Name: 在癌症的生产和检测活性氧（ROS）的 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-11-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 17 s
Description: 学习使用荧光染料、比色法和发光法检测细胞培养物中的活性氧（ROS），评估氧化应激水平并测定一氧化氮和谷胱甘肽状态。该方法适用于细胞生物学和氧化应激研究。

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本工作由美国国立卫生研究院（CA142664）资助。

1. 使用羧基-H2DCFDA 检测活性氧
Carboxy-H2DCFDA 本身无荧光，但在活性氧（ROS）存在时，该试剂被氧化后会发出绿色荧光。
<ol>
 <li>使用前立即配制新鲜的羧基-H储备液2将 DCFDA 溶于无菌二甲基亚砜（DMSO）或 100% 乙醇中。避免染料反复冻融。</li>
 <li>用HEPES缓冲盐溶液（HBSS）或磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞，以去除残留的原始培养基。</li>
 <li>用染料（以及对照染料，参见注释部分）对细胞进行负载。在本实验中，我们使用了Jurkat细胞，一种人类白血病细胞系。使用羧基-H2终浓度为的DCFDA 1μM 在含低血清（2%）的常规培养基中</li>
 <li>在常规培养箱中避光孵育培养物 30 分钟，37°C，5% CO₂）。弃去所有未使用的染料溶液。</li>
 <li>去除羧基-H2含DCFDA的培养基中孵育，并用HBSS或PBS洗涤两次。从这一步开始，需避免细胞暴露于光照下。</li>
 <li>向羧基-H中加入含有你所选药物的新鲜培养基2DCFDA 负载的细胞并按需要进行孵育。本示例中我们使用 H2O2 （0.03%）1小时。</li>
 <li>通过流式细胞术（使用FL1通道，绿色荧光）、荧光酶标仪或荧光显微镜立即分析细胞以检测活性氧（ROS）。可采用适合绿色荧光的激发波长和发射波长检测荧光信号。</li>
</ol>
注意：对照组应包括负载羧基-H2DCFDA的未处理细胞和未染色的未处理细胞。已知羧基-H2DCFDA可用于检测过氧化物，但也可能被其他活性氧（ROS）氧化。该试剂还可能通过其他途径被修饰，因此实验中应包含对氧化不敏感的对照染料，例如5-(和6)-羧基-2',7'-二氯荧光素二乙酸酯（carboxy-DCFDA）。
2. 一氧化氮（NO）生成量的测定
您需要磺胺酰胺（Sulfanilamide）和N-1-萘乙二胺二盐酸盐（NED）溶液，以及亚硝酸盐标准品。该检测称为格里斯（Griess）检测。
NED 溶液：将盐酸萘乙二胺配制成 0.1% 的溶液，用无菌水稀释。磺胺溶液：将磺胺酰胺配制成 1% 的溶液，用 5% 磷酸稀释。亚硝酸盐标准品：将 0.1 M 的亚硝酸钠标准储备液用无菌培养基稀释至 100 μM，并在相同培养基中进行系列稀释。
储存条件：按照生产商的指示在室温下储存化学品。NED 和磺胺溶液在重新配制后，使用完毕应立即于 4°C 避光保存，最多可保存 3 个月。
<ol>
 <li>将细胞接种于96孔板中，每种实验条件设三个复孔，并根据实验需求设置适当的对照组。</li>
 <li>对细胞进行处理以诱导一氧化氮（NO）的产生。在本实验中，我们使用脂多糖（LPS）（100 ng/ml）和重组IL-4处理细胞。本方案中使用的细胞为RAW 264.7，一种小鼠巨噬细胞系（小鼠白血病单核巨噬细胞系）。</li>
 <li>检测当天，将两种试剂恢复至室温。</li>
 <li>离心收集细胞上清液，取50μl转移至新的96孔板中。对标准品储备液进行倍比稀释，制备标准曲线用各稀释孔。</li>
 <li>向每个样品孔和对照孔中加入50μl磺胺溶液，并充分混匀。</li>
 <li>在避光条件下室温孵育10分钟。</li>
 <li>向每个样品孔和对照孔中加入50μl N-1-萘基乙二胺盐酸盐溶液，并充分混匀。</li>
 <li>在避光条件下室温孵育10分钟。</li>
 <li>立即使用酶标仪在波长520 nm至550 nm的滤光片下测定吸光度。</li>
</ol>
如果使用不同规格的培养板/培养皿，请对每种溶液和样品上清液使用等体积（1/1/1）添加量。
阳性孔中会出现紫色。通过标准品获得的结果可帮助您检查溶液的稳定性。
3. 活性氧作用的检测：氧化蛋白
检测活性氧（ROS）生成的另一种方法是通过检测蛋白质的氧化来观察其最终结果。事实上，ROS 会修饰谷胱甘肽（glutathione），这是一种在大多数细胞中表达的抗氧化剂，具有抵御 ROS 的保护作用。在被 ROS 氧化后，还原型谷胱甘肽（GSH）发生修饰，其半胱氨酸残基上的巯基（硫醇基团）通过二硫键与另一个谷胱甘肽分子连接，从而形成二聚体蛋白（氧化型谷胱甘肽 GSSG）。GSSG 可通过谷胱甘肽还原酶的作用重新转化为 GSH。GSSG/GSH 比值的升高反映了氧化应激水平。以下实验基于对这些氧化型蛋白的检测与定量。该方法并不特异性识别某一种 ROS，而是检测一氧化氮（NO）、过氧化氢（H2O2）、超氧阴离子（O2-）及其他 ROS 的总体效应。本实验通过生物发光信号测定总氧化型（GSSG）和还原型（GSH）谷胱甘肽的含量。
<ol>
 <li>将细胞以常规方法接种于96孔板（白色/透明，平底）中。在本实验中，我们对贴壁的Raw 264.7和A549细胞以及悬浮的Jurkat细胞每孔接种1×104个细胞。根据细胞大小，可适当调整接种数量。建议在检测前一天接种贴壁细胞，以便细胞充分贴附。应准备足够数量的孔，用于检测氧化和还原态蛋白，并设置“仅培养基”和未处理细胞作为对照。所有条件均需设置三个复孔。</li>
 <li>按照所需时间用药物处理细胞。本实验中，Jurkat细胞和A549细胞分别用5 mM和2.5 mM的H2O2处理1小时，Raw 264.7细胞则用200 ng/ml的LPS处理16小时。在孵育期间，将所有试剂恢复至室温（RT）。所有试剂应在检测前不超过30分钟内配制。下表列出了每孔所需试剂的体积。进行检测前，应尽可能去除含有还原剂的培养基。</li>
</ol>
<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td rowspan="2"> </td>
 <td colspan="2">贴壁细胞</td>
 <td colspan="2">悬浮细胞</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>总谷氨酸裂解</td>
 <td>氧化型谷氨酸裂解</td>
 <td>总谷氨酸裂解</td>
 <td>氧化型谷氨酸裂解</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>NEM, 25mM</td>
 <td>无</td>
 <td>0.5μl</td>
 <td>无</td>
 <td>0.5μl</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Luciferin-NT</td>
 <td>1 μl</td>
 <td>1 μl</td>
 <td>1 μl</td>
 <td>1 μl</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Passive Lysis Buffer, 5X</td>
 <td>10μl</td>
 <td>10μl</td>
 <td>10μl</td>
 <td>10μl</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>蒸馏水</td>
 <td>39.0μl</td>
 <td>38.5μl</td>
 <td>14μl</td>
 <td>13.5μl</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>最终体积 每孔</td>
 <td>50μl</td>
 <td>50μl</td>
 <td>25μl</td>
 <td>25μl</td>
 </tr>
 </tbody>
</table>
<ol start="3">
 <li>移除贴壁细胞孔中的培养基。悬浮细胞孔中的培养基不要移除。</li>
 <li>向相应的孔中加入还原型谷胱甘肽裂解试剂或氧化型谷胱甘肽裂解试剂，在室温下震荡5分钟。</li>
 <li>加入荧光素生成试剂，室温孵育30分钟。</li>
 <li>加入荧光素检测试剂，室温孵育15分钟。</li>
 <li>使用酶标仪 luminometer，以每孔0.25-1秒的积分时间读取生物发光信号。</li>
</ol>
<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>
 </td>
 <td>
 贴壁细胞</td>
 <td>
 悬浮细胞</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>每孔细胞数量</td>
 <td>1x104</td>
 <td>1x104</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>每孔细胞悬液+药物</td>
 <td>100 μl，3.4 步骤前需移除</td>
 <td>25 μl，无需移除</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>还原型谷胱甘肽裂解试剂</td>
 <td>50 μl</td>
 <td>25 μl</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>氧化型谷胱甘肽裂解试剂</td>
 <td>50 μl</td>
 <td>25 μl</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>荧光素生成试剂</td>
 <td>50 μl</td>
 <td>50 μl</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>荧光素检测试剂</td>
 <td>100 μl</td>
 <td>100 μl</td>
 </tr>
 </tbody>
</table>
4. 代表性结果：
<img alt="流式细胞术图谱，绿色荧光比较，对照组与处理组，数据分析。" src="/files/ftp_upload/3357/3357fig1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图1"> 
图1 使用羧基-H2DCFDA染料检测活性氧（ROS）。经H2O2处理的Jurkat细胞（人白血病细胞系）与未处理细胞进行比较。活性氧（ROS）可诱导羧基-H2DCFDA发生修饰，产生绿色荧光，通过流式细胞术检测到该荧光信号。与对照组（使用氧化不敏感染料染色的H2O2处理细胞，以及使用羧基-H2DCFDA染色的未处理细胞）相比，H2O2处理组细胞的荧光峰发生偏移。结果证实了处理组细胞中存在活性氧（ROS）。
<img alt="LPS和IL-4处理样本中NO浓度（μM）随时间（8、16、24小时）变化的柱状图。" src="/files/ftp_upload/3357/3357fig2.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图2"> 
图2 使用Griess试剂检测NO。将RAW 264.7细胞（小鼠巨噬细胞）用LPS和IL-4处理。与未处理的对照组细胞相比，处理组细胞中NO的生成显著增加。
<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>
 细胞系</td>
 <td>
 未处理</td>
 <td>
 处理后</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Raw 264.7</td>
 <td>13.0</td>
 <td>8.3</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>A549</td>
 <td>21.6</td>
 <td>10.5</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Jurkat</td>
 <td>5.2</td>
 <td>2.8</td>
 </tr>
 </tbody>
</table>
表1 蛋白质经活性氧介导氧化的检测。RAW 264.7 细胞经 LPS 处理，Jurkat 细胞和 A549（人肺癌）细胞经 H2O2 处理。结果以还原型谷胱甘肽（GSH）与氧化型谷胱甘肽（GSSG）的比值表示。与未处理的对照细胞相比，处理细胞中谷胱甘肽（GSH）/（GSSG）比值更低，表明处理细胞中的蛋白质氧化程度更高。

<ol><li>Guzik, T. J., Korbut, R., Adamek-Guzik, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nitric+oxide+and+superoxide+in+inflammation+and+immune+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Nitric oxide and superoxide in inflammation and immune regulation.</a> J Physiol Pharmacol. 54, 469-487 (2003).</li>
<li>Perl, A., Gergely, P., Banki, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+dysfunction+in+T+cells+of+patients+with+systemic+lupus+erythematosus%5BTitle%5D)+AND+%22Int+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial dysfunction in T cells of patients with systemic lupus erythematosus.</a> Int Rev Immunol. 23, 293-313 (2004).</li>
<li>Valko, M., Leibfritz, D., Moncol, J., Cronin, M. T., Mazur, M., Telser, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Free+radicals+and+antioxidants+in+normal+physiological+functions+and+human+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Biochem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Free radicals and antioxidants in normal physiological functions and human disease.</a> Int J Biochem Cell Biol. 39, 44-84 (2007).</li>
<li>Droge, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Free+radicals+in+the+physiological+control+of+cell+function%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Free radicals in the physiological control of cell function.</a> Physiol Rev. 82, 47-95 (2002).</li>
<li>Nakamura, K., Yube, K., Miyatake, A., Cambier, J. C., Hirashima, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Involvement+of+CD4+D3-D4+membrane+proximal+extracellular+domain+for+the+inhibitory+effect+of+oxidative+stress+on+activation-induced+CD4+down-regulation+and+its+possible+role+for+T+cell+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Immunol%22%5BJournal%5D)">Involvement of CD4 D3-D4 membrane proximal extracellular domain for the inhibitory effect of oxidative stress on activation-induced CD4 down-regulation and its possible role for T cell activation.</a> Mol Immunol. 39, 909-921 (2003).</li>
<li>Los, M., Droge, W., Stricker, K., Baeuerle, P. A., Schulze-Osthoff, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrogen+peroxide+as+a+potent+activator+of+T+lymphocyte+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Hydrogen peroxide as a potent activator of T lymphocyte functions.</a> Eur J Immunol. 25, 159-165 (1995).</li>
<li>Deem, T. L., Cook-Mills, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascular+cell+adhesion+molecule+1+%28VCAM-1%29+activation+of+endothelial+cell+matrix+metalloproteinases%3A+role+of+reactive+oxygen+species%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Vascular cell adhesion molecule 1 (VCAM-1) activation of endothelial cell matrix metalloproteinases: role of reactive oxygen species.</a> Blood. 104, 2385-2393 (2004).</li>
<li>Pacher, P., Beckman, J. S., Liaudet, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nitric+oxide+and+peroxynitrite+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Nitric oxide and peroxynitrite in health and disease.</a> Physiol Rev. 87, 315-424 (2007).</li>
<li>Griendling, K. K., Sorescu, D., Lassegue, B., Ushio-Fukai, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+protein+kinase+activity+and+gene+expression+by+reactive+oxygen+species+and+their+role+in+vascular+physiology+and+pathophysiology%5BTitle%5D)+AND+%22Arterioscler+Thromb+Vasc+Biol%22%5BJournal%5D)">Modulation of protein kinase activity and gene expression by reactive oxygen species and their role in vascular physiology and pathophysiology.</a> Arterioscler Thromb Vasc Biol. 20, 2175-2183 (2000).</li>
<li>Loh, K., Deng, H., Fukushima, A., Cai, X., Boivin, B., Galic, S., Bruce, C., Shields, B. J., Skiba, B., Ooms, L. M., Stepto, N., Wu, B., Mitchell, C. A., Tonks, N. K., Watt, M. J., Febbraio, M. A., Crack, P. J., Andrikopoulos, S., Tiganis, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reactive+oxygen+species+enhance+insulin+sensitivity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metab%22%5BJournal%5D)">Reactive oxygen species enhance insulin sensitivity.</a> Cell Metab. 10, 260-272 (2009).</li>
<li>Goldstein, B. J., Mahadev, K., Wu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Redox+paradox%3A+insulin+action+is+facilitated+by+insulin-stimulated+reactive+oxygen+species+with+multiple+potential+signaling+targets%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Redox paradox: insulin action is facilitated by insulin-stimulated reactive oxygen species with multiple potential signaling targets.</a> Diabetes. 54, 311-321 (2005).</li>
</ol>

本出版物得到了普洛麦格（Promega）的支持。

多种病理状况（如炎症性疾病、癌症、缺血/再灌注损伤）以及某些治疗手段（如放射治疗或化疗，即顺铂）均可诱导活性氧（ROS）的过度产生。因此，在许多基础研究、临床前研究和临床研究中，检测和测定ROS水平具有重要意义。然而，ROS的半衰期极短，检测较为困难。本文介绍几种常规使用且被广泛认可的检测哺乳动物细胞自由基生成的简单方法。
使用染料的检测方案可使实验人员采用多种广泛可用的方法（如显微镜、流式细胞术、酶标仪等）&hellip;.) 来检测活性氧（ROS）的存在。流式细胞术和显微镜技术可提供有关细胞活力以及无ROS、低ROS和高ROS产生细胞所占百分比的信息。显微镜还可提供ROS对细胞形态和细胞黏附影响的相关信息。使用酶标仪进行检测主要获得定量数据。Griess法检测一氧化氮（NO）具有定量性，但无法提供所研究细胞形态或黏附状态的任何信息。在小鼠细胞中，NO的检测相对简单。然而，在人源样本中NO含量较低，因此在检测过程的每一步都必须更加谨慎，并设置适当的对照。蛋白质氧化检测用于评估被研究细胞所产生的所有ROS的总体效应；此处获得信号强度代表了ROS的生成量。H₂O₂的检测2...

<table><tbody><tr><td>5-(和-6)-羧基-2&amp;rsquo;,7&amp;rsquo;-二氯荧光素二乙酸酯（carboxy-DCFDA）</td><td>Molecular Probes, Life Technologies</td><td>C369</td><td>对照</td></tr><tr><td>carboxy-H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;DCFDA</td><td>Molecular Probes, Life Technologies</td><td>C400</td><td></td></tr><tr><td>磺胺</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9251-100G</td><td></td></tr><tr><td>盐酸萘乙二胺</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N9125-10G</td><td></td></tr><tr><td>亚硝酸盐标准品</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>237213-100G</td><td></td></tr><tr><td>GSH/GSSG-Glo 检测试剂盒</td><td>Promega Corp.</td><td>V6612</td><td>用于定量氧化型、还原型或氧化/还原型谷胱甘肽</td></tr></tbody></table>

癌症中活性氧（ros）的产生与检测

Production and Detection of Reactive Oxygen Species (ROS) in Cancers

活性氧包括多种能够损伤DNA和RNA，并氧化蛋白质和脂质（脂质过氧化）的分子。这些活性分子均含有氧，包括H2O2（过氧化氢）、NO（一氧化氮）、O2-（超氧阴离子）、过氧亚硝酸根（ONOO-）、次氯酸（HOCl）以及羟基自由基（OH-）。
氧化物质不仅在病理状态下产生（如癌症、缺血/再灌注、神经和心血管疾病、感染性疾病、炎症性疾病）， 1，自身免疫性疾病 2等&hellip;但也在细胞代谢等生理（非病理）情况下发生 3, 4。事实上，活性氧（ROS）在许多细胞信号通路（如增殖、细胞活化）中发挥着重要作用 5, 6迁移 7 等）。当细胞内区室中产生大量活性氧时，可能对细胞造成损害（此时称为“氧化和亚硝化应激”），细胞通常通过上调抗氧化物质来应对，例如超氧化物歧化酶（SOD）和过氧化氢酶（CAT）、谷胱甘肽过氧化物酶（GPx）以及谷胱甘肽（GSH），这些物质通过将有害的自由基转化为无害分子（如水）来保护细胞。维生素C和E也被描述为活性氧清除剂（抗氧化剂）。
少量自由基对人体有益3。巨噬细胞和中性粒细胞介导的免疫反应涉及一氧化氮（NO）的生成和释放，NO可抑制病毒、病原体以及肿瘤细胞的增殖8。NO还可与其他活性氧（ROS）发生反应，因此也具有解毒作用（作为活性氧清除剂）。最后，NO作用于血管以调节血流，这对肌肉适应长时间运动至关重要9, 10。多项研究还表明，活性氧参与胰岛素敏感性的调节11, 12。
目前有多种方法可用于评估活性氧（ROS）的产生。本文介绍几种简单、快速且经济的检测方法；这些方法已被大量文献验证，并常规用于检测哺乳动物细胞中的活性氧或其效应。其中一些检测方法可识别多种活性氧，而另一些则仅针对单一活性氧。

本文提出了一些简单的方法，用于检测和评估细胞中活性氧的存在。

癌症中活性氧（ROS）的产生与检测

活性氧包括多种可损伤DNA和RNA，并氧化蛋白质和脂质（脂质过氧化）的分子。这些活性……

本实验的目的是检测细胞培养物中活性氧的存在。首先使用荧光染料检测活性氧，然后采用比色法测定细胞中一氧化氮的水平。最后，通过使用发光检测法测定谷胱甘肽的还原或氧化状态，来确定活性氧物种的作用。我叫Danu，是Patrizia Yoda实验室的一名研究人员，我将演示这一实验步骤。羧基 H 2D CFDA 本身无荧光，但在存在活性氧物种时，该试剂会被氧化，并立即发出绿色荧光。使用前，用无菌 DMSO 或 100% 乙醇配制新鲜的羧基 H 2D CFDA 储存液。用 HEPES 缓冲盐溶液或磷酸盐缓冲液洗涤细胞，以去除残留的原始培养基。在此实验中，我们使用人白血病 jerk cat 细胞系。离心后弃去上清液，将细胞用染料在含低血清的常规培养基中以终浓度一微摩尔（1 µM）进行负载，在普通培养箱中避光孵育 30 分钟，弃去未使用的染料溶液。接着，移除含有羧基 CH2DCFDA 的培养基，并用 HBSS 或 PBS 洗涤细胞两次。将细胞转移至培养板，从这一步开始，避免细胞暴露于光照下。随后向负载了羧基 H 2D CFDA 的细胞中加入含有选定药物的新鲜培养基，并放入所需的培养箱中。在本示例中，我们使用 0.03% 过氧化氢处理一小时。对照细胞包括未处理的下载细胞和未染色的未处理细胞。立即通过流式细胞术分析细胞以评估ROS。使用FL1通道，或使用荧光酶标仪，或采用适合绿色荧光的激发和发射波长通过荧光显微镜进行检测。在开始本实验之前，配制以下溶液：将 N-乙二胺二盐酸盐（NED）溶于无菌水中，配制成 0.1% 的溶液；将磺胺溶于 5% 磷酸中，配制成 1% 的溶液；用无菌培养基对亚硝酸钠进行系列稀释，起始浓度为 0.1 摩尔的标准储备液。将 NED 溶液和磺胺溶液置于 4°C 避光保存。在 96 孔板中培养细胞，每种条件设三个复孔，并设置适当的对照组。在本实验中，为诱导一氧化氮产生，将小鼠巨噬细胞 RAW 264.7 细胞用 100 纳克/毫升的 LIPA 多糖或 LPS 以及重组 IL-4 进行处理。进行检测时，先将两种试剂恢复至室温，离心培养板，收集细胞上清液，并转移 50 微升至新的 96 孔板中。然后对标准品储备溶液进行系列稀释制备。 为制作标准曲线，在每个样品孔和对照孔中加入 50 µL 硫代 IDE 溶液，充分混匀。室温避光孵育 10 分钟。接着，在每个样品孔和对照孔中加入 50 µL NED 溶液，混匀。将酶标板在避光条件下继续孵育10分钟。在油脂检测中，活性氧物种的反应迅速发生变化，因此需快速操作，以防止原始信号丢失。立即使用酶标仪测定吸光度，滤光波长设置在520纳米至550纳米之间，阳性孔中将出现紫色。将结果与标准品进行比较，以检测溶液的稳定性。在测定前一天，将每种条件下的细胞以每孔三个复孔接种于96孔白色培养板中。次日，用选定的药物按所需时间处理细胞。本

production-and-detection-of-reactive-oxygen-species-ros-in-cancers

Research

科研

JoVE Journal

Medicine

医学

在癌症的生产和检测活性氧（ROS）的

本视频介绍了使用2',7'-二氯二氢荧光素二乙酸酯（DCFH-DA）检测细胞内总活性氧（ROS）的实验方案。该方法可通过荧光显微镜观察贴壁细胞中活性氧的定位，并利用荧光酶标仪进一步定量活性氧的荧光强度。...

使用DCFH-DA染色法检测活性氧：测定结直肠癌细胞系中的总活性氧水平

细胞内活性氧（ROS）已被证明在细胞衰老的诱导过程中发挥重要作用。本文介绍了一种用于定量细胞衰老过程中ROS水平的高灵敏度检测方法。同时，我们还提供了检测衰老相关分泌表型的实验方案，该表型据称与多种与年龄相关的功能障碍有关。...

正常人成纤维细胞在癌基因诱导衰老过程中活性氧与衰老相关分泌表型的定量检测

我们介绍一种非侵入性的体内成像方案，该方案流程简化且成本效益高，利用化学发光的鲁米诺类似物L-012，对小鼠全层皮肤缺损伤口模型中产生的活性氧（ROS）进行可视化和定量分析。...

体内成像小鼠伤口模型中的活性氧

本研究展示了如何使用流式细胞术检测由 FcγR 激活引发的活性氧（ROS）产生。该方法可用于评估吞噬细胞在免疫复合物、调理微生物或直接 FcγR...

流式细胞术检测FcγR交联诱导的巨噬细胞ROS产生

我们描述了一种利用多参数流式细胞术检测小鼠健康造血干细胞和祖细胞（HSPCs）以及由MLL-AF9驱动的急性髓系白血病（AML）小鼠模型中白血病细胞线粒体活性氧（ROS）的方法。...

小鼠造血干细胞与祖细胞及MLL-AF9驱动型白血病中线粒体活性氧的流式细胞术分析

本文介绍了一种利用2',7'-二氯二氢荧光素二乙酸酯（DCFH-DA）检测细胞内总活性氧（ROS）的实验方案。该方法可通过荧光显微镜观察贴壁细胞中活性氧的定位，并利用荧光酶标仪对活性氧水平进行定量分析。本方案操作简便、高效且成本较低。...

通过2',7'-二氯二氢荧光素二乙酸酯染色法检测贴壁细胞中的总活性氧物种

本实验方案的目的是在小鼠皮肤中诱导产生非致死水平的活性氧（ROS），从而进一步促进组织中的生理反应。...

通过可切换的原卟啉IX依赖性原位活性氧生成刺激小鼠皮肤干细胞微环境及组织再生

本文提出了一种系统化、易于操作且可重复的实验方案，用于通过2′,7′-二氯荧光素二乙酸酯探针（DCFH-DA）检测穆勒胶质细胞（MGCs）中的细胞内活性氧（ROS）。该方法利用流式细胞仪对细胞内总活性氧水平进行定量分析。本方案操作简便，适用性强，且具有良好的可重复性。...

使用2′,7′-二氯荧光素二乙酸酯探针和流式细胞术定量穆勒胶质细胞中的活性氧物种

本文介绍一种用于实时检测水稻组织在病原体相关分子模式触发的免疫反应中胞外空间活性氧（ROS）产生的方法。该方法操作简便、标准化程度高，在受控条件下可获得高度可重复的实验结果。...

利用化学发光法实时检测水稻免疫反应中的活性氧产生

本方案描述了一种利用二氢乙啶（DHE）作为荧光染料探针，通过高通量筛选方法定量检测细胞内活性氧（ROS）的新方法。该方案详细介绍了在三种不同的人肝细胞癌细胞系中定量评估细胞内活性氧（ROS）的实验方法。...

使用二氢乙啶（DHE）荧光染料高通量筛选评估活性氧（ROS）的生成

学习使用荧光染料、比色法和发光法检测细胞培养物中的活性氧（ROS），评估氧化应激水平并测定一氧化氮和谷胱甘肽状态。该方法适用于细胞生物学和氧化应激研究。

癌症中活性氧（ROS）的产生与检测

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