Name: 有针对性的稳定同位素稀释液相色谱 - 质谱法分析细胞脂质提取 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-11-17T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 26 s
Description: 学习使用稳定同位素稀释液相色谱-质谱法精确分析细胞中的生物活性脂质代谢物。该方法结合正相色谱与电子捕获大气压化学电离技术，可准确定量花生四烯酸及其氧化代谢产物，为研究细胞酶促途径和脂质代谢提供可靠数据。

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目前大多数可用于测定生物活性脂质的生物分析方法尚不够全面，因其未包含手性正相色谱或稳定同位素稀释技术（SID）。手性正相液相色谱对于分离对映异构体以及区分酶促反应与活性氧（ROS）介导的代谢过程至关重要。使用稳定同位素稀释法可确保在定量过程中充分考虑样品提取或分析过程中可能出现的人为误差或技术问题。结合电子捕获大气压化学电离多反应监测（EC-APCI-MRM）技术，这些附加组分使本方法成为当前可用于生物活性脂质分析的最灵敏、最选择性最强的分析方法。

1. 标准品与内标混合物
<ol>
	<li>在脂质提取之前，必须配制标准品混合液（SM）和内标混合液（ISM）。对于SM，使用校准过的注射器，将试剂表中所列的每种标准品（共25种）各取相当于1 μg的体积，加入10 mL容量瓶中。在氮气下将标准品干燥，并用10 mL乙腈（ACN）重新溶解。标准品混合液的最终浓度为100 pg/μL。分装为每份1 mL，于-80°C保存，直至使用。</li>
	<li>从该标准品混合液中可进一步稀释配制6个浓度的标准溶液，共得到7个校准标准品（1 pg/μL、2 pg/μL、5 pg/μL、10 pg/μL、20 pg/μL、50 pg/μL和100 pg/μL）。每次样品制备批次均需同时分析这些标准品，以建立定量分析所用的校准曲线。</li>
	<li>对于ISM，使用校准过的注射器，将试剂表中所列的每种内标物（共14种）各取相当于1 μg的体积，加入10 mL容量瓶中，并在氮气下吹干。用10 mL ACN重新溶解ISM，分装为每份1 mL。ISM的最终浓度应为100 pg/μL。所配制的ISM足以处理1000个样品。</li>
	<li>将SM和ISM于-80°C保存。</li>
</ol>
2. 培养基和细胞裂解液的收集
<ol>
	<li>对于每个贴壁细胞的10 cm培养皿（约1 × 107个细胞），在10 mL玻璃离心管中收集3 mL培养基。随后，用磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞2次。向培养皿中加入1 mL PBS，用细胞刮刀将细胞从培养皿上刮下，并用移液器转移至第二个10 mL玻璃离心管中。若此时不继续后续操作，可将细胞和培养基样品保存。长期保存请置于-80°C，若保存时间少于一周，可置于-20°C。</li>
</ol>
3. 从培养基中提取脂质
<ol>
	<li>游离的生物活性脂质存在于细胞培养基中，可通过一步液-液萃取法轻松提取。向收集的培养基（2.1）中加入 10 μL 内标混合物（ISM）。此时，另取 8 个 10 mL 玻璃离心管，标记为 #0–7，用于配制校准标准品。向每个管中加入 3 mL 磷酸盐缓冲液（PBS），然后向编号 1–7 的管中分别加入 10 μL 对应的标准品混合物（SM）（1.1 中的 1–7）。</li>
	<li>让内标混合物（ISM）在各校准标准品和样品中平衡 10 分钟，然后加入 5 mL 乙醚。将样品和校准标准品置于摇床中，在室温下低速振荡 30 分钟。</li>
	<li>振荡结束后，将所有校准标准品和样品在 1935 × g 离心 10 分钟。随后，使用巴斯德吸管将上层有机相转移至新的 10 mL 玻璃离心管中，并在氮气下吹干。</li>
</ol>
4. 从细胞裂解液中提取脂质
<ol>
	<li>将玻璃离心管中的细胞样品在1935 × g下离心5分钟。弃去上清液；向每根管中加入2 mL PBS，短暂涡旋混匀。取25 μL样品用于蛋白质定量。总蛋白含量将用于细胞裂解液的归一化处理。</li>
	<li>接下来，将一半的裂解液/PBS混合物转移至另一个10 mL玻璃离心管中。向每个样品中额外加入2 mL PBS和10 μL内标物（ISM）。按照第3.2和3.3节中所述的液-液（l-l）萃取方法处理。此份样品用于测定细胞内的游离脂质，并避免脂质（如前列腺素）发生碱性降解。该份样品不进行下文所述的步骤4.3和4.4。</li>
	<li>酯化脂质的液-液萃取过程的第一步是向每个样品中加入5 mL CHCl3/MeOH（2:1）。将样品置于摇床上低速振荡30分钟。振荡结束后，在1935 × g下离心10分钟。随后，使用巴斯德吸管将液-液萃取的下层（有机层）转移至新的10 mL玻璃离心管中，并在氮气流下吹干样品。</li>
	<li>酯化脂质在定量前必须进行皂化处理。样品完全干燥后，向每根管中加入0.5 mL含0.4N KOH的80% MeOH溶液。将样品在60°C下孵育1小时。孵育结束后，加入2 mL PBS，用浓盐酸（约30 μL）调节pH至6。向每个样品中加入10 μL内标物（ISM）。后续步骤与培养基中的脂质提取相同，可参照第3.2和3.3节进行。</li>
	<li>若这些提取样品与培养基样品同时检测，则可使用相同的校准标准品绘制校准曲线；然而，若这些样品在其他时间检测，则必须按照第3.1–3.3节所述方法同时处理校准标准品。</li>
</ol>
5. 五氟苄基溴（PFB）衍生化
<ol>
	<li>向干燥后的样品和校准标准品中加入 100 μL 无水二氯甲烷（CH2Cl2），随后加入 100 μL 20%（v/v）的无水 CH2Cl2 溶液中的 N,N-二异丙基乙胺，最后加入 100 μL 20%（v/v）的无水 CH2Cl2 溶液中的 PFB。</li>
	<li>加入衍生化试剂后，将样品涡旋混匀，在 60°C 下孵育 1 小时，并在氮气下干燥。若样品和校准标准品不能立即分析，可保存于 -80°C；或在 -20°C 下保存不超过一周。</li>
</ol>
6. 稳定同位素稀释手性液相色谱-电子捕获-大气压化学电离质谱法（SID-LC-ECAPCI-MS）分析
<ol>
	<li>将干燥的样品和校准标准品用 100 μL 正己烷/乙醇（97:3）重新溶解。随后可将全部样品转移至带有内插管的 HPLC 小瓶中。将样品置于冷藏自动进样器（4°C）中，并创建样品分析列表。</li>
	<li>接下来，使用下文表 1和表 2中所述参数设置 HPLC 和 MS 方法。表 3包含特定化合物信息，包括每种脂质的多反应监测（MRM）转换和碰撞能量（CE），以及 Waters 2695/Thermo Fisher TSQ Quantum Ultra 分析估算的保留时间。碰撞能量（CE）是在方法开发过程中通过对每种脂质单独优化确定的。</li>
	<li>采用 Chiralpak AD-H 色谱柱（4.6 X 250 mm，5 μm），加热至 30°C，用于正相分离。初始流动相为 98% 正己烷和 2% 甲醇/异丙醇（1:1）。HPLC 分离后，柱后添加甲醇（0.75 mL/min），以避免在 Corona 放电针上沉积而降低灵敏度。质谱仪采用负离子模式，使用 APCI 离子源。若需将离子源从 ESI 更换为 APCI，务必插入 Corona 放电针。</li>
	<li>首先应运行一次正己烷空白样品。该步骤可平衡色谱柱，并检测色谱柱是否存在可能干扰校准标准品和样品分析的污染。</li>
	<li>接下来按浓度递增顺序（0–7，SM 浓度递增）依次运行校准标准品样品。这些标准品将用于建立校准曲线，其中 y 轴为标准品峰面积/内标（IS）峰面积的比值，x 轴为标准品浓度或质量。根据该曲线拟合所得的 y = mx + b 方程，可利用样品峰面积/内标峰面积的比值（y）计算样品中待测物的含量或浓度（x）。</li>
	<li>培养基中检测到的生物活性脂质含量可归一化为培养基总体积，细胞裂解液中检测到的脂质含量可归一化为每孔总细胞数或每孔总蛋白量。在实验方案第 4.1 步中应采取相应措施，确保完成细胞计数或蛋白定量。</li>
</ol>
7. 代表性结果：
色谱图中的 图1 代表一个靶向脂质组学谱。第一组（图1A) 显示了由亚油酸衍生的13-和9-HODE及其相应的13-和9-oxoODE。此外，第二组还显示了15-HETE的氧化代谢物15-oxoETE。底部两组显示了20-HETE和20-HETE-IS，[2H6]-20-羟二十碳四烯酸 图1B 显示了由花生四烯酸（AA）经酶促氧化或活性氧（ROS）氧化生成的HETE立体异构体的分离情况及确定的特征性裂解反应。 图1C 是前列腺素（PGs）、异前列烷（isoPs）和白三烯B（LTB）的示意图4某些标准品没有 commercially available 的氘代内标，因此使用保留时间相似的内标进行定量。例如，[2H8]-12(S)-HETE 用于定量 11-HETE 和 8-HETE 物种，以及 12(R)-HETE 和 12(S)-HETE
从代表性色谱图可以看出，与未标记的标准品相比，氘代内标物的保留时间发生了微小偏移。这种向更晚保留时间的偏移是氘与正相色谱柱相互作用的结果。氘比氢更具极性，因此与色谱柱的正相发生更强的相互作用。如果该分离过程采用反相色谱柱进行，则偏移将表现为更早的保留时间，因为极性更强的基团与反相的相互作用较弱。
<img src="/files/ftp_upload/3399/3399fig1.jpg" alt="用于脂质氧化产物分析的高效液相色谱图。" data-altupdatedat="1761809329000" data-alt="图1"> 
图1. 本图是靶向脂质组学分析的代表性示例。图1A 显示了多个亚油酸（LA）和花生四烯酸（AA）氧化代谢物的总离子色谱图（TIC），其中第一面板为13-oxoODE和9-oxoODE，第二面板为15-oxoETE，第三和第五面板为13-HODE和9-HODE，第七面板为20-HETE。HODEs和20-HETE在下方面板（4、6和8）中均有相应的氘代内标。 图2B 中的TIC展示了来自AA的HETE立体异构体的分离情况及其独特的质谱跃迁。 图2C 展示了前列腺素（PGs）、异前列腺素（isoPs）和白三烯（LTs）的分析结果。每种化合物的碰撞能量（CE）、多反应监测跃迁（MRM transitions）和保留时间（RT，min）均使用Waters 2695液相色谱系统与Thermo Fisher TSQ Quantum Ultra质谱仪联用进行优化，并列于表3中。
<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>时间（分钟）</td>
			<td>% A</td>
			<td>% B</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0</td>
			<td>98</td>
			<td>2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3</td>
			<td>98</td>
			<td>2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>11</td>
			<td>96.4</td>
			<td>3.6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15</td>
			<td>92</td>
			<td>8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>27</td>
			<td>92</td>
			<td>8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30</td>
			<td>50</td>
			<td>50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>38</td>
			<td>50</td>
			<td>50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>39</td>
			<td>98</td>
			<td>2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>45</td>
			<td>98</td>
			<td>2</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1. 手性正相脂质组学分离的高效液相色谱梯度条件。溶剂A为100%正己烷，溶剂B为甲醇/异丙醇（1:1）。
<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>质谱参数</td>
			<td>设置</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>离子源</td>
			<td>APCI</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>模式</td>
			<td>负离子模式</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>方法时长</td>
			<td>40 min</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MRM 扫描宽度</td>
			<td>0.002 m/z</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MRM 扫描时间</td>
			<td>0.15 sec</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MRM 峰宽</td>
			<td>0.70 FWHM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>管透镜电压</td>
			<td>164 V</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>源内 CID</td>
			<td>10 eV</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q2 碰撞气</td>
			<td>1.5 units</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>汽化器温度</td>
			<td>450°C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>毛细管温度</td>
			<td>250°C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>放电电流</td>
			<td>0 μA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>鞘气压力</td>
			<td>25 units</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>离子清扫气压力</td>
			<td>3 units</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>辅助气压力</td>
			<td>5 units</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表2. 上列为此生物活性脂质检测所优化的质谱参数。这些参数源自赛默飞世尔TSQ Quantum Ultra。
<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>化合物</td>
			<td>跃迁</td>
			<td>碰撞能量 (eV)</td>
			<td>保留时间 (min)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>13-oxoODE</td>
			<td>293.03 → 113.10</td>
			<td>21</td>
			<td>9.9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>9-oxoODE</td>
			<td>293.03 → 113.10</td>
			<td>21</td>
			<td>17.9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15-oxoETE</td>
			<td>317.05 → 113.18</td>
			<td>18</td>
			<td>8.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>13(R)-HODE</td>
			<td>295.03 → 195.12</td>
			<td>18</td>
			<td>12.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>13(S)-HODE</td>
			<td>295.03 → 195.12</td>
			<td>18</td>
			<td>14.8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>[2H4]-13(S)-HODE</td>
			<td>299.03 → 198.12</td>
			<td>18</td>
			<td>14.9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>9(R)-HODE</td>
			<td>295.03 → 171.10</td>
			<td>18</td>
			<td>13.7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>9(S)-HODE</td>
			<td>295.03 → 171.10</td>
			<td>18</td>
			<td>21.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>[2H4]-9(S)-HODE</td>
			<td>299.03 → 172.12</td>
			<td>18</td>
			<td>21.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20-HETE</td>
			<td>319.03 → 289.10</td>
			<td>18</td>
			<td>12.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>[2H6]-20-HETE</td>
			<td>325.03 → 295.10</td>
			<td>18</td>
			<td>12.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5(R)-HETE</td>
			<td>319.04 → 115.04</td>
			<td>16</td>
			<td>15.7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5(S)-HETE</td>
			<td>319.04 → 115.04</td>
			<td>16</td>
			<td>16.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>[2H8]-5(S)-HETE</td>
			<td>327.04 → 116.04</td>
			<td>16</td>
			<td>16.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12(R)-HETE</td>
			<td>319.04 → 179.11</td>
			<td>14</td>
			<td>11.7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12(S)-HETE</td>
			<td>319.04 → 179.11</td>
			<td>14</td>
			<td>12.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>[2H8]-12(S)-HETE</td>
			<td>327.13 → 184.11</td>
			<td>14</td>
			<td>12.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15(R)-HETE</td>
			<td>319.04 → 219.12</td>
			<td>13</td>
			<td>12.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15(S)-HETE</td>
			<td>319.04 → 219.12</td>
			<td>13</td>
			<td>15.9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>[2H8]-15(S)-HETE</td>
			<td>327.03 → 226.12</td>
			<td>13</td>
			<td>16.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>11(R)-HETE</td>
			<td>319.04 → 167.11</td>
			<td>16</td>
			<td>11.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>11(S)-HETE</td>
			<td>319.04 → 167.11</td>
			<td>16</td>
			<td>12.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8(R)-HETE</td>
			<td>319.04 → 155.09</td>
			<td>16</td>
			<td>11.7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8(S)-HETE</td>
			<td>319.04 → 155.09</td>
			<td>16</td>
			<td>12.6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LTB4</td>
			<td>335.03 → 195.10</td>
			<td>18</td>
			<td>32.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>[2H4]-LTB4</td>
			<td>339.03 → 197.10</td>
			<td>18</td>
			<td>32.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PGE2</td>
			<td>351.03 → 271.15</td>
			<td>18</td>
			<td>31.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>[2H4]-PGE2</td>
			<td>355.03 → 275.15</td>
			<td>18</td>
			<td>31.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PGD2</td>
			<td>351.03 → 271.15</td>
			<td>25</td>
			<td>32.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>[2H4]-PGD2</td>
			<td>355.03 → 275.15</td>
			<td>25</td>
			<td>32.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-iso-PGE2</td>
			<td>351.03 → 271.15</td>
			<td>18</td>
			<td>37.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>11β-PGF2</td>
			<td>353.03 → 193.11</td>
			<td>25</td>
			<td>27.6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>[2H4]-11β-PGF2</td>
			<td>357.03 → 197.11</td>
			<td>25</td>
			<td>27.6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PGF2α</td>
			<td>353.03 → 193.11</td>
			<td>25</td>
			<td>33.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>[2H4]-PGF2α</td>
			<td>357.03 → 197.11</td>
			<td>25</td>
			<td>33.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-iso-PGF2α</td>
			<td>353.03 → 193.11</td>
			<td>25</td>
			<td>34.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>[2H4]-8-iso-PGF2α</td>
			<td>357.03 → 197.11</td>
			<td>25</td>
			<td>34.4</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表3. 本表列出了在图1A-C的总离子色谱图中检测到的化合物。第二列为MRM/MS所用的离子跃迁，第三列列出了碰撞能量（CE，eV），最后一列列出了保留时间（RT，min）。参数优化使用Waters 2695分离模块与Thermo Fisher TSQ Quantum Ultra联用完成。

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</ol>

未声明利益冲突。

本方案中使用的一系列标准品和内标品代表了一种靶向脂质组学方法。液相色谱-质谱分析采用 Waters 2695 分离模块和 Thermo Fisher TSQ Quantum Ultra 质谱仪，其最佳参数设置见表1和表2。此外，本提取方案最初针对贴壁细胞设计，但也可修改后适用于其他细胞类型以及尿液、血液和组织等其他生物基质。许多脂质标准品均可商业获取，并可纳入本分析流程。在衍生化步骤中，必须使用无水溶剂以及最高纯度的N,N-二异丙基乙胺。对于液相色谱-质谱分析，同样必须使用最高纯度的溶剂，这些溶剂已在试剂列表中列出。柱后添加甲醇也至关重要，可防止科罗纳放电针上沉积物积聚，否则将显著降低方法的检测灵敏度。
加入校准标准品不仅能够实现准确的定量，还使研究人员能够排查提取或液相色谱-质谱（LC-MS）流程中的问题。在某些情况下，某个色谱峰可能难以定量。此时应将样品色谱图与校准标准品色谱图进行比较。通常发现，校准标准品色谱图中并不包含该干扰峰。这表明存在一种干扰化合物，它来源于细胞培养基或裂解液，并在色...

<table><tbody><tr><td>5-氧代-6E,8Z,11Z,14Z-二十碳四烯-6,8,9,11,12,14,15-d7 酸</td><td>Cayman Chemical</td><td>334250</td><td>[&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt;H&lt;sub&gt;7&lt;/sub&gt;]-5-氧&amp;#8211;TE 内标</td></tr><tr><td>5S-羟基-6E,8Z,11Z,14Z-二十碳四烯-5,6,8,9,11,12,14,15-d8 酸</td><td>Cayman Chemical</td><td>334230</td><td>[&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt;H&lt;sub&gt;8&lt;/sub&gt;]-5(&lt;em&gt;S&lt;/em&gt;)-HETE 内标</td></tr><tr><td>12S-羟基-5Z,8Z,10E,14Z-二十碳四烯-5,6,8,9,11,12,14,15-d8 酸</td><td>Cayman Chemical</td><td>334570</td><td>[&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt;H&lt;sub&gt;8&lt;/sub&gt;]-12(&lt;em&gt;S&lt;/em&gt;)-HETE 内标</td></tr><tr><td>15S-羟基-5Z,8Z,11Z,13E-二十碳四烯-5,6,8,9,11,12,14,15-d8 酸</td><td>Cayman Chemical</td><td>334720</td><td>[&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt;H&lt;sub&gt;8&lt;/sub&gt;]-15(&lt;em&gt;S&lt;/em&gt;)-HETE 内标</td></tr><tr><td>20-羟基-5Z,8Z,11Z,14Z-二十碳四烯-16,16,17,17,18,18-d6 酸</td><td>Cayman Chemical</td><td>390030</td><td>[&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt;H&lt;sub&gt;6&lt;/sub&gt;]-20-HETE 内标</td></tr><tr><td>9S-羟基-10E,12Z-十八碳二烯-9,10,12,13-d4 酸</td><td>Cayman Chemical</td><td>338410</td><td>[&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt;H&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;]-9(&lt;em&gt;S&lt;/em&gt;)-HODE 内标</td></tr><tr><td>13S-羟基-9Z,11E-十八碳二烯-9,10,12,13-d4 酸</td><td>Cayman Chemical</td><td>338610</td><td>[&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt;H&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;]-13(S)-HODE 内标</td></tr><tr><td>9&amp;alpha;,11&amp;alpha;,15S-三羟基-前列腺-5Z,13E-二烯-1-酸-17,17,18,18,19,19,20,20,20-d4</td><td>Cayman Chemical</td><td>316010</td><td>[&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt;H&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;]-PGF&lt;sub&gt;2&amp;alpha;&lt;/sub&gt; 内标</td></tr><tr><td>9&amp;alpha;,11&amp;alpha;,15S-三羟基-(8&amp;#946;)-前列腺-5Z,13E-二烯-1-酸-3,3,4,4-d4</td><td>Cayman Chemical</td><td>316350</td><td>[&lt;sub&gt;2H&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;]-8-iso-PGF2a 内标&lt;/sub&gt;</td></tr><tr><td>9&amp;alpha;,11&amp;#946;.,15S-三羟基-前列腺-5Z,13E-二烯-1-酸-3,3,4,4-d4</td><td>Cayman Chemical</td><td>10008989</td><td>[&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt;H&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;]-11&amp;#946;-PGF&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 内标</td></tr><tr><td>9&amp;alpha;,15S-二羟基-11-氧代-前列腺-5Z,13E-二烯-1-酸-17,17,18,18,19,19,20,20,20-d4</td><td>Cayman Chemical</td><td>312010</td><td>[&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt;H&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;]-PGD&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 内标</td></tr><tr><td>9-氧代-11&amp;alpha;,15S-二羟基-前列腺-5Z,13E-二烯-1-酸-17,17,18,18,19,19,20,20,20-d4</td><td>Cayman Chemical</td><td>314010</td><td>[&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt;H&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;]-PGE&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 内标</td></tr><tr><td>5S,12R-二羟基-6Z,8E,10E,14Z-二十碳四烯-6,7,14,15-d4 酸</td><td>Cayman Chemical</td><td>320110</td><td>[&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt;H&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;]-LTB&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; 内标</td></tr><tr><td>9&amp;alpha;,11,15S-三羟基-血栓烷-5Z,13E-二烯-1-酸-3,3,4,4-d4</td><td>Cayman Chemical</td><td>319030</td><td>[&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt;H&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;]-TxB&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 内标</td></tr><tr><td>5-氧代-6E,8Z,11Z,14Z-二十碳四烯酸</td><td>Cayman Chemical</td><td>34250</td><td>5-氧&amp;#8211;TE 标准品</td></tr><tr><td>12-氧代-5Z,8Z,10E,14Z-二十碳四烯酸</td><td>Cayman Chemical</td><td>34580</td><td>12-氧&amp;#8211;TE 标准品</td></tr><tr><td>15-氧代-5Z,8Z,11Z,13E-二十碳四烯酸</td><td>Cayman Chemical</td><td>34730</td><td>15-氧&amp;#8211;TE 标准品</td></tr><tr><td>5R-羟基-6E,8Z,11Z,14Z-二十碳四烯酸</td><td>Cayman Chemical</td><td>34225</td><td>5(&lt;em&gt;R&lt;/em&gt;)-HETE 标准品</td></tr><tr><td>5S-羟基-6E,8Z,11Z,14Z-二十碳四烯酸</td><td>Cayman Chemical</td><td>34230</td><td>5(&lt;em&gt;S&lt;/em&gt;)-HETE 标准品</td></tr><tr><td>8R-羟基-5Z,9E,11Z,14Z-二十碳四烯酸</td><td>Cayman Chemical</td><td>34350</td><td>8(&lt;em&gt;R&lt;/em&gt;)-HETE 标准品</td></tr><tr><td>8S-羟基-5Z,9E,11Z,14Z-二十碳四烯酸</td><td>Cayman Chemical</td><td>34360</td><td>8(&lt;em&gt;S&lt;/em&gt;)-HETE 标准品</td></tr><tr><td>11R-羟基-5Z,8Z,12E,14Z-二十碳四烯酸</td><td>Cayman Chemical</td><td>34505</td><td>11(&lt;em&gt;R&lt;/em&gt;)-HETE 标准品</td></tr><tr><td>11S-羟基-5Z,8Z,12E,14Z-二十碳四烯酸</td><td>Cayman Chemical</td><td>34510</td><td>11(&lt;em&gt;S&lt;/em&gt;)-HETE 标准品</td></tr><tr><td>12R-羟基-5Z,8Z,10E,14Z-二十碳四烯酸</td><td>Cayman Chemical</td><td>34560</td><td>12(&lt;em&gt;R&lt;/em&gt;)-HETE 标准品</td></tr><tr><td>12S-羟基-5Z,8Z,10E,14Z-二十碳四烯酸</td><td>Cayman Chemical</td><td>34570</td><td>12(&lt;em&gt;S&lt;/em&gt;)-HETE 标准品</td></tr><tr><td>15R-羟基-5Z,8Z,11Z,13E-二十碳四烯酸</td><td>Cayman Chemical</td><td>34710</td><td>15(&lt;em&gt;R&lt;/em&gt;)-HETE 标准品</td></tr><tr><td>15S-羟基-5Z,8Z,11Z,13E-二十碳四烯酸</td><td>Cayman Chemical</td><td>34720</td><td>15(&lt;em&gt;S&lt;/em&gt;)-HETE 标准品</td></tr><tr><td>20-羟基-5Z,8Z,11Z,14Z-二十碳四烯酸</td><td>Cayman Chemical</td><td>90030</td><td>20-HETE 标准品</td></tr><tr><td>9R-羟基-10E,12Z-十八碳二烯酸</td><td>Cayman Chemical</td><td>38405</td><td>9(&lt;em&gt;R&lt;/em&gt;)-HODE 标准品</td></tr><tr><td>9S-羟基-10E,12Z-十八碳二烯酸</td><td>Cayman Chemical</td><td>38410</td><td>9(&lt;em&gt;S&lt;/em&gt;)-HODE 标准品</td></tr><tr><td>13R-羟基-9Z,11E-十八碳二烯酸</td><td>Cayman Chemical</td><td>38605</td><td>13(&lt;em&gt;R&lt;/em&gt;)-HODE 标准品</td></tr><tr><td>13S-羟基-9Z,11E-十八碳二烯酸</td><td>Cayman Chemical</td><td>38610</td><td>13(&lt;em&gt;S&lt;/em&gt;)-HODE 标准品</td></tr><tr><td>9&amp;alpha;,11&amp;alpha;,15S-三羟基-前列腺-5Z,13E-二烯-1-酸</td><td>Cayman Chemical</td><td>16010</td><td>PGF&lt;sub&gt;2&amp;alpha;&lt;/sub&gt; 标准品</td></tr><tr><td>9&amp;alpha;,11&amp;alpha;,15S-三羟基-(8&amp;#946;)-前列腺-5Z,13E-二烯-1-酸</td><td>Cayman Chemical</td><td>16350</td><td>8-&lt;em&gt;iso&lt;/em&gt;-PGF2&amp;alpha; 标准品</td></tr><tr><td>9&amp;alpha;,11&amp;#946;,15S-三羟基-前列腺-5Z,13E-二烯-1-酸</td><td>Cayman Chemical</td><td>16520</td><td>11&amp;#946;-PGF&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 标准品</td></tr><tr><td>9&amp;alpha;,15S-二羟基-11-氧代-前列腺-5Z,13E-二烯-1-酸</td><td>Cayman Chemical</td><td>12010</td><td>PGD&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 标准品</td></tr><tr><td>9-氧代-11&amp;alpha;,15S-二羟基-(8&amp;#946;)-前列腺-5Z,13E-二烯-1-酸</td><td>Cayman Chemical</td><td>14350</td><td>8-&lt;em&gt;iso&lt;/em&gt;-PGE&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 标准品</td></tr><tr><td>9-氧代-11&amp;alpha;,15S-二羟基-前列腺-5Z,13E-二烯-1-酸</td><td>Cayman Chemical</td><td>14010</td><td>PGE&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 标准品</td></tr><tr><td>5S,12R-二羟基-6Z,8E,10E,14Z-二十碳四烯酸</td><td>Cayman Chemical</td><td>20110</td><td>LTB&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; 标准品</td></tr><tr><td>9&amp;alpha;,11,15S-三羟基血栓烷-5Z,13E-二烯-1-酸</td><td>Cayman Chemical</td><td>19030</td><td>TxB&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 标准品</td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>14190</td><td></td></tr><tr><td>乙醚</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>346136</td><td></td></tr><tr><td>二氯甲烷</td><td>Acros Organics</td><td>61030-1000</td><td>无水</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;N,N&lt;/em&gt;-二异丙基乙胺</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>387649</td><td></td></tr><tr><td>五氟苄基溴</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>101052</td><td></td></tr><tr><td>盐酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>320331</td><td></td></tr><tr><td>氢氧化钾</td><td>Fluka</td><td>00650</td><td></td></tr><tr><td>乙腈</td><td>Fisher Scientific</td><td>A996-4</td><td></td></tr><tr><td>甲醇</td><td>Fisher Scientific</td><td>A454-4</td><td></td></tr><tr><td>氯仿</td><td>Fisher Scientific</td><td>366927</td><td></td></tr><tr><td>正己烷</td><td>Fisher Scientific</td><td>H303-4</td><td></td></tr><tr><td>异丙醇</td><td>Fisher Scientific</td><td>A464-4</td><td></td></tr><tr><td>乙醇</td><td>Decon Laboratories</td><td>2716</td><td></td></tr><tr><td>水</td><td>Fisher Scientific</td><td>W7-4</td><td></td></tr><tr><td>巴斯德移液管</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-200</td><td></td></tr><tr><td>10 mL 玻璃离心管</td><td>Kimble Chase</td><td>73785-10</td><td>螺口盖</td></tr><tr><td>酚类螺口盖</td><td>Kimble Chase</td><td>73802-13415</td><td></td></tr><tr><td>Chiralcel ADH 色谱柱</td><td>Chiral Technologies</td><td>19325</td><td></td></tr><tr><td>HPLC 小瓶</td><td>Waters</td><td>60000751CV</td><td></td></tr><tr><td>HPLC 插管</td><td>Waters</td><td>WAT094171</td><td></td></tr></tbody></table>

细胞脂质提取用于靶向稳定同位素稀释液相色谱-质谱分析

Cellular Lipid Extraction for Targeted Stable Isotope Dilution Liquid Chromatography-Mass Spectrometry Analysis

脂肪酸（如花生四烯酸（AA）和亚油酸（LA））的代谢会生成氧化型生物活性脂质，包括多种立体异构体1,2。这些代谢物可由游离或酯化形式的脂肪酸生成。许多此类氧化代谢物具有生物活性，并已被证实与多种疾病相关，包括心血管疾病、神经退行性疾病、哮喘和癌症3-7。氧化型生物活性脂质可通过酶促反应或活性氧（ROS）作用生成。参与脂肪酸代谢的酶包括环氧化酶（COX）、脂氧合酶（LO）和细胞色素P450（CYPs）1,8。酶促代谢导致对映体选择性产物的生成，而ROS氧化则生成外消旋混合物。
尽管本方案主要侧重于分析花生四烯酸（AA）和部分亚油酸（LA）衍生的生物活性代谢物，但也可轻松应用于其他脂肪酸的代谢物分析。生物活性脂质通过液-液（l-l）萃取法从细胞裂解液或培养基中提取。在液-液萃取过程开始时，加入稳定同位素内标，以校正样品制备过程中可能产生的误差。稳定同位素稀释法（SID）还可校正代谢物在质谱（MS）分析过程中可能遇到的各类差异，例如离子抑制效应9。萃取后，采用电子捕获（EC）试剂五氟苄基溴（PFB）进行衍生化，以提高检测灵敏度10,11。使用多反应监测（MRM）模式以增强质谱分析的选择性。在质谱分析前，采用手性正相高效液相色谱法（HPLC）对脂质进行分离。HPLC条件经过优化，可有效分离目标脂质的对映异构体及各种立体异构体12。该特定的LC-MS方法可监测前列腺素（PGs）、异前列腺素（isoPs）、羟基二十碳四烯酸（HETEs）、羟基十八碳二烯酸（HODEs）、氧代二十碳四烯酸（oxoETEs）和氧代十八碳二烯酸（oxoODEs）；然而，HPLC和MS参数可进一步优化，以涵盖其他脂肪酸代谢物13。
目前大多数可用的生物分析方法均未考虑对对映异构体进行分别定量。在判断代谢物是由酶催化产生还是由活性氧（ROS）产生时，这一点极为重要。此外，对映异构体的比例可能为特定的酶促生成途径提供证据。采用稳定同位素稀释法（SID）可实现对代谢物的准确定量，并能校正样品制备过程中的损失以及电离过程中存在的差异。使用五氟苄基溴（PFB）作为电子捕获试剂，可使检测灵敏度比传统的常压化学电离（APCI）方法提高两个数量级。总体而言，该方法即稳定同位素稀释-液相色谱-电子捕获-常压化学电离多反应监测质谱法（SID-LC-EC-APCI-MRM/MS），是目前针对生物活性脂质定量分析中最灵敏、选择性最强且最准确的方法之一。

本方案将演示从细胞中提取和分析游离及酯化生物活性脂肪酸的方法。采用稳定同位素稀释法、手性液相色谱-电子捕获大气压化学电离多反应监测质谱法（SID-LC-ECAPCI-MRM/MS）对脂肪酸进行准确定量。

脂肪酸（如花生四烯酸（AA）和亚油酸（LA））的代谢会生成氧化型生物活性脂质，其中包括多种立体异构体1,2。这些代谢产物可由游离或酯化形式的脂肪酸生成。许多氧化型代谢产物具有生物学活性，并与多种疾病相关，包括心血管疾病、神经退行性疾病、哮喘和癌症3-7。氧化型生物活性脂质可通过酶促反应或活性氧（ROS）作用生成。参与脂肪酸代谢的酶包括环氧化酶（COX）、脂氧合酶（LO）和细胞色素P450（CYPs）1,8。酶促代谢产生对映体选择性产物，而ROS氧化则生成外消旋混合物。尽管本方案主要聚焦于AA及部分LA衍生的生物活性代谢物的分析，但也可轻易应用于其他脂肪酸代谢物的分析。生物活性脂质通过液-液（l-l）萃取法从细胞裂解液或培养基中提取。在液-液萃取开始时加入稳定同位素内标，以校正样品制备过程中的误差。稳定同位素稀释法（SID）还可校正代谢物在质谱（MS）分析过程中可能遇到的差异，例如离子抑制效应9。萃取后，采用电子捕获（EC）试剂五氟苄基溴（PFB）进行衍生化，以提高检测灵敏度10,11。通过多反应监测（MRM）模式增强质谱分析的选择性。在质谱分析前，利用手性正相高效液相色谱（HPLC）对脂质进行分离。HPLC条件经过优化，以实现目标脂质的对映体及各种立体异构体的有效分离12。该特定LC-MS方法可监测前列腺素（PGs）、异前列腺素（isoPs）、羟基二十碳四烯酸（HETEs）、羟基十八碳二烯酸（HODEs）、氧代二十碳四烯酸（oxoETEs）和氧代十八碳二烯酸（oxoODEs）；然而，HPLC和MS参数可进一步优化以涵盖其他脂肪酸代谢物13。目前大多数可用的生物分析方法未考虑对对映体进行分别定量。这一点在判断代谢物是经酶促途径还是ROS途径生成时极为重要。此外，对映体的比例可能为特定酶促生成通路提供证据。采用SID法可实现代谢物的准确定量，并校正样品制备过程中的损失以及电离过程中的差异。使用PFB电子捕获试剂可使检测灵敏度较传统APCI方法提高两个数量级。总体而言，该方法——稳定同位素稀释-液相色谱-电子捕获-大气压化学电离-多反应监测/质谱法（SID-LC-EC-APCI-MRM/MS）——是目前对生物活性脂质进行定量分析最灵敏、最选择性强且最准确的方法之一。

该方法旨在通过稳定同位素稀释、正相液相色谱、电子捕获、大气压化学电离与质谱联用技术，精确测定细胞中生物活性脂质代谢物。首先收集培养基和细胞样品，并加入同位素标记的内标混合物。使用有机溶剂提取生物活性脂质，随后用电子捕获试剂对生物活性脂质进行衍生化，再通过液相色谱精确测定其含量。通过液相色谱-质谱（LCMS）分析细胞裂解液和培养基，可精确定量目标生物活性脂质的浓度以及各单个Anant ER的水平。与反相液相色谱、质谱及其他LCMS方法等现有技术相比，该技术的主要优势在于，利用手性正相色谱结合稳定同位素稀释法，能够准确量化各个异构体及对映体。所得数据可为细胞内发挥功能的酶促代谢途径提供重要见解。对于每个10厘米的培养皿中的贴壁细胞，用10毫升玻璃离心管收集3毫升培养基。接着，用PBS洗涤细胞两次。然后加入1毫升PBS，将细胞从培养皿上刮下，并将样品转移至第二个10毫升玻璃离心管中。准备另外8个含有三毫升磷酸盐缓冲液（PBS）的试管，用于制作标准曲线。然后向每支试管中加入10微升相应的校准标准品。将收集的三毫升细胞培养上清液样品依次排列，用于游离生物活性脂质的提取。向每个校准标准品和样品中加入10微升内标混合液，在室温下平衡10分钟，然后加入五毫升二乙醚处理样品，并置于摇床上振荡30分钟。离心样品后，将上层有机相转移至10毫升玻璃离心管中。在氮气下继续干燥样品。首先，通过离心收集收获的细胞样品，并将每个沉淀物用涡旋振荡器重悬于2毫升磷酸盐缓冲液（PBS）中。每个样品保留25微升用于细胞裂解液的归一化处理。现在将每份裂解液均分至10毫升玻璃离心管中。向每个样品中额外加入2毫升PBS和10微升内标物（ISM），以测定游离细胞脂质；为避免前列腺素等脂质发生碱性降解，请取每份样品的平行样之一，进行如前所述的二乙基醚萃取。为了提取酯化脂质，向其余每个样品中加入5毫升氯仿-甲醇混合液。将样品置于摇床，低速振荡30分钟，然后离心10分钟。收集下层有机相，用氮气吹干样品以皂化酯化脂质。向每根试管中加入0.5毫升0.4当量的氢氧化钾甲醇溶液（80%甲醇）。将样品在 60 摄氏度下孵育一小时。然后加入两毫升 PBS，并用浓盐酸调节 pH 至 2–6。最后，向每个样品中加入 10 微升 ISM，接着对干燥后的样品和校准标准品进行二乙醚萃取。按指定顺序加入衍生化试剂。然后涡旋混合样品，并在60摄氏度下孵育1小时。随后，在储存和分析前，将样品在氮气下吹干。该方法结合了稳定同位素稀释、手性液相色谱、电子捕获、大气压化学电离和质谱分析技术。用 100 微升正己烷-乙醇溶液重悬样品和校准标准品，并将全部样品转移至带有内插管的 HPLC 小瓶中，然后将样品置于冷藏自动进样器中。创建样品分析列表。接下来，使用随附书面方案中表一和表二所述的参数，设置用于正相分离的高效液相色谱（HPLC）和质谱（MS）

cellular-lipid-extraction-for-targeted-stable-isotope-dilution-liquid

Research

科研

JoVE Journal

Bioengineering

生物工程

有针对性的稳定同位素稀释液相色谱 - 质谱法分析细胞脂质提取

为了检测蛋白质与其靶向脂质的相互作用，我们使用了MACS技术以及与磁珠偶联的Annexin V，并采用靶向脂质和Annexin...

磁性激活细胞分选介导的脂质囊泡亲和层析（LIMACS）：一种分析蛋白质-脂质相互作用的新方法

介绍了两种分离细胞脂滴的方法，分别来自1）酵母细胞和2）人胎盘。这两种方法的核心步骤均为密度梯度离心，其中含有脂滴的上浮层可通过肉眼清晰观察，随后可被提取，并通过蛋白质印迹分析检测其纯度。...

从酵母细胞和人胎盘中分离细胞脂滴：两种纯化技术

磷脂酰肌醇是一类信号脂质，其相对丰度会因各种刺激而迅速发生变化。本文介绍了一种通过代谢标记法使用3H-myo-肌醇标记细胞，随后进行提取和去酰化，以测定磷脂酰肌醇丰度的方法。提取的甘油-肌醇脂质随后通过高效液相色谱分离，并通过流动闪烁法进行定量。...

放射性标记及通过高效液相色谱-流式闪烁法定量细胞内磷脂酰肌醇磷酸酯水平

脂滴是多种病原体复制的重要细胞器，包括丙型肝炎病毒（HCV）。本文描述了一种用于分离脂滴并对其相关蛋白进行定量质谱分析的方法；该方法可用于多种实验条件，如病毒感染、环境应激或药物处理。...

脂滴分离用于定量质谱分析

介绍了一种利用单个样品对生物组织中的脂质、代谢物和蛋白质进行综合提取的实验方案。...

一种用于从单个样品中全面分析代谢物、脂质和蛋白质的简单分级提取方法

本文介绍了一种模块化方案，用于神经系统疾病小鼠模型中的组织脂质组学和转录组学以及血浆脂质组学研究，重点针对与炎症和神经元活动相关的脂质、膜脂质、下游信使分子，以及编码脂质功能相关酶/受体的mRNA。文中概述了样本采集、样品处理、提取及定量分析的操作流程。...

神经疾病中的脂质组学与转录组学

该方法为研究复杂宿主来源中外源性脂肪酸掺入细菌膜（特别是Staphylococcus...

从鸡蛋蛋黄中分离脂蛋白颗粒以研究细菌病原体脂肪酸向膜磷脂的掺入

我们介绍一种采用液相色谱串联质谱法鉴定和定量酿酒酵母（Saccharomyces...

使用液相色谱串联质谱法对酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）细胞脂质组进行定量分析

本文介绍了一种利用14C-乙酸对酵母进行代谢标记的实验方案，并结合薄层色谱法分离中性脂质。...

中性脂质合成分析 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae） 通过代谢标记和薄层色谱法

本文介绍了一种通过稳定同位素标记，结合保留时间、迁移率和碎片化特征来筛选脂质结构的方法。...

示踪 从头合成 使用稳定同位素标记的液相色谱-传输区离子淌度-飞行时间质谱/质谱分析脂质

我们介绍一种利用环糊精介导细胞质膜脂质与外源性脂质进行交换的方法。该技术可与研究跨膜蛋白的实验相结合，因为跨膜蛋白在类似脂筏的环境中和非脂筏样环境中的行为表现不同。...

活细胞中的脂质交换实验

学习使用稳定同位素稀释液相色谱-质谱法精确分析细胞中的生物活性脂质代谢物。该方法结合正相色谱与电子捕获大气压化学电离技术，可准确定量花生四烯酸及其氧化代谢产物，为研究细胞酶促途径和脂质代谢提供可靠数据。

细胞脂质提取用于靶向稳定同位素稀释液相色谱-质谱分析

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