一种用于检测和清除主流香烟烟雾中气相自由基的实验方案

本实验的总体目标是测量主流烟草烟雾中自由基的含量，并评估多种抗氧化剂的清除能力。首先制备含有多种不同清除剂化合物的滤膜，同时设置不含清除剂的滤膜作为对照。随后通过模拟吸烟过程，使研究用香烟产生的烟雾经过自旋捕获溶液，从而实现上述目标。

电子自旋共振（缩写为 ESR）被用于记录被捕获自由基以及参比样品的谱图。随后，对获得的 ESR 谱图进行常规分析，以将被捕获气相自由基的信号与背景信号分离，并利用参比样品对自由基浓度进行定量。最终，结果提供了关于香烟主流烟雾中自由基含量的定量信息，以及通过自旋捕获 ESR 波谱法对天然抗氧化剂清除能力的评估。

与现有的烟草烟雾分析方法（如气相色谱法）相比，该技术的主要优势在于电子自旋共振（ESR）对自由基具有特异性的敏感性。该技术的应用有助于减少烟草烟雾的危害效应，因为自由基是致癌物中的一个重要类别。该方法可为研究烟草烟雾中的自由基提供深入见解，也可应用于其他系统，如工业烟尘排放和烟熏环境。国家生物医学电子自旋共振技术研究中心，简称Cert，是我们长期致力于现代ESR技术研发经验的成果延伸。

对于从事电子自旋共振研究的研究人员，我们为他们以及生物医学领域提供了多种多样的服务。我们定期开放实验设施，以将抗氧化剂引入香烟滤嘴。首先，将抗氧化剂、碧萝芷（pycnogenol）和葡萄提取物溶解于95%乙醇中，并将番茄红素溶解于丙酮中。

根据抗氧化剂的溶解度调整溶剂体积。随后，在厌氧条件下将溶解的抗氧化剂与活性炭混合，搅拌约12小时。通过在搅拌过程中向混合物中通入Argonne气体以实现厌氧条件。

孵育结束后，将溶液过滤并在真空条件下干燥。然后将抗氧化剂和碳加入到一个常规的醋酸纤维滤棒中，首先将滤棒切成两段。将涂有植物抗氧化剂的材料夹在两段滤棒之间，形成一种滤棒-抗氧化剂-滤棒的三明治结构，再将其重新插入香烟的纸筒中。

对照滤片的制备方法与抗氧化滤片相同，但在实验设置前不添加抗氧化剂。研究用香烟应拆开包装，并使用饱和溴化钠溶液在恒定湿度环境中至少放置两天。取出含有烟草的烟支，并将其连接到组合滤片上。

使用单通道吸烟装置在常温下进行常规分析的吸烟模拟，该装置由一个水流抽吸器或真空泵/空气压缩机通过T型接头连接至自旋捕获组件构成，T型接头一端开放。使用流量计检测气体流速，并通过调节泵与排气口之间的阀门将流速设定在约每小时2.2标准立方英尺。采用每次35毫升、持续2秒的强烈抽吸模式点燃研究用香烟，并每60秒重复一次。

应堵住吸烟装置的开口端以进行抽吸，并在两次抽吸之间保持开口。当开口端未堵塞时，通过香烟的气流很小，这对应于两次抽吸之间的条件。每支香烟采集10次强力抽吸，通过将主流香烟烟雾穿过剑桥滤片来收集气相自由基，然后将其引入自旋捕获溶液中。

液氮捕集阱可去除主流烟雾中的水蒸气，但不会显著影响气相自由基。在最后一次抽吸后，将一部分通入气泡捕集液转移至一支长约10英寸、内径为3毫米的玻璃样品管中。由于氧气会加宽电子自旋共振（ESR）谱线并降低方法的灵敏度，因此需采用冷冻-抽气-解冻法对溶液进行脱氧处理：首先将样品管浸入液氮中冷冻，然后用油泵对溶液进行抽真空，最后在氩气氛围下解冻溶液。

重复此冻融抽气法数次。然后，在真空条件下密封该管。此时，该管已准备就绪。

为进一步进行电子自旋共振（ESR）测量，使用布鲁克EMX波谱仪在9.34吉赫兹频率下记录X波段ESR谱。在标准条件下，请参考书面实验方案中所述的典型波谱仪设置参数。本实验需进行25次ESR信号累加，通常耗时约20分钟。

尽管自旋捕获物在实验条件下放置12小时后相对稳定，但在苯溶液中其电子自旋共振（ESR）信号强度降低了五倍。为了定量测定捕获产物的浓度，需对初始的一阶导数ESR谱图进行积分。所得吸收光谱显示一个宽的单重态背景信号，这很可能归因于烟雾中含有的炭黑和焦油产物。

扣除本底后，对捕获自由基的三重峰进行积分，再进行一次计算以获得自由基浓度。将自旋捕获溶液的双重积分值与已知浓度的硝rox自由基tempo溶液的积分值进行比较，后者来自本实验展示的结果以及书面方案中提供的其他计算数据。

测得香烟主流烟雾气相中自由基浓度约为 7.1 × 10⁻⁹ 摩尔。据此计算出，从一支完整香烟的气相中捕获的自由基总数约为 1.5 × 10¹⁵。在本实验过程中，初期测量因烟流中的水分导致电子自旋共振（ESR）信号较弱且重复性差。

为解决这一问题，在吸烟模拟装置中的剑桥滤片与自旋捕获溶液之间增加了液氮捕集阱。液氮捕集阱通过快速冷冻并将水分捕获在玻璃管内壁的方式，去除了主流香烟烟雾气流中的水分。这显著改善了电子自旋共振（ESR）信号，并实现了高度可重复的实验结果。

观察到植物抗氧化剂对主流烟气中气相自由基的清除作用具有不同水平，并展示了它们的清除率。番茄红素和葡萄籽提取物表现出最高的清除率，而碧萝芷的清除率较低。一旦掌握，该技术若操作得当，可在一小时内完成。

进行该操作时，必须将烟雾通过液氮捕集阱。这有助于提高SR谱的质量及其后续开发的可重复性。该技术已帮助从事健康与环境研究的科研人员探索并提升了对多种挥发性化合物中危害健康的自由基存在的认知。

观看视频后，您应充分了解如何量化主流烟草烟雾中的自由基，以减少吸烟带来的有害影响。