），来自无长突细胞的GABA能相互反馈抑制会通过GABA囊泡池的耗竭而产生成对脉冲抑制效应11。因此，视网膜内丛状层中视网膜微环路的突触动态可被直接研究。
脑片技术在40多年前被引入，至今仍广泛用于研究神经元的电学特性，无论是单个细胞的胞体、单个树突或轴突，还是微环路突触水平的研究19。对于体积过小而无法直接粘附在切片室上的组织，通常先将其包埋于琼脂中（或放置在滤纸上），然后再进行切片20, 23, 18, 9。在本视频中，我们采用预包埋琼脂技术，以金鱼视网膜为材料。在切片过程中，部分金鱼视网膜切片中的巨大双极细胞终末会发生轴突切断（轴突被切断）。这一特性使我们能够分离单个突触前神经末梢的输入信号，因为对已切断轴突的终末进行记录时，可排除胞体-树突区室的信号干扰。此外，也可以通过记录那些在切片过程中轴突未被切断且仍与终末相连的Mb型双极细胞，来对完整的双极细胞进行记录。总体而言，采用本实验方案将有助于视网膜突触生理学、微环路功能分析以及带状突触（ribbon synapses）突触传递的研究。

本文介绍一种制备适用于电生理学和Ca2+成像的琼脂包埋视网膜切片的实验方案。该方法可利用对单个突触前神经末梢的直接膜片钳记录，研究视网膜微环路中的带状突触。

视网膜切片中单个神经末梢的膜片钳电容测量与 Ca2+ 成像

视觉刺激由脊椎动物中特化的神经元在广泛的光强度和频率变化动态范围内进行探测和传递。

本实验的总体目标是制备包埋在琼脂中的视网膜切片，用于研究位于突触前双极细胞神经末梢的微环路。该过程首先从经暗适应的金鱼眼球中取出视网膜，并切割一小块矩形视网膜组织。随后将该视网膜组织浸入透明且低熔点的琼脂溶液中，再将其置于冰冷的切片液中使其凝固。下一步是使用振动切片机对含有视网膜矩形组织的固体琼脂块进行切片。最后一步是观察、识别并进行膜片钳记录。夹住双极细胞的神经末梢。最终结果展示了来自雾化和完整双极细胞终末的突触前钙电流以及通过膜电容测量得到的突触物理胞吐作用。大家好，我叫 Han Kim，是伯翰研究所 PCO 实验室的博士后。今天我将介绍金鱼冷面视网膜AGA包埋切片的制备方法，并演示单突触小体的膜电容膜片钳测量技术。开始该实验时，使用弹簧剪沿着金鱼眼睛前部均匀剪切，将双眼离体。随后将眼球杯置于无钙的冷切片溶液中。如有必要，用镊子取下晶状体。接着，用一对45度角尖头精细镊子将视网膜从眼杯上剥离，以去除附着在视网膜上的色素上皮。随后，用精细镊子或弹簧剪剪断视神经。然后使用改良的巴氏吸管或大口径移液吸头进行抽吸。为去除视网膜，需轻柔地清除附着在视网膜上的剩余色素上皮。清洁后健康的视网膜表面应呈现光滑状态。然后在室温下用约 0.03% 更高浓度的 IDE 处理分离的视网膜 15 至 30 分钟。去除玻璃体时，应注意在弱光条件下进行操作。下一步，用刀片切除弯曲的边缘，切取一块约 2×2 毫米、包含视网膜全层厚度的矩形视网膜组织。然后将视网膜组织块转移至盛有琼脂溶液的小容器中，并在将其放入液态琼脂时尽量减少视网膜周围的溶液量。随后，将含有视网膜的琼脂直接浸入冰冻的切片溶液中，以使琼脂凝固。接着，将包含视网膜矩形组织的凝固琼脂块切成1厘米×1厘米×1厘米的立方体。将组织块粘附于预冷切片室中切片板的表面，然后在冰冻的切片液中用振动切片机将组织块切成厚度为200至250微米的切片。每次可获得5到10片切片，这些切片在约5至6小时内保持活性。随后，将其中一片脑片转移至记录室中。在脑片上方放置一个带有尼龙丝网格的U形铂金支架。用持续通入碳合气的记录液以每分钟1至2毫升的流速持续灌注脑片。在此步骤中，使用带有0.2微米滤膜吸头的注射器将内部溶液注入玻璃膜片电极，液面高度应距电极尾部1至2厘米。随后去除吸头前端的气泡。将电极固定在电极夹持器中。使用显微操作器对移液管施加正压，并在将管尖向下穿过切片的同时，将其移向目标终末。以横向扫动的方式移动移液管，以确保切片不会随管尖被牵拉。然后在终末周围移动移液管尖端，以清洁膜表面。将移液管尖端向下推压至电极边缘，形成凹陷并释放正压。如果未立即形成吉欧姆封接，则对移液管施加轻微负压。一旦形成吉欧姆封接，立即将E PC九通道膜片钳放大器切换至“onsell”记录模式，并将钳制电位调整为-60或-70毫伏。应用快速电容补偿，并等待封接电阻稳定在5到10吉欧之间。随后通过短促而轻柔的负压吸引破裂细胞膜，以形成全细胞记录构型。也可以使用口吸法代替注射器。在雾化的MB末梢形成全细胞记录构型后，施加一个持续200毫秒的去极化脉冲，从-70毫伏变为0毫伏。请注意，在电压钳模式下，去极化前后需施加一个2千赫兹的正弦波，以测量膜电容。该去极化过程可直接测量由电压门控L型钙通道开放所激活的内向钙电流，实验使用基于铯的细胞内溶液。与此同时，可以监测由突触小泡钙依赖性胞吐作用引起的电容跳跃，该过程会增加膜表面积。如果在MB双极细胞的突触终末处对其完整细胞进行膜片钳记录，则由于MB双极细胞之间存在缝隙连接耦合而产生较大的漏电流，因此无法观察到明显的钙电流。此时所观察到的是一种较大的外向漏电流样信号。然而，仍可通过在去极化步骤前后激活的高频正弦刺激来监测电容的跳跃。以下是I-R-D-I-C图像中M型双极细胞终末的示例。完整的终末更倾向于呈现椭圆形，如A和B所示，而C显示的是混合型终末，其形态呈圆形。染料填充法也可用于对细胞终末进行分类。图中显示了D中具有完整轴突的MBI双极细胞终末、E中轴突部分切断的MBI双极细胞终末以及F中轴突完全去除的MBI双极细胞终末的荧光图像。它们的终末由蓝色箭头指示。此处展示了钙成像信号、胞吐作用及抑制性反馈的直接测量结果。在MB双极细胞终末中，通过电压钳阶跃去极化可激活MB终末突触终球内瞬时升高的钙离子浓度，相应的MB突触终球荧光图像可见于B图。C图展示了神经递质释放的短期突触抑制示例。在进行该操作时，需注意尽量减少视网膜周围溶液的量，因其被置入琼脂胶块中；这将有助于提高视网膜与琼脂胶块之间的贴附性。

patch-clamp-capacitance-measurements-ca2-imaging-at-single-nerve

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膜片钳电容测量和Ca 2 +单神经末梢成像在视网膜切片

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巨囊突触膜电容记录的膜片钳方法

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小鼠视网膜神经元在暗适应脑片制备中的膜片钳记录

本视频演示了用于从小鼠视网膜平铺标本进行电生理记录的全细胞膜片钳技术。使用带有电极的细玻璃移液管接近视网膜内的星形细胞（SACs）。在形成密封后，施加负压以破裂膜并形成全细胞膜片钳构型。最后，利用该构型测量通过SAC突触受体的离子流。...

建立用于小鼠视网膜扁平铺片电生理记录的全细胞膜片钳技术

本视频演示了通过固定脑切片、定位移液管以实现全细胞记录构型，并刺激突触前神经元来记录突触后反应，从而揭示神经元连接关系的突触连接图谱绘制方法。...

急性脑切片中神经元连接的成对膜片钳记录

本视频文章展示了全装片小鼠视网膜神经节细胞的膜片钳记录技术的实验装置、细胞体膜片钳操作步骤以及动态钳记录的实施方法。该技术可用于研究兴奋性和抑制性突触输入对神经元放电的精确贡献，及其相对强度和时间关系。...

在小鼠视网膜神经节细胞中实现包含突触和人工电导的动态钳制技术

本方案演示了如何对平铺制备的视网膜神经元进行全细胞膜片钳记录。...

去传入神经小鼠视网膜平铺制备中星形细胞的膜片钳记录

一旦神经组织被从体内取出，其会受到环境条件的显著影响，导致在6至8小时后逐渐降解。通过一种独特的孵育方法，可对组织的细胞外环境进行密切监测和精确调控，从而将组织活性显著延长至&gt;24小时。...

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电刺激下平铺视网膜的钙成像

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动态钳技术用于研究与自闭症相关的神经元兴奋性损伤

学习制备琼脂包埋视网膜切片技术，用于研究双极细胞神经末梢突触微环路。该方法结合膜片钳记录与膜电容测量，可在金鱼视网膜中直接检测突触前钙电流及囊泡胞吐过程，为视觉神经科学研究提供可靠的电生理学手段。

视网膜切片中单个神经末梢的膜片钳电容测量与 Ca²⁺ 成像

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