胚胎腹侧中脑器官型片文化:一个系统来研究多巴胺能神经元发展在体外
January 31st, 2012
描述一个方法来生成从E12.5小鼠胚胎脑器官切片。可用于器官切片文化观察多巴胺能神经元或其他腹侧中脑的神经元的行为。
该程序的总体目标是从 E 12.5 神经元胚胎中脑生成器官型切片，用于分析发育中的多巴胺能神经元。这是通过首先解剖胚胎大脑来完成的。然后大脑被嵌入到低熔点的 aeros 中。
第三步是使用振动器对脑切片进行切片。最后一步是选择合适的脑切片进行培养和延时成像。最终，延时成像和免疫荧光显微镜用于显示多巴胺能神经元的早期步骤、迁移行为和分化。
这种方法可以帮助回答神经发育领域的关键问题，例如在腹侧大脑发育过程中跟踪神经元和迁移行为。解剖前一天，根据随附的手稿，在解剖前约两小时准备一种 X Krebs 缓冲液和培养基。通过微波加热溶液直到 aros 完全溶解，在 Krebs 缓冲液中制备 100 毫升 4% 低熔点 aros。
然后将 aros 放入 45 摄氏度的水浴中。接下来，用冰冷的 Krebs 缓冲液填充 Vibram 缓冲液托盘。打开冷却元件并将其保持在 4 摄氏度。
之后，将剃须刀片固定在刀片架中。准备一把手术刀、一把细画笔和一个迷你多孔勺子，用于拾取振动器区域的切片，以便以后切片。然后将 Krebs 缓冲液添加到无菌培养皿中并将它们保存在冰上。
在解剖区，准备三个用于解剖的大无菌培养皿和两个用于嵌入一把小剪刀、两对细镊子、一个迷你多孔勺、一个用圆形封闭尖端抛光的玻璃牧场移液管火和一升冰上的 Krebs 缓冲液。用 70% 乙醇擦拭所有解剖工具。接下来，将培养基添加到六孔板的孔中，并在 37 摄氏度下孵育 2 小时。
接下来，在无菌条件下，将 1.5 毫升含青霉素链霉素的 Krebs 缓冲液添加到另一个 6 孔板的每个孔中。将 milli 细胞膜插入物放入孔中。将六孔板放在颤音旁边，以便将脑切片转移到滤膜上。
切片后，立即在 E 12.5 阶段处死一只具有胚胎的怀孕雌性小鼠，并用一对镊子将其抬起以去除子宫。然后用另一对镊子将子宫肌层从子宫上撕下。之后，将子宫置于显微镜下冰冷的 Krebs 缓冲液中。
使用一对细镊子将子宫的肌肉壁、Riker 膜和内脏卵黄袋与胚胎分开。然后从子宫中取出胚胎，并将胚胎移至带有无菌 Krebs 缓冲液的单独培养皿中。接下来，从每个胚胎上切下头部。
用一对细镊子在眼睛水平刺穿头部，固定头部。使用另一对镊子小心地去除皮肤和颅骨。然后小心地将大脑抬起，并将其转移到带有无菌 Krebs 缓冲液的培养皿中。
之后，在 4% 低熔点 aros 中清洗大脑。一次将 2 到 3 个大脑包埋在 4% 新鲜、低熔点的 aros 中。使用带有火焰抛光圆头的巴斯德移液器。
然后尽可能均匀地将包埋培养皿放在冰上。接下来，抬起大脑，直到 aros 的底部凝固，这样大脑就可以均匀地沉降并与 aros 块的底部平行。当 aros 完全凝固时，修剪大脑周围的 aros。
在那次胶水之后，aros 块到振动器的样品台上。粘合块时，确保大脑的腹侧与平台平行。截面 300 微米厚的水平切片，频率为 50 赫兹，刀片振幅为 1.1 毫米，速度为每秒 25 毫米。
使用细画笔将切片推到一个迷你多孔勺子上，收集脑切片。然后将它们转移到显微镜下装有无菌冰冷的 Krebs 缓冲液的培养皿中。选择包含腹侧中脑组织的切片。
在此步骤中，使用迷你多孔勺和细画笔将脑切片转移到带有先前制备的 Krebs 缓冲液的六孔板中的毫细胞膜插入物上。接下来，将带有切片的膜转移到另外 6 个膜上。用培养基进行孔板，保持膜顶部干燥，以便脑切片从下方接收培养基和从上方接收空气。
将切片放入 5% 二氧化碳、37 摄氏度的培养箱中。在解剖初始步骤后两小时内将切片放入培养箱中非常重要。这些切片可以在体外维持 3 到 4 天。
经过 4 到 5 小时的恢复。这些切片可以在成像之前用于延时成像。在培养皿中加入 1.5 微升 200 毫摩尔抗坏血酸，以保护切片免受光毒性。
在延时成像过程中，将切片在 37 摄氏度和 5% 二氧化碳的环境室中孵育。这是一个急性切片，显示了多巴胺能神经元在腹侧中脑的正常位置，其中对前脑的投射尚未发育。在培养一天后，如黄色箭头所示，开始形成对前脑的投射。
白色箭头表示在插图中以较高放大倍数显示的细胞体的位置。这是 YFP 标记神经元的迁移根。在急性水平切片中，单元格的初始位置用红色箭头标记。
看完这个视频，你应该对如何从 E 12.5 海洋胚胎中脑制备基因型切片以获得有活力和完整的切片有一个很好的了解。重要的是要仔细地进行胚胎脑解剖，并在振动切片后选择正确的脑切片进行培养和延时成像。
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
概述
本文描述了一种从E12.5小鼠胚胎中脑制备器官型切片的方法。这些培养物对于观察多巴胺能神经元和其他腹侧中脑神经元的行为非常有用。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 发育生物学
- 细胞培养技术
背景
- 器官型切片培养为研究神经元行为提供了一个平台。
- 多巴胺能神经元对于理解各种神经系统疾病至关重要。
- 胚胎中脑是研究神经元发育的关键区域。
- 延时成像允许对神经元过程进行实时观察。
研究目的
- 生成器官型切片以分析多巴胺能神经元发育。
- 观察神经元的迁移行为和分化。
- 利用先进的成像技术进行详细分析。
使用的方法
- 胚胎脑的解剖。
- 将大脑嵌入低熔点琼脂中。
- 使用振动切片仪切割大脑切片。
- 选择适合培养和成像的切片。
主要结果
- 成功从E12.5中脑生成器官型切片。
- 通过延时成像观察多巴胺能神经元行为。
- 洞察神经元的迁移模式和分化。
- 应用免疫荧光显微镜来可视化神经元特征。
结论
- 该方法为研究中脑神经元发育提供了一个有价值的工具。
- 延时成像增强了对神经元动力学的理解。
- 未来的研究可以在此方法基础上探索神经发育的各个方面。
常见问题
Executive Industry Relevance
Organotypic slice cultures of embryonic ventral midbrain enable direct observation of dopaminergic neuronal development, supporting mechanistic de-risking and target validation in neurodevelopmental research. This system provides predictive confidence for early-stage discovery by allowing manipulation and real-time imaging of neuronal subpopulations relevant to disease. The approach bridges a critical gap between genetic models and functional phenotyping, informing portfolio decisions in CNS drug discovery.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of dopaminergic neuron differentiation and migration in a controlled, manipulable system.
- Supports functional validation of genetic modifications using time-lapse imaging and fate mapping.
- Facilitates mechanistic de-risking by clarifying developmental pathways in disease-relevant neuronal populations.
- Provides a platform for hypothesis-driven studies on ventral midbrain organization and neuronal clustering.
Screening & Assay Development
- Prepares validated organotypic cultures suitable for quantitative imaging-based assays.
- Enables reproducible assessment of neuronal behaviors across experimental conditions.
- Supports standardization of imaging outputs for downstream compound evaluation.
- Allows scalable adaptation for screening genetic or pharmacological perturbations affecting neuronal development.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant systems by modeling dopaminergic neuron development implicated in neurodegenerative disorders.
- Provides continuity from genetic manipulation to phenotypic observation in preclinical models.
- Enables risk-adjusted advancement by linking developmental phenotypes to potential translational biomarkers.
- Supports predictive de-risking for CNS portfolio assets targeting developmental pathways.
Pipeline & Workflow Integration
This organotypic slice culture method integrates into the discovery continuum from early target validation through preclinical phenotyping, particularly for CNS and neurodevelopmental programs.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on neuronal differentiation and migration mechanisms in the ventral midbrain.
- Screening: Provides reproducible, quantitative imaging outputs for evaluating genetic or chemical interventions.
- Analytics: Enables time-lapse and immunofluorescence readouts to compare neuronal behaviors across conditions.
- Translational Research: Connects developmental phenotypes to disease-relevant neuronal populations for biomarker exploration.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable platform for diverse genetic backgrounds and experimental manipulations in CNS research.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in dopaminergic neuron development studies.
- Operational Value: Standardizes culture and imaging workflows for reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions by linking genetic manipulation to functional neuronal outcomes.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of CNS targets and developmental pathways.
Implementation Considerations
- Requires expertise in embryonic brain dissection and organotypic culture techniques.
- Demands access to advanced imaging infrastructure for time-lapse and immunofluorescence microscopy.
- Necessitates cross-team standardization of slice preparation and imaging protocols.
- Adaptation may be needed for different embryonic stages or brain regions.
- Viability and developmental fidelity depend on precise timing and handling during preparation.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:00
Preparation for Dissection
3:00
Embryonic Brain Preparation and Vibratome Sectioning
5:09
Slice Culture and Time-lapse Imaging
6:21
Results: Dopaminergic Neuronal Development in Organotypic Slice Cultures of Embryonic Ventral Midbrain
7:04
Conclusion
