追踪细胞命运 大肠杆菌 λ噬菌体感染后

本实验的总体目标是利用荧光显微镜实时追踪λ噬菌体感染大肠杆菌后其中硫酸盐的变化。首先制备λ噬菌体的粗裂解液，然后纯化噬菌体，并在离心管中用λ噬菌体感染大肠杆菌。

继续在显微镜下观察细菌细胞的命运。最终，该结果可实时显示大肠杆菌中不同的细胞命运，这些差异通过与细胞生长或死亡相关的不同荧光蛋白的表达来呈现。通常，该方法的一个关键步骤在于制备纯净的前体并标记FI储备液。

为避免在制备和纯化过程中发生噬菌体共享，还需在显微镜下优化成像参数，以促进健康细胞的接种生长。将 E392 λLZ1 PPL* D 菌株的过夜培养物以约 0.6 的 OD600 细胞密度接种至 LBM 培养基中，并在 42 °C 水浴摇床中诱导溶原化。

在37摄氏度下继续孵育，直至裂解现象明显。此时培养物会变得澄清。加入2%氯仿，然后在室温下孵育15分钟。

接下来，将噬菌体裂解液转移至250毫升瓶中，并对培养物进行离心。然后收集含有噬菌体颗粒的上清液，并按照标准噬菌体滴定方案进行第二次离心，以去除可见的碎片。测定噬菌体浓度，再通过氯化铯梯度纯化噬菌体，并采用DPI检测其活性，以制备aro平板。

用70%乙醇清洁六张载玻片。将其中五张载玻片按图示排列，并用胶带固定。然后将含有1.5% aros的培养基溶液倒入固定好的载玻片上。

将最后一张载玻片置于顶部，小心避免产生气泡。放置重物压紧，使AROS冷却约30分钟。移除侧面的四张载玻片，用保鲜膜包裹载玻片块进行封装。

以转化细菌的过夜培养物作为接种物，在LBMM中培养细菌，取一毫升菌液进行沉淀，并用20微升预冷的LBMM重悬细胞，使用宽口吸头操作。

加入20 µL纯化的噬菌体。轻轻混匀，先在冰上孵育30分钟，以使噬菌体吸附。随后在35 °C水浴中孵育5分钟。

为诱导噬菌体DNA注入，通过混匀分散任何细胞聚集体。将混合物按1:10比例稀释至LBMM中。然后放置一块LBM琼脂平板。

在盖玻片上加入一微升噬菌体细胞混合液。待其吸附后，轻柔地将另一张盖玻片覆盖在上方。首先通过YFP通道采集初始时间点的图像序列。

在 Z 轴方向以 200 纳米的间隔采集一系列 15 张图像。此外，通过相差和 mCherry 通道各采集一张聚焦清晰的单张图像。然后对感染后的细胞命运进行延时成像。

为在延时成像过程中尽量减少光漂白和光毒性，每个时间点的每个通道仅采集一个Z平面图像，以相差、YFP和mCherry通道对样品进行成像，时间间隔为10分钟，持续约4小时。图像分析开始时，首先手动计数噬菌体，并记录噬菌体位置及细胞长度。在初始时间范围内，记录细胞的命运状态：裂解、溶原或未感染。

还可以通过播放延时电影记录裂解时间及其他所需信息，并利用自动细胞识别和谱系追踪算法，提取单个细胞随时间变化的荧光强度等更定量的信息。通常，荧光标记噬菌体形成的噬斑明显小于野生型噬菌体，且成功纯化的噬菌体的YFP与DAPI信号共定位。这些数据整合了相差、YFP和mCherry通道的图像集，以及来自延时电影的相应叠加图像。

在初始时间点可以清楚地观察到单个噬菌体。此处可见两个细胞各自被一个噬菌体感染，另一个细胞被三个噬菌体感染。通常，可在细胞表面观察到一定数量的噬菌体，而其他噬菌体则尚未被吸附。

随着时间推移，感染结果逐渐变得可区分。80分钟后，被单个噬菌体感染的两个细胞均已进入裂解途径。而被三个噬菌体感染的细胞则因前启动子驱动mCherry的表达，已进入溶原途径。

观看本视频后，您应充分了解如何制备纯化的噬菌体储备液，以λ噬菌体感染大肠杆菌，并在显微镜下实时进行生活周期成像。