在癌症的生产和检测活性氧（ROS）的

本实验的目的是检测细胞培养物中活性氧的存在。这是通过首先使用荧光染料检测活性氧来实现的。接下来，使用比色测定法测量细胞中一氧化氮的水平。

最后，通过使用发光测定法检测谷胱甘肽的还原或氧化来确定活性氧的影响。我叫 Danu。我是 Patrizia Yoda 实验室的海报，我将演示这个程序。

Carboxy H 2D CFDA 不发光，但在活性氧存在下，该试剂在使用前会立即被氧化并发出绿色荧光。在无菌 DMSO 或 100% 乙醇中制备羧基 H 2D CFDA 的新鲜储备溶液。用 HEPs 缓冲盐溶液或磷酸盐缓冲盐水洗涤细胞，以去除原始培养基的痕迹。

在该测定中，我们使用人白血病混蛋猫细胞系。离心后，处理掉 SUP 纳脱剂，将染料（终浓度为 1 微摩尔）加入含有减血清的常规培养基中，将培养物在避光中孵育 30 分钟，丢弃任何未使用的染料溶液。接下来，取出含有 Carbox CH 2D CFDA 的培养基，并用 HBSS 或 PBS 洗涤细胞两次。

将细胞转移到板中，从此步骤开始，保护细胞免受光线照射。然后将含有所选药物的新鲜培养基添加到所需的羧基 H 2D CFDA 负载细胞和培养箱中。在此示例中，我们使用 0.03% 的过氧化氢 1 小时。

对照细胞包括下载的未处理细胞和未染色的未处理细胞。通过使用流式细胞术分析细胞，立即评估 ROS。使用 FL 单通道，使用荧光读板器或通过荧光显微镜使用适合绿色荧光的激发和发射波长。

在开始此检测之前，请准备以下溶液。一种 nyl 乙二胺二盐酸盐或 NED 的 0.1% 溶液，用无菌水稀释。用 5% 磷酸稀释的 1% 硫酰酰胺溶液，并在无菌培养基中连续稀释亚硝酸钠，从 0.1 摩尔标准储备溶液开始，将 NED 和硫酰辅溶液储存在 96 孔板中 4 摄氏度的黑暗中培养细胞，每种条件一式三份，并适当对照。

在该实验中，为了诱导一氧化氮的产生，小鼠巨噬细胞原始 2 6 4 0.7 细胞用每毫升 100 纳克 LIPA 多糖或 LPS 和重组 IL 4 处理。要进行检测，请将两种试剂置于室温下，旋转板，收集细胞上清液，并将 50 μL 转移到新的 96 孔板中。然后准备标准储备液的有限稀释孔。

要制作标准曲线，向每个样品中加入 50 微升硫 IDE 溶液，并充分对照并充分混合。在黑暗中室温孵育 10 分钟。接下来，向每个样品中加入 50 微升 NED 溶液，并充分对照并混合。

将板在黑暗中再孵育 10 分钟。通过油脂分析，活性氧缝合器会迅速变化。因此，快速工作以防止丢失原始信号非常重要。立即使用滤光片波长在 520 纳米和 550 纳米之间的读板器测量吸光度，阳性孔中会出现紫色。

将结果与标准品进行比较，以检查溶液的稳定性，在测定前一天将细胞在 96 孔白色板中一式三份，第二天针对每种情况，用所选药物处理细胞所需的时间。在这个例子中，jca 和 a 5 49 个细胞分别用 5 毫摩尔和 2.5 毫摩尔的过氧化氢处理 1 小时。用每毫升 200 纳克 LPS 处理原始 2 6 4 0.7 细胞 16 小时。

从带有贴壁细胞的孔中取出培养基。如果细胞处于悬浮状态，请勿去除培养基。在进行检测前不超过 30 分钟。

制备还原和氧化的谷胱甘肽裂解试剂。将试剂添加到所需的孔中，摇晃 5 分钟。在室温下，加入荧光生成试剂，并在室温下孵育 30 分钟。

然后加入荧光检测试剂，并在室温下再孵育 15 分钟。最后，在积分计时器上读取生物发光信号。使用板每孔 0.25 到 1 秒，在此处读取光度计。

将用过氧化氢处理的 Jerk Out 细胞与未处理的细胞进行比较。活性氧诱导羧基 H 2D CFDA 的修饰，经事实检测时发出绿色荧光。结果证实了处理细胞中存在活性氧。

在这个例子中，用 LPS 和 IL 4 处理原始的 2 6 4 0.7 细胞。与对照未处理细胞相比，在处理过的细胞中检测到一氧化氮产生量显着增加。在这里，原始的 2 64 0.7 个细胞用 LPS 和 JCA 处理，一个 5 49 个细胞用过氧化氢处理。

结果表示为还原谷胱甘肽与氧化谷胱甘肽的比率。与对照未处理细胞相比，在处理细胞中检测到较低的谷胱甘肽比率，表明蛋白质是更氧化的处理细胞。观看此视频后，您应该对如何使用此分析检测 raw 有很好的了解。