Name: 监测劈开caspase - 3活性和钾诱导膜去极化使用活细胞成像和Cleaveable荧光染料基板的永生的少突胶质细胞凋亡 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-01-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 45 s
Description: 学习使用NucView 488底物对永生化N19少突胶质细胞进行活细胞成像，实时监测caspase-3介导的细胞凋亡过程。该方法可动态观察细胞死亡，适用于多种细胞类型和组织研究。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

本实验室得到了加拿大卫生研究院、加拿大自然科学与工程研究理事会以及加拿大多发性硬化症学会（MSSC）的支持。GSTS 获得了来自加拿大多发性硬化症学会（MSSC）的博士研究生奖学金。我们感谢多伦多病童医院 Joan Boggs 博士对本文稿提出的许多有益讨论和意见。我们感谢 Biotium 慷慨赠送额外的 NucView 488 caspase-3 试剂。

1. 解冻与培养细胞
<ol>
 <li>从长期液氮储存中获取冻存的永生化 N19-少突胶质细胞株。</li>
 <li>将含有细胞的冻存管浸入 37 °C 水浴中，直至细胞悬液完全解冻。</li>
 <li>向一个 10 cm 培养皿中加入 7 mL 高糖 DMEM（Dulbecco 改良 Eagle 培养基），并添加 10% 胎牛血清（FBS）和 1% 青霉素/链霉素。</li>
 <li>将细胞悬液逐滴加入培养皿中，并轻轻晃动和摇动培养皿，使细胞均匀分散。</li>
 <li>将细胞置于 34 °C、5% CO2 的培养箱中进行培养。</li>
 <li>4 小时后，吸除培养皿中的培养基，以去除用作冷冻保护剂的残留 DMSO（二甲基亚砜），并更换为新鲜培养基（7 mL 高糖 DMEM 培养基，添加 10% FBS 和 1% 青霉素/链霉素）。</li>
</ol>
2. 细胞传代
<ol>
 <li>当细胞生长至70-80%融合度（培养4-7天）时，吸除培养基。</li>
 <li>向培养板中加入1 mL 0.25%胰蛋白酶，用移液器吹打使细胞脱落（约5分钟）。</li>
 <li>根据实验条件进行相应稀释，并以不低于0.1 × 106 个细胞/mL的细胞密度传代接种另一块10 cm培养板，用于后续实验。</li>
</ol>
注意： 细胞复苏后，应在用于实验前至少传代两次。
3. 细胞计数与接种
<ol>
 <li>进行活细胞成像的细胞接种时，按先前所述方法进行胰酶消化。</li>
 <li>取约 30 μL 细胞悬液，使用血细胞计数板进行细胞计数。</li>
 <li>将未包被的玻璃盖玻片放入 6 孔板中。每孔加入 2 mL 无酚红高糖 DMEM 培养基，其中含 10% 胎牛血清和 1% 青霉素/链霉素，细胞接种密度为 0.1 × 106 个细胞/mL，在 34 °C、5% CO2 条件下培养。</li>
 <li>转染前，在 34 °C、5% CO2 条件下培养细胞过夜（16–20 小时）。</li>
</ol>
4. 转染
<ol>
 <li>将100 μL无血清培养基、0.5–4 μg纯化的质粒DNA和4 μL FuGENE HD（Roche）混合。轻轻涡旋混匀。</li>
 <li>再次短暂涡旋，室温孵育5分钟使DNA形成复合物，然后将FuGENE HD-DNA混合物直接加入培养的细胞中。轻轻倾斜培养板以混匀。</li>
 <li>在处理或进行实验前，将细胞在34 °C、5% CO2条件下继续培养48小时。</li>
</ol>
5. 活细胞成像（LCI）的细胞准备
<ol>
 <li>在开始实验前至少1小时打开LCI Chamlide活细胞成像系统控制箱。该控制箱还可调节LCI Chamlide内的温度和湿度，并控制预混5% CO2气体的流速。</li>
</ol>
注意： 建议在开始实验前最多提前 3 小时打开控制箱，以确保整个载物台达到 34 °C。此步骤可减少成像过程中因金属载物台受热导致的流动和热膨胀所引起 的焦平面漂移。
<ol start="2">
 <li>在超净工作台内，用70%乙醇喷洒Chamlide磁性培养室和镊子，并静置5分钟使其干燥。</li>
 <li>从培养箱中取出细胞，确认细胞状态良好。健康的细胞应贴附在玻璃盖玻片上，形态铺展充分，具有丰富的膜突起。因转染而受到应激的细胞不适合进行实验，这类细胞的突起数量减少，细胞核常呈不规则形状。</li>
 <li>倾斜6孔板，用镊子取出盖玻片，迅速将细胞面朝上放入培养室的底板中。注意避免盖玻片干燥。</li>
 <li>将培养室的磁性主体部分安装到位，并从原6孔板中吸取500 μL培养基，加至盖玻片表面。重复使用该培养基可减少因环境变化对细胞造成的应激，同时也有助于评估细胞外分泌因子。</li>
 <li>将玻璃盖盖在培养室上。</li>
 <li>使用经70%乙醇喷洒过的KimWipe擦拭盖玻片底部残留物，以免影响显微镜观察。</li>
 <li>将培养室置于34 °C/5% CO2培养箱中孵育30分钟。此步骤可确保培养室本身升温至34 °C，从而减少金属部件升温过程中引起的盖玻片位移。</li>
</ol>
6. 显微镜设置
此处使用配备定制中继透镜和发射滤光片轮盒的Leica DMIRE2倒置显微镜进行图像采集，该滤光片轮盒可支持多个滤光片轮（Quorum Technologies Inc.，加拿大安大略省贵湖市）的盒式装载。
<ol>
 <li>明场成像——灯电压设置为 2.5 V，曝光时间为 240 ms。</li>
 <li>红色荧光蛋白（RFP）——增益设置为 140，曝光时间为 200 ms。</li>
 <li>绿色荧光蛋白（GFP）——增益设置为 140，曝光时间为 500 ms。</li>
 <li>我们的显微镜采用可调光光源，而非转盘装置来控制照射到细胞的光量。实验中光源强度设置为最大亮度的 90%。</li>
</ol>
7. 使用凋亡诱导剂和NucView 488 Caspase-3 底物处理细胞
<ol>
 <li>提前配制大量细胞凋亡诱导剂并分装冻存非常重要，以确保不同实验间诱导剂浓度的一致性。</li>
 <li>NucView 488 底物对光敏感。建议将底物分装为每管 15 μL，以减少冻融次数，并将管子用铝箔包裹后于 -20 °C 保存。在使用前，应尽可能降低实验室环境光照强度，以减少 NucView 488 底物的光照暴露。</li>
 <li>从培养箱中快速取出培养腔，避免细胞因温度下降而受影响。将培养腔置于显微镜的环境培养箱上，并使用夹具固定，防止其移动。此时也应调暗室内灯光。</li>
 <li>打开带有双级调节阀的 5% 预混 CO2 气瓶。</li>
 <li>使用 10x 物镜，通过明场显微镜在计算机显示器上聚焦以找到细胞。注意：应选择在所需放大倍数下具有最大数值孔径的物镜，以缩短曝光时间。</li>
 <li>向细胞中加入细胞凋亡诱导剂（在本实验中为 80 mM 钾离子或 100 mM 谷氨酸），可采用以下任一方法。此处以使用 KCl 溶于常规培养基配制成 10 倍浓缩液来递送 80 mM 钾离子为例进行说明。
 <ol>
 <li>通过缓慢局部灌流进行培养基更换： 
 - 使用蠕动泵将培养腔中的培养基更换为含有 80 mM 钾离子的新培养基。 
 - 管路一端向腔内输送 10 mL 溶于无酚 DMEM 的 80 mM 钾离子储备液，另一端则从腔内移除原有培养基。 
 - 应至少实现 10 倍体积的培养基更换，以确保腔内残留培养基中的钾离子浓度准确。 
 - 培养基更换完成后，在腔内加入 3 μL NucView 488 底物，用移液器吹打混匀。</li>
 <li>直接向培养腔内的培养基中添加 80 mM K+ 和 NucView 488 底物： 
 - 配制溶于无酚 DMEM 的 80 mM 钾离子 10 倍储备液。 
 - 将 3 μL NucView 488 底物加入 50 μL 10 倍浓度的 80 mM 钾溶液中，吹打混匀后，加入至含有 500 μL 无酚 DMEM 的培养腔中。 
 注意：若需维持或评估原始培养基中可能存在的细胞生长或其他分泌因子，推荐使用此方法。我们发现 NucView 488 底物在细胞培养环境中稳定性良好，适用于长达 36 小时的实验。</li>
 </ol>
 </li>
</ol>
8. 活细胞成像
<ol>
 <li>点击红色通道以显示转染的细胞。</li>
 <li>选择并保存大约十几个含有多个转染细胞的视野，并保存这些“X-Y 载物台位置”。根据计算机内存的大小，您可获取的载物台位置数量可能受限。</li>
 <li>让显微镜每隔 6 分钟在这些已保存的位置自动采集图像（明场、红色通道和绿色通道）。</li>
 <li>在实验早期阶段可见的任何绿色染色，通常表明细胞已开始发生凋亡，这通常是由于转染和/或环境应激所致。由实验处理引起的细胞凋亡将在实验的后期时间点被检测到。</li>
</ol>
9. 统计分析
<ol>
 <li> 每次实验中，我们对显微镜进行编程，以采集多个X-Y位点，从而高效地获取大量数据。每次实验均设置重复两次或三次，并整合在不同日期进行的独立实验数据。对于每组数据集，我们分析最多15个视野，计算caspase阴性细胞与caspase阳性细胞的比例（视野中细胞总数 / caspase阳性细胞总数）。 </li>
 <li>将每组数据集中记录的测量值归入更大的样本集，随后使用方差分析表（ANOVA，p = 0.05）进行相互比较。我们展示各实验的均值标准误（SEM），并通过Tukey均值比较检验（p = 0.05）分析均值间的差异，以确定不同处理组之间是否存在显著差异。</li>
</ol>
10. 代表性结果
我们描述了一项实验，用于说明NucView 488底物如何在高细胞外钾浓度处理后，指示N19-OLG细胞培养物凋亡速率的增加。N19细胞被转染了RFP，分别用3 μL NucView 488底物（对照组）或3 μL NucView 488底物加80 mM [K+]（处理组）进行处理。细胞被持续监测，并在12小时的时间过程中采集图像，该时长足以用于涉及神经损伤的研究（图1A）。在对照条件下，我们未观察到明显的凋亡现象，而80 mM [K+]处理的培养物（带斜线框）在12小时后显示出约45%的细胞死亡（图1B）。对照条件下观察到的背景绿色信号，代表在未添加细胞外钾的情况下发生凋亡的细胞。在对照实验中，几乎没有任何细胞在12小时时间点出现凋亡，尽管在其他情况下实验可能需要更长时间。图像使用10倍物镜采集。标尺 = 100 μm。
<img alt="显示80 mM K+处理下细胞凋亡的荧光显微镜结果，对照比较图" src="/files/ftp_upload/3422/3422fig1.jpg" data-altupdatedat="1761809329000" data-alt="图1"> 
图1. (A) 转染后48小时的N19 OLG细胞培养物在表达RFP-MBP（红色通道）的同时加入3 μL NucView 488 底物（绿色通道），进行为期12小时的时间序列实验。细胞培养物分别接受终浓度为80 mM [K+]的处理（左图），或不作处理作为对照（右图）。图像以每6分钟采集一次，与对照组相比，经80 mM [K+]处理的培养物中可在细胞核内（虚线框）观察到显著的活化型caspase-3（绿色信号）。(B) 活化型caspase-3阳性细胞所占百分比（通过视野中总细胞数除以caspase阳性细胞总数计算得出）。与对照条件相比，我们在K+处理12小时后观察到约45%的细胞死亡。
视频1. 转染后48小时的N19-OLG细胞在80 mM [K+]处理下，表达RFP-MBP（红色通道）并加入3 μL NucView 488底物（绿色通道）的12小时时间序列实验，包含明场图像及三通道合并图像。请<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3422/sVideo1_N19_OLGs_80mM_KCl.mov">点击此处</a>查看或下载该视频文件。
s视频 2. 转染后 48 小时的 N19-OLG 培养物表达 RFP-MBP（红色通道），并加入 3 μL NucView 488 底物（绿色通道）的 12 小时时间序列实验，同时展示明场图像及三通道合并图像。该培养物未施加任何处理，可见 N19-OLG 在显微镜视野中迁移，与经 80 mM [K+] 处理的细胞培养物形成对比（可参见 s视频 1）。请<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3422/sVideo2_N19_OLGs_control_no_treatment.mov">点击此处</a>查看或下载该视频文件。

<ol><li>Antczak, C., Takagi, T., Ramirez, C. N., Radu, C., Djaballah, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live-cell+imaging+of+caspase+activation+for+high-content+screening%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomol.+Screen%22%5BJournal%5D)">Live-cell imaging of caspase activation for high-content screening.</a> J. Biomol. Screen. 14, 956-969 (2009).</li>
<li>Cen, H., Mao, F., Aronchik, I., Fuentes, R. J., Firestone, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DEVD-NucView488%3A+a+novel+class+of+enzyme+substrates+for+real-time+detection+of+caspase-3+activity+in+live+cells%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB.+J%22%5BJournal%5D)">DEVD-NucView488: a novel class of enzyme substrates for real-time detection of caspase-3 activity in live cells.</a> FASEB. J. 22, 2243-2252 (2008).</li>
<li>de Calignon, A., Fox, L. M., Pitstick, R., Carlson, G. A., Bacskai, B. J., Spires-Jones, T. L., Hyman, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caspase+activation+precedes+and+leads+to+tangles%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Caspase activation precedes and leads to tangles.</a> Nature. 464, 1201-1204 (2010).</li>
<li>Eldadah, B. A., Faden, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caspase+pathways%2C+neuronal+apoptosis%2C+and+CNS+injury%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurotrauma%22%5BJournal%5D)">Caspase pathways, neuronal apoptosis, and CNS injury.</a> J. Neurotrauma. 17, 811-829 (2000).</li>
<li>Foster, L. M., Phan, T., Verity, A. N., Bredesen, D., Campagnoni, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+and+analysis+of+normal+and+shiverer+temperature-sensitive+immortalized+cell+lines+exhibiting+phenotypic+characteristics+of+oligodendrocytes+at+several+stages+of+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Generation and analysis of normal and shiverer temperature-sensitive immortalized cell lines exhibiting phenotypic characteristics of oligodendrocytes at several stages of differentiation.</a> Dev. Neurosci. 15, 100-109 (1993).</li>
<li>Fulton, D., Paez, P. M., Fisher, R., Handley, V., Colwell, C. S., Campagnoni, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+L-type+Ca%28%2B%2B%29+currents+and+process+morphology+in+white+matter+oligodendrocyte+precursor+cells+by+golli-myelin+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Regulation of L-type Ca(++) currents and process morphology in white matter oligodendrocyte precursor cells by golli-myelin proteins.</a> Glia. 58, 1292-1303 (2010).</li>
<li>Hisahara, S., Okano, H., Miura, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caspase-mediated+oligodendrocyte+cell+death+in+the+pathogenesis+of+autoimmune+demyelination%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci.+Res%22%5BJournal%5D)">Caspase-mediated oligodendrocyte cell death in the pathogenesis of autoimmune demyelination.</a> Neurosci. Res. 46, 387-397 (2003).</li>
<li>Lau, A., Tymianski, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glutamate+receptors%2C+neurotoxicity+and+neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Pflugers.+Arch%22%5BJournal%5D)">Glutamate receptors, neurotoxicity and neurodegeneration.</a> Pflugers. Arch. 460, 525-542 (2010).</li>
<li>Lawrence, M. S., Ho, D. Y., Sun, G. H., Steinberg, G. K., Sapolsky, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overexpression+of+Bcl-2+with+herpes+simplex+virus+vectors+protects+CNS+neurons+against+neurological+insults+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Overexpression of Bcl-2 with herpes simplex virus vectors protects CNS neurons against neurological insults in vitro and in vivo.</a> J. Neurosci. 16, 486-496 (1996).</li>
<li>Paez, P. M., Spreuer, V., Handley, V., Feng, J. M., Campagnoni, C., Campagnoni, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+expression+of+golli+myelin+basic+proteins+enhances+calcium+influx+into+oligodendroglial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Increased expression of golli myelin basic proteins enhances calcium influx into oligodendroglial cells.</a> J. Neurosci. 27, 12690-12699 (2007).</li>
<li>Sanchez Mejia, R. O., Friedlander, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caspases+in+Huntington%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscientist%22%5BJournal%5D)">Caspases in Huntington's disease.</a> Neuroscientist. 7, 480-489 (2001).</li>
<li>Smith, G. S. T., De Avila, M., Paez, P., Spreuer, V., Wills, M. K. B., Jones, N., Boggs, J. M., Harauz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proline+substitutions+and+threonine+pseudo-phosphorylation+of+the+SH3-ligand+of+18.5+kDa+myelin+basic+protein+decrease+affinity+for+the+Fyn-SH3-domain+and+alter+process+development+and+protein+localization+in+oligodendrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Res%22%5BJournal%5D)">Proline substitutions and threonine pseudo-phosphorylation of the SH3-ligand of 18.5 kDa myelin basic protein decrease affinity for the Fyn-SH3-domain and alter process development and protein localization in oligodendrocytes.</a> J. Neurosci. Res. , Forthcoming (2011).</li>
<li>Smith, G. S. T., Paez, P. M., Spreuer, V., Campagnoni, C. W., Boggs, J. M., Campagnoni, A. T., Harauz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Classical+18.5-and+21.5-kDa+isoforms+of+myelin+basic+protein+inhibit+calcium+influx+into+oligodendroglial+cells%2C+in+contrast+to+golli+isoforms%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Res%22%5BJournal%5D)">Classical 18.5-and 21.5-kDa isoforms of myelin basic protein inhibit calcium influx into oligodendroglial cells, in contrast to golli isoforms.</a> J. Neurosci. Res. 89, 467-480 (2011).</li>
<li>Springer, J. E., Azbill, R. D., Knapp, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+the+caspase-3+apoptotic+cascade+in+traumatic+spinal+cord+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">Activation of the caspase-3 apoptotic cascade in traumatic spinal cord injury.</a> Nat. Med. 5, 943-946 (1999).</li>
<li>Verity, A. N., Bredesen, D., Vonderscher, C., Handley, V. W., Campagnoni, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+myelin+protein+genes+and+other+myelin+components+in+an+oligodendrocytic+cell+line+conditionally+immortalized+with+a+temperature-sensitive+retrovirus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Expression of myelin protein genes and other myelin components in an oligodendrocytic cell line conditionally immortalized with a temperature-sensitive retrovirus.</a> J. Neurochem. 60, 577-587 (1993).</li>
<li>Yu, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+and+critical+role+of+potassium+homeostasis+in+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Prog.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Regulation and critical role of potassium homeostasis in apoptosis.</a> Prog. Neurobiol. 70, 363-386 (2003).</li>
</ol>

作者声明无利益冲突。

尽管这不是唯一可用于凋亡检测的荧光生成型产物，但使用NucView 488底物具有多个显著优势。其中一个主要优点是能够实时动态监测活细胞中的细胞凋亡过程，而大多数其他替代产品则需要裂解细胞或细胞通透性较差。其他优点包括对caspase-3的高度敏感性、良好的细胞通透性、低细胞毒性，以及不会干扰细胞凋亡进程。该底物在被切割并进入细胞核之前具有很低的背景荧光，从而消除了背景信号。caspase-3识别序列含有3个负电荷，而DNA结合染料带有1个正电荷2。因此，DEVD-NucView 488分子整体带负电荷，这可防止染料在caspase未激活的细胞中发生活化并结合DNA。
为了能够在重复实验之间进行有意义的比较，必须保持实验间的一致性。其中需要保持一致的主要参数之一是细胞密度，因为其会影响转染效率。根据我们的经验，与HeLa或HEK293等其他常见细胞系相比，在永生化的N19-OLG细胞培养中实现高转染率更为困难，且转染效率高度依赖于细胞密度12, 13。对于这些细胞，我们使用Fugene HD（Roche）获得了最佳的转染效率，通常约为15%，但根据所用质粒的不同，有时可超过30%。精确的细胞计数有助于获得稳定的转染效率。此外，在检测细胞凋亡率等指标时，还应确保不同处理组的细胞所经历的环境应激程度相同。具体而言，细胞暴露于转染试剂的时间长短或光照暴露量等环境变量均需加以考虑，并在不同实验间保持恒定。就我们的应用而言，发现采集大量视野图像可提供足够大的样本量，从而进行具有统计学意义的比较[ibid]。

<table><tbody><tr><td colspan="4">特定试剂与设备清单</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;NucView 488&lt;/em&gt; 活细胞Caspase-3 检测试剂盒</td><td>Biotium, Inc.</td><td>30029</td><td></td></tr><tr><td>FuGENE HD 转染试剂</td><td>罗氏集团</td><td>04709705001</td><td></td></tr><tr><td>杜尔贝科&amp;rsquo;s 改良伊格尔培养基</td><td>GIBCO，隶属于 Life Technologies</td><td>31053-028</td><td></td></tr><tr><td>0.25% 胰蛋白酶</td><td>GIBCO，隶属于 Life Technologies</td><td>15050-065</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>GIBCO，隶属于 Life Technologies</td><td>12483-020</td><td></td></tr><tr><td>青霉素/链霉素</td><td>GIBCO，隶属于 Life Technologies</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>#1.5-25 毫米玻璃盖玻片 </td><td>Warner Instruments</td><td>64-0715</td><td></td></tr><tr><td>&lt;p&gt;Chamlide CMB 25 mm 磁力培养皿&lt;/p&gt; 盖玻片</td><td>Quorum Technologies</td><td>CM-B-40</td><td></td></tr><tr><td>Cellstart 细胞培养 10 厘米培养皿 </td><td>VWR 国际公司</td><td>82050-576</td><td></td></tr><tr><td>BD Falcon 6 孔细胞培养板</td><td>VWR 国际公司</td><td>CA62406-161</td><td></td></tr></tbody></table>

通过活细胞成像和可裂解荧光染料底物监测永生化少突胶质细胞在钾离子诱导膜去极化后的活化半胱天冬酶-3活性及细胞凋亡

活化半胱天冬酶-3, 细胞凋亡, 永生化少突胶质细胞, 活细胞成像, 可裂解荧光底物, 膜去极化

Monitoring Cleaved Caspase-3 Activity and Apoptosis of Immortalized Oligodendroglial Cells using Live-cell Imaging and Cleaveable Fluorogenic-dye Substrates Following Potassium-induced Membrane Depolarization

中枢神经系统可能经历多种应激和神经损伤，这些因素可导致多种不利影响，最终引起神经元数量减少和功能下降。受损的轴突可将兴奋性分子（如钾离子或谷氨酸）释放到细胞外基质中，进而对支持性胶质细胞（包括星形胶质细胞和少突胶质细胞）造成进一步的损伤和伤害8, 16。如果损伤持续存在，细胞将发生程序性细胞死亡（凋亡），这一过程由多个已明确的信号转导级联通路进行调控和激活14。在创伤性脑损伤、脑缺血和癫痫发作后，均可出现细胞凋亡和组织坏死。经典的凋亡调控因子是半胱氨酸依赖性天冬氨酸定向蛋白酶家族，即caspases。已被激活的蛋白酶（如caspases）还被发现参与了阿尔茨海默病、亨廷顿病和多发性硬化等慢性神经退行性疾病中的细胞死亡过程4, 14, 3, 11, 7。
在本实验方案中，我们描述了使用NucView 488 caspase-3底物来检测永生化N19-少突胶质细胞（OLG）培养物中caspase-3介导的细胞凋亡速率15, 5，这些细胞在暴露于不同细胞外应激因素（如高浓度钾离子或谷氨酸）后发生凋亡。条件性永生化的N19-OLG细胞系（代表O2A前体细胞）由Anthony Campagnoni博士（加州大学洛杉矶分校神经科学Semel研究所）提供15, 5，此前已被用于研究髓鞘基因表达的分子机制以及导致少突胶质细胞分化的信号转导通路（例如6, 10）。我们发现该细胞系在转染外源性髓鞘碱性蛋白（MBP）构建体（与RFP或GFP，即红色或绿色荧光蛋白融合）方面具有良好的稳定性13, 12。在本实验中，N19-OLG细胞培养物分别用80 mM氯化钾或100 mM谷氨酸钠处理，以模拟轴突内容物泄漏至细胞外基质从而诱导细胞凋亡9。我们使用了一种双功能caspase-3底物，其包含一个DEVD（Asp-Glu-Val-Asp）caspase-3识别亚单位和一个DNA结合染料2。该底物可快速进入细胞质，并被细胞内的caspase-3切割。染料NucView 488被释放后进入细胞核，与DNA结合并在488 nm处发出绿色荧光，从而标记细胞凋亡的发生。使用NucView 488 caspase-3底物可实现对活细胞的实时成像1, 10。在本视频中，我们还介绍了永生化N19-OLG细胞的培养与转染方法，以及活细胞成像技术。

利用 NucView 488 caspase-3 底物对永生化 N19-少突胶质细胞培养物中 caspase-3 介导的细胞凋亡进行活细胞成像。该技术适用于多种细胞类型和组织中的程序性细胞死亡实时检测。

中枢神经系统可能遭受多种应激和神经损伤，这些因素可产生多种不利影响，最终导致……

该实验步骤可实现对寡突胶质细胞死亡的实时监测。首先培养细胞，随后对细胞进行活细胞成像前处理，接着对细胞施加处理因素，并利用荧光显微镜观察其效应。最后一步是进行数据分析。最终结果通过监测caspase激活的荧光染料产生的细胞核荧光，显示细胞群体在经过处理或刺激后的细胞死亡率。与免疫染色等现有方法相比，该技术的主要优势在于能够同时获取多个时间点的数据。该方法有助于解答细胞生物学中的关键问题，例如细胞对药物、试剂及各种处理的反应。目前，该方法可揭示细胞培养物中的细胞死亡情况，还可应用于其他系统，如离体、类器官组织，包括脑切片。通常，初次接触该方法的研究人员在适应活体组织操作而非固定组织时会遇到困难。由于与固定组织相比，活细胞样本的制备步骤较多，因此对该技术进行直观演示尤为重要。首先，在37摄氏度水浴中解冻冻存的永生化N 19寡突胶质细胞系细胞，解冻期间同时进行后续操作。向一个10厘米的培养皿中加入7毫升高糖DMEM，添加10%胎牛血清和1%青霉素-链霉素。然后将细胞悬液逐滴加入培养皿中，并轻轻晃动培养皿使细胞均匀分散。将细胞在含5%二氧化碳的培养箱中于34°C培养4小时，4小时后。吸弃培养板中的培养基，以去除残留的DMSO保护剂。在培养4至7天后，更换为7毫升新鲜培养基。当细胞融合度达到70%至80%时，吸弃培养基，并用移液器将1毫升消化液滴加到细胞层上，在室温下孵育5分钟。然后收集细胞，将收获的细胞以每毫升0.1×10⁶个细胞的密度接种到一个10厘米的组织培养皿中，并将该培养皿放入组织培养箱中。经过一次进一步传代后，细胞可用于活细胞成像实验。进行该实验时，按前述方法收集细胞，取30 µL细胞悬液，使用血细胞计数板对细胞进行计数。接下来，使用无菌镊子将未包被的玻璃盖玻片放入六孔板的孔中。每孔加入细胞，密度为每毫升0.1 × 10⁶个细胞。加入2 mL含10% FBS和1%青霉素-链霉素的无酚红高糖DMEM培养基，在34°C、5% CO₂条件下培养过夜，然后进行转染。第二天，将100微升无血清培养基与0.5至4微克纯化的质粒DNA以及4微升FU gene hd混合。轻轻涡旋振荡混合物两次，然后在室温下孵育5分钟，使DNA形成复合物。孵育结束后，直接将FU gene HD DNA混合物加入培养的细胞中。轻轻倾斜培养板以混匀。随后在处理或实验前，将细胞在34摄氏度和5%二氧化碳条件下继续培养48小时。首先打开LCI Cham light活细胞成像仪器的控制箱。应在实验开始前3小时进行此操作，以确保载物台充分预热。至少应在实验开始前1小时打开控制箱。接下来，在超净工作台内，用70%乙醇喷洒LCI Cham光磁式培养室和镊子，并静置5分钟使其干燥。从培养箱中取出细胞，在显微镜下观察以确认细胞状态健康。细胞应贴附于玻璃盖玻片上，形态饱满且充分铺展，具有丰富的膜突起。若细胞的突起数量减少，或细胞核形态不规则，则可能因转染而处于应激状态，不适合在通风橱中继续进行后续实验。倾斜六孔板，用镊子取出盖玻片。迅速将盖玻片有细胞的一面朝上放入孵育腔的底板中。切勿让盖玻片干燥。接下来，安装培养室的磁性主体部分，并从原始的六孔板中吸取500微升培养基，加入盖玻片顶部。重复使用原有培养基可减少因环境变化给细胞带来的应激反应，同时也有助于评估细胞外分泌因子。加入培养基后，将玻璃盖片放置到培养室上，用蘸有70%乙醇的Kimwipe编织布擦拭盖玻片底部，去除可能干扰显微观察的残留物质。将培养皿置于34摄氏度、5%二氧化碳的培养箱中孵育30分钟。此步骤可确保培养皿自身升温至34摄氏度，从而减少盖玻片的移位。当金属部件升温时，在后续操作中需尽可能降低环境光照强度。首先，Thora 之前已在室温下准备好了核视野的等渗溶液。然后从培养箱中取出培养腔，并迅速将其放入显微镜的环境腔内。打开带有双调节器的 5% 预混合二氧化碳气罐。接下来，使用10倍物镜，将显微镜光源调至约2.5伏，曝光时间为240毫秒。通过明场显微镜观察，在计算机显示器上聚焦细胞。然后通过蠕动泵进行缓慢且局部的灌流，更换培养基，向细胞中加入80毫摩尔浓度的钾离子或其他凋亡诱导剂。nuke view 4 88 基底在细胞培养中具有稳定性，适用于持续长达 36 小时的实验。因此，可以在此时间段内开展实验。首先设置显微镜，以观察红色和绿色荧光蛋白的荧光信号。然后点击红色通道以显示转染的细胞。选择并保存约12个包含多个转染细胞的图像帧，并保存这些XY载物台位置。设置显微镜在这些已保存的载物台位置每六分钟采集一次明场、红色通道和绿色通道的图像。在从重复或三重实验中收集多个 XY 数据点后，整合不同日期进行的独立实验数据，并按照书面实验方案中所述方法进行数据分析和统计检验，以比较 CASP bay 阴性细胞与 CASP bay 阳性细胞的比例。Nuke view 4 88 底物可提示 N 19 寡核苷酸 DDR 胶质细胞培养物的凋亡率升高。在使用高浓度细胞外钾处理后，采用 10 倍物镜采集了这些基线图像。N 19 细胞被转染了 RFP，并分别用三微升 Nuke View 488 底物处理对照细胞，或用三微升 Nuke View 488 底物和 80 毫摩尔钾处理。这些图像表明，在给予 80 毫摩尔钾处理后，随着时间的推移（3、6 和 9 小时），凋亡细胞的数量增加。在对照条件下，与经 80 毫摩尔钾处理的培养物相比，未观察到显著水平的细胞凋亡。在对照条件下观察到的背景绿色信号表明，这些细胞在未添加细胞外钾的情况下正在进行凋亡。对于涉及神经系统损伤的研究，12 小时的时间过程已足够。在 12 小时后，经钾处理的培养物显示出约 45% 的细胞死亡。在 12 小时时间点，对照实验中几乎没有任何细胞表现出凋亡。尽管在其他情况下，实验可能需要更长的运行时间。该图表显示了在12小时实验过程中，caspase-3阳性细胞数量随时间的增加情况。一旦熟练掌握，该技术可在1小时内完成，若操作得当，数据可整夜收集。在进行该实验时，重要的是要记住在不同处理组之间保持操作的一致性。其他方法，例如免疫染色，可用于检测所研究通路中涉及的其他下游蛋白。观看本视频后，您应能够充分理解如何制备用于成像的样品、获取数据集以及分析您的数据。

monitoring-cleaved-caspase-3-activity-apoptosis-immortalized

Research

科研

JoVE Journal

Neuroscience

神经科学

监测劈开caspase - 3活性和钾诱导膜去极化使用活细胞成像和Cleaveable荧光染料基板的永生的少突胶质细胞凋亡

本视频介绍了一种 体外 用于定量细胞死亡或凋亡的 Caspase-3/7 发光检测试剂盒。该检测通过 Caspase-3/7 对发光型 DEVD 底物的切割作用产生发光信号，所生成的发光强度与 Caspase-3/7...

Caspase-3/7 检测：一种基于发光法的检测技术，通过测定青蛙皮肤外植体中 Caspase-3/7 活性来定量凋亡

本视频展示了利用双分子荧光互补报告蛋白在人巨噬细胞中激活半胱天冬酶（caspase）蛋白的过程。将caspase-1的前结构域与非荧光性的Venus蛋白片段融合，这些片段可被招募至炎性小体复合物。炎性小体之间的空间接近性促使Venus片段重新折叠并产生荧光，从而证实巨噬细胞中caspase的激活。...

人源单核细胞衍生巨噬细胞中Caspase激活的可视化

多重检测可为细胞基本机制提供有益信息 并减少试剂浪费和不必要的重复实验。本文介绍一种多重caspase-3/7活性检测方法，采用基于荧光和发光的技术，用于测定细胞活力 体外...

利用Caspase多重检测法确定下丘脑细胞模型中的凋亡

“anastasis”一词指的是濒死细胞在细胞自杀过程的晚期逆转该过程，自我修复并最终存活下来的现象。本文中，我们展示了检测和追踪经历anastasis细胞的实验方案。...

追踪复生现象的策略：一种逆转细胞凋亡的细胞存活现象

为了研究炎性脱髓鞘疾病皮层病变中脱髓鞘和神经元凋亡的机制，需采用不同的动物模型。本文介绍一种离体（ex vivo）方法，即将少突胶质细胞特异性的CD8+...

一个 离体 少突胶质细胞靶向性T细胞攻击在急性脑切片中的模型

检测细胞回生现象在技术上具有挑战性 体内 因为经历细胞死亡逆转过程的细胞在形态上可能与正常的健康细胞难以区分。本文介绍了利用我们新开发的方法在活体动物中检测和追踪发生anastasis细胞的实验方案。 体内 CaspaseTracker...

检测细胞复苏 在体 内 通过CaspaseTracker生物传感器

本文介绍了一种详细方案，应用罗丹明123检测线粒体膜电位（MMP），并研究CLIC4基因敲低诱导的HN4细胞凋亡...

检测线粒体膜电位以研究CLIC4敲低诱导的HN4细胞凋亡 体外

本方案描述了半胱天冬酶双分子荧光互补（BiFC）技术；这是一种基于成像的方法，可用于可视化诱导起始半胱天冬酶的邻近效应，这是其激活的第一步。...

利用双分子荧光互补技术揭示半胱天冬酶激活通路

描述了两种相关方法，用于可视化突触传递所需的亚细胞事件。这些方案通过活细胞成像技术，实现对突触前钙离子内流和突触囊泡膜融合动态过程的实时监测。 体外...

肌萎缩侧索硬化症模型中突触功能的实时荧光检测

本方案描述了一种用于监测坏死性凋亡过程中溶酶体膜通透性的活细胞成像方法，该方法利用荧光探针检测溶酶体膜完整性和酸化状态的变化。...

活细胞成像技术观察坏死性凋亡过程中的溶酶体膜通透化

学习使用NucView 488底物对永生化N19少突胶质细胞进行活细胞成像，实时监测caspase-3介导的细胞凋亡过程。该方法可动态观察细胞死亡，适用于多种细胞类型和组织研究。

通过活细胞成像和可裂解荧光染料底物监测永生化少突胶质细胞在钾离子诱导膜去极化后的活化半胱天冬酶-3活性及细胞凋亡活化半胱天冬酶-3, 细胞凋亡, 永生化少突胶质细胞, 活细胞成像, 可裂解荧光底物, 膜去极化

探索更多视频

通过活细胞成像和可裂解荧光染料底物监测永生化少突胶质细胞在钾离子诱导膜去极化后的活化半胱天冬酶-3活性及细胞凋亡 活化半胱天冬酶-3, 细胞凋亡, 永生化少突胶质细胞, 活细胞成像, 可裂解荧光底物, 膜去极化

探索更多视频

通过活细胞成像和可裂解荧光染料底物监测永生化少突胶质细胞在钾离子诱导膜去极化后的活化半胱天冬酶-3活性及细胞凋亡活化半胱天冬酶-3, 细胞凋亡, 永生化少突胶质细胞, 活细胞成像, 可裂解荧光底物, 膜去极化