Name: 卷烟主流烟气中检测和清除气相自由基议定书 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-01-02T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 23 s
Description: 了解利用自旋捕获电子自旋共振光谱法检测卷烟主流烟气中气相自由基并评估番茄红素、碧萝芷和葡萄籽提取物等植物抗氧化剂的清除能力的方法。该技术可定量分析自由基浓度并评估抗氧化剂效果。

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本工作由美国国立卫生研究院资助，项目编号 NIH/NCRR P41-RR 016292（用于 ACERT）。

1. 材料
本研究中使用的所有溶剂均为试剂级。自旋捕获剂包括N-叔丁基-α-苯基硝酮（PBN）和标准自旋标记物2,2,6,6-四甲基-1-哌啶氧自由基（TEMPO），购自Sigma公司，未经纯化直接使用。植物抗氧化剂购自美国斯旺森公司（Swanson, Inc.）。
2. 香烟烟雾的制备及自由基分析
<ol>
	<li>为了将抗氧化剂引入滤材，首先将抗氧化剂碧萝芷（pycnogenol）和葡萄籽提取物溶解于95%乙醇中，而番茄红素则溶解于丙酮中。溶剂体积根据抗氧化剂的溶解度而有所不同。</li>
	<li>每支滤材使用0.4 mg的抗氧化剂，并随后包覆10 mg的活性炭。具体操作为：在无氧条件下，将活性炭与抗氧化剂溶液搅拌约12小时，过滤后在真空下干燥。</li>
	<li>然后将抗氧化剂引入常规醋酸纤维滤棒（CA滤棒）。为此，将滤棒切成两段，将包覆有植物抗氧化剂的材料置于两段滤棒之间，并用胶带包裹，形成“滤棒-抗氧化剂-滤棒”三明治结构（图1A）。该复合滤棒随后连接至含烟草的烟支上。对照滤棒以相同方式制备，但不添加抗氧化剂。</li>
	<li>在进行吸烟模拟前，实验用香烟需拆封并置于恒定湿度环境中（20 °C，60%相对湿度），使用饱和溴化钠（NaBr）溶液平衡至少2天。</li>
	<li>常规分析的吸烟模拟在室温下进行，使用单通道吸烟装置，如图1所示，该装置由一个水流抽吸器或GAST DOA-P104-BN真空泵/空气压缩机（Benton Harbor, Mich）通过T型接头连接至自旋捕获装置，T型接头一端保持开放。通过堵塞开放端实现抽吸，两次抽吸之间该端保持开放。通过流量计检测气体流速，并调节泵与排气口之间的阀门，使流速稳定在约2.2 SCFH（即17.5 mL/s）。</li>
	<li>实验香烟在每次抽吸体积为35 mL、持续2秒、每60秒重复一次的条件下进行抽吸，方法类似文献1。用于定量测定气相自由基的吸烟模拟与自旋捕获系统联用，如图1所示。</li>
	<li>每支香烟抽取10次强烈抽吸（每次35 mL）。气相自由基通过将主流烟气（MCS）先经过剑桥滤片，再导入自旋捕获溶液（苯中0.05 M PBN，2.0 mL）进行收集。</li>
	<li>最后一次抽吸后，用相同苯溶剂将起泡后的捕获溶液重新调整至初始体积（2.0 mL）。取等分试样转移至一支长约250 mm、内径3 mm、一端密封的玻璃管中。</li>
	<li>采用冷冻-抽气-解冻循环法对捕获溶液进行除氧处理：先在液氮中冷冻，施加真空；然后在氩气氛围下解冻，使溶解的气体气泡逸出，再重新冷冻。此过程重复三次后，在真空条件下火焰密封玻璃管，用于后续电子自旋共振（ESR）测量。此步骤是必要的，因为氧气在苯中溶解度较高，会加宽有机自由基的ESR谱线。除氧可显著提高信噪比。</li>
	<li>X波段ESR谱图在Bruker EMX波谱仪上记录，频率为9.34 GHz，标准条件下测定。大多数实验采用的仪器参数为：中心磁场3312.5 G，扫描宽度80 G，调制幅度0.5 G，时间常数82微秒，扫描时间40秒。</li>
	<li>在实验条件下，自旋捕获加合物相对稳定，某些情况下需累积25次扫描，通常耗时约20分钟。然而，12小时后，苯溶液中ESR信号强度会下降约5倍。</li>
	<li>为定量测定捕获加合物的浓度，对其初始的一阶导数ESR谱图进行积分。所得吸收谱图显示一个宽的单峰背景，很可能来源于烟气中含有的烟灰/焦油产物。 
	 
	扣除该背景后，对分离出的捕获加合物三重峰再次进行积分（图2）。</li>
</ol>
3. 典型结果
燃烧香烟产生的烟雾（气相）中的大多数自由基是瞬时且不稳定的。为了观测这些自由基，需采用自旋捕获技术。该技术通过将气相自由基转化为更稳定的自旋加合物，从而利用电子自旋共振（ESR）进行检测（图1）。本研究中，使用0.05 M PBN自旋捕获溶液收集烟雾气相中的自由基，这些自由基为氧中心和碳中心自由基的混合物，难以分离。15然而，在我们的案例中，观察到的超精细分裂常数 aN = 13.7G 和 aH 1.95G 与烷氧基自由基（RO.）加合物捕获的相应值非常相似2，表明它们是主要产物。我们发现初始测量中观察到的微弱ESR信号和低重复性（图2）是由于烟气流中的水分所致。为解决这一问题，我们在剑桥滤片和自旋捕获溶液之间添加了液氮（LN2）捕集阱。该LN22 捕集阱通过快速冷冻并将水分捕获在玻璃管内壁上，从而去除MCS气流中的水。这显著改善了ESR信号，并实现了高度可重复的结果（图3）。
通过使用参考样品测定所捕获自由基的量。对于不含抗氧化剂的对照样品，通过将其双重积分谱与已知浓度TEMPO的双重积分谱进行比较，估算出苯中典型的加合物浓度为1.24 μM（图2）。由于每支香烟在抽吸过程中通过的空气量约为350 ml，由此估算出MCS气相中自由基的浓度约为7.1×10-9M，整支香烟气相中被捕获的自由基总数约为1.5×1015。对整支香烟烟雾中自由基总量（包括气相和颗粒相）的估算值约为1016个自由基9。
在主流烟气中，植物抗氧化剂对气相自由基的清除作用表现出不同水平。其清除率如图4所示。番茄红素和葡萄籽提取物的清除率最高，而碧萝芷（pycnogenol）的清除率较低（图4）。
<img alt="香烟烟雾分析装置示意图，包含自旋捕获剂、剑桥滤片和液氮处理过程。" src="/files/ftp_upload/3406/3406fig1.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 1"> 
图 1. 利用自旋捕获剂收集主流香烟烟雾（MCS）中气相自由基的改进型吸烟模拟装置示意图。MCS 通过水流抽吸泵依次经过 CA 滤片、剑桥滤片（黄色滤片），并经液氮冷阱去除 H2O 后，最终进入自旋捕获装置，并在自旋捕获剂溶液中鼓泡。植物抗氧化剂置于两片常规醋酸纤维滤片之间（圆圈 A 处放大显示），并连接在香烟末端，用于清除 MCS 中的自由基。
<img alt="导数、积分谱图集；EPR 谱图；分析方法：基线校正、双重积分。" src="/files/ftp_upload/3406/3406fig2.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 2"> 
图 2. 对苯溶液中自旋捕获加合物浓度进行定量估算时，需从第一重积分谱图中扣除一个宽的背景信号。自旋捕获加合物的超精细分裂参数为 aH = 1.95 G，aN = 13.7 G。
<img alt="电子自旋共振谱在有无液氮条件下的比较；图谱分析。" src="/files/ftp_upload/3406/3406fig3.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图3"> 
图3. 经液氮捕集阱处理可显著提高通过自旋捕获法检测MCS所得ESR信号的质量。
<img alt="光谱分析图；抗氧化剂的电子顺磁共振谱：碧萝芷、葡萄籽提取物、番茄红素、对照组。" src="/files/ftp_upload/3406/3406fig4.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 4"> 
图 4。天然抗氧化剂对 MCS 中自由基浓度的影响。相对信号强度分别为：对照组 - 100%，碧萝芷 - 55%，葡萄籽提取物 - 12%，番茄红素 - 10%。

<ol><li>Baum, S. L., Anderson, I. G. M., Baker, R. R., Murphy, D. M., Rowlands, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+spin+resonance+and+spin+trap+investigation+of+free+radicals+in+cigarette+smoke%3A+development+of+a+quantification+procedure%5BTitle%5D)+AND+%22Analytica+Chimica.+Acta%22%5BJournal%5D)">Electron spin resonance and spin trap investigation of free radicals in cigarette smoke: development of a quantification procedure.</a> Analytica Chimica. Acta. 481, 1-13 (2003).</li>
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</ol>

未声明利益冲突。

要可靠地评估不同自由基清除剂在烟草烟雾中的作用，需要一种可重复的自由基定量检测技术。先前的研究1表明，在非极性溶剂中使用较高浓度的小体积自旋捕获剂溶液，对捕获烟草烟雾中的自由基最为有效。香烟烟雾中始终含有有机物燃烧产生的水蒸气以及烟草中残留的水分，这些水分可能进入捕获溶剂中。水与PBN自旋捕获剂溶液的混合会显著缩短自旋捕获加合物的寿命，并降低其电子自旋共振（ESR）信号的强度。在我们的实验中，通过将主流烟雾（MCS）简单地经过液氮冷却的U形管以去除水分，显著改善了ESR谱图的质量，尽管部分气相自由基也可能被冻结在表面而被捕获。
利用该技术，我们比较了将不同天然自由基清除化合物引入卷烟滤嘴后的相对效率。研究发现，番茄红素和葡萄籽提取物在刚加入卷烟滤嘴后，能够清除气相主流烟气（MSC）中高达90%的自由基。如此高的清除能力使这些廉价且易得的天然化合物与血红蛋白和紫草素等已报道的最高效自由基保护剂8,14处于同等地位。然而，在我们的实验中，负载了上述天然抗氧化剂的卷烟滤嘴在室温下储存一周后，其清除能力明显下降。解决这一问题有望推动番茄红素和葡萄籽提取物在未来商业卷烟滤嘴中的应用。

一种用于检测和清除主流香烟烟雾中气相自由基的实验方案

A Protocol for Detecting and Scavenging Gas-phase Free Radicals in Mainstream Cigarette Smoke

吸烟与人类癌症相关。据报道，大多数肺癌死亡病例由吸烟引起5,6,7,12。尽管香烟烟雾颗粒相中的焦油及相关产物是致癌和致突变相关疾病的主要原因，但香游戏副本中还含有大量自由基，也被认为是一类重要的致癌物9,10。自由基通过破坏蛋白质结构、脂质和DNA序列，攻击细胞组分，从而增加患多种癌症的风险。吸入的自由基在肺部形成加合物，导致烟草烟雾的多种负面健康效应3。已有研究致力于降低香烟烟雾中的自由基，以减少吸烟所致损害的风险。据报道，血红蛋白及含血红素的化合物可部分清除香烟烟雾中的一氧化氮、活性氧化物和致癌性挥发性亚硝基化合物4。一种由血红蛋白和活性炭组成的“生物过滤器”被用于清除自由基，可去除香烟烟雾中高达90%的自由基14。然而，由于成本效益不佳，尚未成功实现商业化。另一项研究显示，中药成分紫草素具有良好的自由基清除效率8。在本研究中，我们报告了一种将常见天然抗氧化提取物引入香烟滤嘴以清除香烟烟雾气相自由基的实验方案，并采用自旋捕获电子顺磁共振（ESR）波谱法测定其对主流香烟烟雾（MCS）中气相自由基的清除效果1,2,14。我们发现番茄红素和葡萄籽提取物具有高效的自由基清除能力，提示其未来可应用于香烟滤嘴。这些潜在清除剂的一个重要优势在于，它们可分别从番茄或葡萄酒工业的副产物中大量获取11,13

采用自旋捕获电子自旋共振（ESR）波谱法研究植物抗氧化剂番茄红素、碧萝芷和葡萄籽提取物对香烟烟雾气相自由基的清除作用。

香烟吸烟与人类癌症相关。据报道，大多数肺癌死亡病例由香烟吸烟引起 5,6,7,12。

本实验的总体目标是测量主流烟草烟雾中自由基的含量，并评估多种抗氧化剂的清除能力。首先制备含有多种不同清除剂化合物的滤膜，同时设置不含清除剂的滤膜作为对照。随后通过模拟吸烟过程，使研究用香烟产生的烟雾经过自旋捕获溶液，从而实现上述目标。电子自旋共振（缩写为 ESR）被用于记录被捕获自由基以及参比样品的谱图。随后，对获得的 ESR 谱图进行常规分析，以将被捕获气相自由基的信号与背景信号分离，并利用参比样品对自由基浓度进行定量。最终，结果提供了关于香烟主流烟雾中自由基含量的定量信息，以及通过自旋捕获 ESR 波谱法对天然抗氧化剂清除能力的评估。与现有的烟草烟雾分析方法（如气相色谱法）相比，该技术的主要优势在于电子自旋共振（ESR）对自由基具有特异性的敏感性。该技术的应用有助于减少烟草烟雾的危害效应，因为自由基是致癌物中的一个重要类别。该方法可为研究烟草烟雾中的自由基提供深入见解，也可应用于其他系统，如工业烟尘排放和烟熏环境。国家生物医学电子自旋共振技术研究中心，简称Cert，是我们长期致力于现代ESR技术研发经验的成果延伸。对于从事电子自旋共振研究的研究人员，我们为他们以及生物医学领域提供了多种多样的服务。我们定期开放实验设施，以将抗氧化剂引入香烟滤嘴。首先，将抗氧化剂、碧萝芷（pycnogenol）和葡萄提取物溶解于95%乙醇中，并将番茄红素溶解于丙酮中。根据抗氧化剂的溶解度调整溶剂体积。随后，在厌氧条件下将溶解的抗氧化剂与活性炭混合，搅拌约12小时。通过在搅拌过程中向混合物中通入Argonne气体以实现厌氧条件。孵育结束后，将溶液过滤并在真空条件下干燥。然后将抗氧化剂和碳加入到一个常规的醋酸纤维滤棒中，首先将滤棒切成两段。将涂有植物抗氧化剂的材料夹在两段滤棒之间，形成一种滤棒-抗氧化剂-滤棒的三明治结构，再将其重新插入香烟的纸筒中。对照滤片的制备方法与抗氧化滤片相同，但在实验设置前不添加抗氧化剂。研究用香烟应拆开包装，并使用饱和溴化钠溶液在恒定湿度环境中至少放置两天。取出含有烟草的烟支，并将其连接到组合滤片上。使用单通道吸烟装置在常温下进行常规分析的吸烟模拟，该装置由一个水流抽吸器或真空泵/空气压缩机通过T型接头连接至自旋捕获组件构成，T型接头一端开放。使用流量计检测气体流速，并通过调节泵与排气口之间的阀门将流速设定在约每小时2.2标准立方英尺。采用每次35毫升、持续2秒的强烈抽吸模式点燃研究用香烟，并每60秒重复一次。应堵住吸烟装置的开口端以进行抽吸，并在两次抽吸之间保持开口。当开口端未堵塞时，通过香烟的气流很小，这对应于两次抽吸之间的条件。每支香烟采集10次强力抽吸，通过将主流香烟烟雾穿过剑桥滤片来收集气相自由基，然后将其引入自旋捕获溶液中。液氮捕集阱可去除主流烟雾中的水蒸气，但不会显著影响气相自由基。在最后一次抽吸后，将一部分通入气泡捕集液转移至一支长约10英寸、内径为3毫米的玻璃样品管中。由于氧气会加宽电子自旋共振（ESR）谱线并降低方法的灵敏度，因此需采用冷冻-抽气-解冻法对溶液进行脱氧处理：首先将样品管浸入液氮中冷冻，然后用油泵对溶液进行抽真空，最后在氩气氛围下解冻溶液。重复此冻融抽气法数次。然后，在真空条件下密封该管。此时，该管已准备就绪。为进一步进行电子自旋共振（ESR）测量，使用布鲁克EMX波谱仪在9.34吉赫兹频率下记录X波段ESR谱。在标准条件下，请参考书面实验方案中所述的典型波谱仪设置参数。本实验需进行25次ESR信号累加，通常耗时约20分钟。尽管自旋捕获物在实验条件下放置12小时后相对稳定，但在苯溶液中其电子自旋共振（ESR）信号强度降低了五倍。为了定量测定捕获产物的浓度，需对初始的一阶导数ESR谱图进行积分。所得吸收光谱显示一个宽的单重态背景信号，这很可能归因于烟雾中含有的炭黑和焦油产物。扣除本底后，对捕获自由基的三重峰进行积分，再进行一次计算以获得自由基浓度。将自旋捕获溶液的双重积分值与已知浓度的硝rox自由基tempo溶液的积分值进行比较，后者来自本实验展示的结果以及书面方案中提供的其他计算数据。测得香烟主流烟雾气相中自由基浓度约为 7.1 × 10⁻⁹ 摩尔。据此计算出，从一支完整香烟的气相中捕获的自由基总数约为 1.5 × 10¹⁵。在本实验过程中，初期测量因烟流中的水分导致电子自旋共振（ESR）信号较弱且重复性差。为解决这一问题，在吸烟模拟装置中的剑桥滤片与自旋捕获溶液之间增加了液氮捕集阱。液氮捕集阱通过快速冷冻并将水分捕获在玻璃管内壁的方式，去除了主流香烟烟雾气流中的水分。这显著改善了电子自旋共振（ESR）信号，并实现了高度可重复的实验结果。观察到植物抗氧化剂对主流烟气中气相自由基的清除作用具有不同水平，并展示了它们的清除率。番茄红素和葡萄籽提取物表现出最高的清除率，而碧萝芷的清除率较低。一旦掌握，该技术若操作得当，可在一小时内完成。进行该操作时，必须将烟雾通过液氮捕集阱。这有助于提高SR谱的质量及其后续开发的可重复性。该技术已帮助从事健康与环境研究的科研人员探索并提升了对多种挥发性化合物中危害健康的自由基存在的认知。观看视频后，您应充分了解如何量化主流烟草烟雾中的自由基，以减少吸烟带来的有害影响。

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Research

科研

JoVE Journal

Bioengineering

生物工程

卷烟主流烟气中检测和清除气相自由基议定书

肺上皮细胞可从小鼠呼吸道分离，并在气液界面培养，作为分化型呼吸道上皮的模型。本文描述了一种分离、培养这些细胞并将其暴露于主流香烟烟雾的实验方案，以研究细胞对这种环境毒素的分子响应。...

小鼠呼吸道上皮细胞的分离及在气液界面暴露于实验性香烟烟雾

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全球使用电子烟（e-cig）的人数正在增加。然而，关于吸入电子烟气溶胶所引起的健康影响，目前知之甚少。本文介绍一种适用于动物暴露及后续毒理学研究的电子烟气溶胶生成技术。建立可实验重复且标准化的电子烟暴露系统，需要此类实验方案。...

使用第三代电子烟机产生电子烟气溶胶：在毒理学研究中的应用

本文描述了对DNA中的损伤产物8-氧代-7,8-二氢-2'-脱氧鸟苷（8-oxodGuo）、1,N6-乙烷-2'-脱氧腺苷（1,N6-dAdo）和1,N2-乙烷-2'-脱氧鸟苷（1,N2-dGuo）进行高灵敏度和准确测定的方法。这些方法已应用于评估暴露于细颗粒物（PM2.5）的A/J小鼠组织（肺、肝和肾）中的损伤效应。...

通过质谱法定量三种DNA损伤及其在暴露于环境细颗粒物小鼠组织中水平的评估

本方案展示了利用自行构建的全身吸入（WBI）暴露系统（WBIS）研究香烟烟雾（CS）病理生理效应的方法。该系统可在可控且可重复的条件下使动物暴露于香烟烟雾中，用于研究香烟烟雾对肺气肿和造血功能的影响。...

使用全身体吸入系统使小鼠暴露于香烟烟雾

了解利用自旋捕获电子自旋共振光谱法检测卷烟主流烟气中气相自由基并评估番茄红素、碧萝芷和葡萄籽提取物等植物抗氧化剂的清除能力的方法。该技术可定量分析自由基浓度并评估抗氧化剂效果。

一种用于检测和清除主流香烟烟雾中气相自由基的实验方案

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