胚胎腹侧中脑组织切片培养：一种体外研究多巴胺能神经元发育的体系 in vitro

本实验的总体目标是从 E 12.5 胚胎中脑神经元制备脑组织切片，用于分析发育中的多巴胺能神经元。首先解剖胚胎脑组织，随后将脑组织包埋于低熔点琼脂糖中以实现该目标。

第三步是使用振动切片机对脑组织进行切片。最后一步是选择合适的脑片用于培养和延时成像。最终，通过延时成像和免疫荧光显微镜技术，展示多巴胺能神经元的早期发育过程、迁移行为及其分化。

该方法有助于解答神经发育领域中的关键问题，例如在发育期腹侧脑组织中追踪神经元及其迁移行为。解剖前一天，根据随附的手稿在解剖前约两小时准备好一倍浓度的克氏缓冲液（X Krebs buffer）和培养基。通过微波加热的方式，将100毫升含4%低熔点琼脂糖（low melting aros）的克氏缓冲液加热至琼脂糖完全溶解。

然后将 aros 置于 45 摄氏度的水浴中。接着，用冰冻的 Krebs 缓冲液装满 Vibram 缓冲液托盘。打开冷却装置，并保持在 4 摄氏度。

随后，将剃须刀片固定在刀片架中。准备一把手术刀、一把细毛刷和一把微型带孔勺，用于在振动切片区域拾取切片以备后续切片使用。然后向无菌培养皿中加入Krebs缓冲液，并将其置于冰上保存。

在解剖区域，准备三个大型无菌培养皿用于解剖，两个小型无菌培养皿用于放置一把小剪刀、两把精细镊子、一把迷你带孔勺、一根经火焰抛光且带有圆形封闭尖端的玻璃巴斯德吸管，以及一升冰上预冷的Krebs缓冲液。用70%乙醇擦拭所有解剖工具。随后，在六孔板的各孔中加入培养基，并在37°C条件下孵育两小时。

接下来，在无菌条件下，向另一块六孔板的每个孔中加入 1.5 毫升含青霉素-链霉素的克雷布斯缓冲液。将微孔细胞培养插入物放入各孔中。将六孔板置于振动切片机旁，以便将脑片转移至滤膜上。

切片后立即处死一只处于E12.5时期的妊娠小鼠，用镊子提起子宫并将其取出。然后用另一把镊子将子宫肌层从子宫上撕离。随后，将子宫置于冰上预冷的Krebs缓冲液中，并放置于显微镜下。

使用精细镊子将子宫肌层、里克膜（Riker's membrane）和卵黄囊从胚胎上分离。然后将胚胎从子宫中取出，并转移至含有无菌克雷布斯缓冲液的独立培养皿中。接着，切除每个胚胎的头部。

用精细镊子在眼睛水平位置刺入头部以固定。用另一把镊子小心去除皮肤和颅骨。然后小心地将脑组织提起，并转移至含有无菌克雷布斯缓冲液的培养皿中。

随后，用4%低熔点琼脂糖洗涤脑组织。每次取两到三个脑组织，置于4%新鲜的低熔点琼脂糖中包埋。使用火焰抛光圆头的巴斯德移液管操作。

然后将包埋皿尽可能平放在冰上。接着抬起大脑，直至琼脂糖底部凝固，使大脑均匀沉降并与琼脂糖块底部保持平行。当琼脂糖完全凝固后，修整大脑周围多余的琼脂糖。

随后将脑组织块用胶固定在振动切片机的样品台上。固定组织块时，确保脑腹侧与平台平行。以50赫兹的刀片频率、1.1毫米的振幅和每秒25毫米的速度，切出厚度为300微米的水平切片。

使用细毛刷将脑切片推至微型带孔勺中进行收集，然后在显微镜下将其转移至含有无菌冰冻克雷斯缓冲液的培养皿中。选择含有腹侧中脑组织的切片。

在此步骤中，使用小型带孔小勺和细毛刷将脑片转移至六孔板中的Milli细胞膜插件上，六孔板内已预先加入Krebs缓冲液。接着，将带有脑片的膜转移至另一含培养基的六孔板中，保持膜的上表面干燥，以便脑片从下方获取培养基，从上方接触空气。

将切片置于含5%二氧化碳、37°C的培养箱中。在解剖初始步骤后的两小时内将切片放入培养箱中至关重要。这些切片可在体外维持3至4天。

恢复4到5小时后，可在成像前立即使用切片进行时间序列成像。向培养皿中加入1.5 µL 200 mmol/L抗坏血酸，以保护切片免受光毒性损伤。

在进行延时成像期间，将脑片置于37摄氏度、5%二氧化碳的培养箱中孵育。此处显示的是急性脑片，示出中脑腹侧多巴胺能神经元的正常位置，此时向端脑的投射尚未发育。培养1天后，向端脑的投射开始形成，如黄色箭头所示。

白色箭头指示插图中高倍放大所示细胞体的位置。此处为YFP标记神经元的迁移路径。在急性水平切片中，细胞的起始位置用红色箭头标出。

观看本视频后，您应能够充分掌握如何制备 E 12.5 小鼠胚胎中脑的基因型切片，以获得存活且结构完整的脑片。在操作过程中，需仔细进行胚胎脑组织的解剖，并在振动切片后谨慎挑选适合培养和延时成像的脑片。