细胞脂质提取用于靶向稳定同位素稀释液相色谱-质谱分析

该方法旨在通过稳定同位素稀释、正相液相色谱、电子捕获、大气压化学电离与质谱联用技术，精确测定细胞中生物活性脂质代谢物。首先收集培养基和细胞样品，并加入同位素标记的内标混合物。使用有机溶剂提取生物活性脂质，随后用电子捕获试剂对生物活性脂质进行衍生化，再通过液相色谱精确测定其含量。

通过液相色谱-质谱（LCMS）分析细胞裂解液和培养基，可精确定量目标生物活性脂质的浓度以及各单个Anant ER的水平。与反相液相色谱、质谱及其他LCMS方法等现有技术相比，该技术的主要优势在于，利用手性正相色谱结合稳定同位素稀释法，能够准确量化各个异构体及对映体。所得数据可为细胞内发挥功能的酶促代谢途径提供重要见解。

对于每个10厘米的培养皿中的贴壁细胞，用10毫升玻璃离心管收集3毫升培养基。接着，用PBS洗涤细胞两次。然后加入1毫升PBS，将细胞从培养皿上刮下，并将样品转移至第二个10毫升玻璃离心管中。

准备另外8个含有三毫升磷酸盐缓冲液（PBS）的试管，用于制作标准曲线。然后向每支试管中加入10微升相应的校准标准品。将收集的三毫升细胞培养上清液样品依次排列，用于游离生物活性脂质的提取。

向每个校准标准品和样品中加入10微升内标混合液，在室温下平衡10分钟，然后加入五毫升二乙醚处理样品，并置于摇床上振荡30分钟。离心样品后，将上层有机相转移至10毫升玻璃离心管中。在氮气下继续干燥样品。首先，通过离心收集收获的细胞样品，并将每个沉淀物用涡旋振荡器重悬于2毫升磷酸盐缓冲液（PBS）中。每个样品保留25微升用于细胞裂解液的归一化处理。

现在将每份裂解液均分至10毫升玻璃离心管中。向每个样品中额外加入2毫升PBS和10微升内标物（ISM），以测定游离细胞脂质；为避免前列腺素等脂质发生碱性降解，请取每份样品的平行样之一，进行如前所述的二乙基醚萃取。为了提取酯化脂质，向其余每个样品中加入5毫升氯仿-甲醇混合液。

将样品置于摇床，低速振荡30分钟，然后离心10分钟。收集下层有机相，用氮气吹干样品以皂化酯化脂质。向每根试管中加入0.5毫升0.4当量的氢氧化钾甲醇溶液（80%甲醇）。

将样品在 60 摄氏度下孵育一小时。然后加入两毫升 PBS，并用浓盐酸调节 pH 至 2–6。最后，向每个样品中加入 10 微升 ISM，接着对干燥后的样品和校准标准品进行二乙醚萃取。

按指定顺序加入衍生化试剂。然后涡旋混合样品，并在60摄氏度下孵育1小时。随后，在储存和分析前，将样品在氮气下吹干。

该方法结合了稳定同位素稀释、手性液相色谱、电子捕获、大气压化学电离和质谱分析技术。用 100 微升正己烷-乙醇溶液重悬样品和校准标准品，并将全部样品转移至带有内插管的 HPLC 小瓶中，然后将样品置于冷藏自动进样器中。创建样品分析列表。

接下来，使用随附书面方案中表一和表二所述的参数，设置用于正相分离的高效液相色谱（HPLC）和质谱（MS）方法。安装手性色谱柱，将DH柱温度升至30摄氏度，进样并开始运行。然后将质谱仪设为负离子模式，使用APCI离子源。

首先使用正己烷空白样品平衡色谱柱。随后，按照SM浓度递增的顺序进样校准标准品样品。在完成HBLC分离后，继续处理培养基的待测样品。

在色谱柱后添加甲醇以避免在电晕针上沉积。利用标准品生成的数据，绘制校准曲线，以样品峰面积为Y轴，标准品浓度为X轴，推导出Y等于MX加B的方程。

最后，测定细胞裂解液中生物活性脂质的待测样品浓度。通过将测得的生物活性脂质浓度除以每孔细胞数或前步归一化的总蛋白量，对这些数值进行归一化处理。多反应监测数据表明存在多种亚油酸和花生四烯酸代谢物。

氧化代谢物。13 和 9 位的代谢物，以及相应的 13 和 9 位 Oxo-ODE，均来源于亚油酸。此外，如预期一样，也存在花生四烯酸的 HETE 代谢物及其氧化产物。

与未标记的标准品相比，氘代内标在保留时间上存在微小偏移。重要的是，本方案还可分离由花生四烯酸经酶促氧化或与活性氧反应所产生的各种立体异构体，并为这些立体异构体确定各自独特的质谱跃迁离子对。例如，该色谱图展示了5号化合物R型与S型立体异构体之间的分离情况。

热脂质组学分析是一种用于分析多种脂质种类的强大技术。例如，本实验可评估并定量前列腺素、异前列腺素和白三烯B4。除了羟基二十碳四烯酸和氧代二十碳四烯酸以及ω-羟基化代谢物外，该方法还可优化用于从其他生物基质（如血浆、尿液和组织）中提取生物活性脂质。

在某些情况下，生物活性脂质已被用作氧化应激的反应性生物标志物。