通过活细胞成像和可裂解荧光染料底物监测永生化少突胶质细胞在钾离子诱导膜去极化后的活化半胱天冬酶-3活性及细胞凋亡 活化半胱天冬酶-3, 细胞凋亡, 永生化少突胶质细胞, 活细胞成像, 可裂解荧光底物, 膜去极化

该实验步骤可实现对寡突胶质细胞死亡的实时监测。首先培养细胞，随后对细胞进行活细胞成像前处理，接着对细胞施加处理因素，并利用荧光显微镜观察其效应。

最后一步是进行数据分析。最终结果通过监测caspase激活的荧光染料产生的细胞核荧光，显示细胞群体在经过处理或刺激后的细胞死亡率。与免疫染色等现有方法相比，该技术的主要优势在于能够同时获取多个时间点的数据。

该方法有助于解答细胞生物学中的关键问题，例如细胞对药物、试剂及各种处理的反应。目前，该方法可揭示细胞培养物中的细胞死亡情况，还可应用于其他系统，如离体、类器官组织，包括脑切片。

通常，初次接触该方法的研究人员在适应活体组织操作而非固定组织时会遇到困难。由于与固定组织相比，活细胞样本的制备步骤较多，因此对该技术进行直观演示尤为重要。首先，在37摄氏度水浴中解冻冻存的永生化N 19寡突胶质细胞系细胞，解冻期间同时进行后续操作。

向一个10厘米的培养皿中加入7毫升高糖DMEM，添加10%胎牛血清和1%青霉素-链霉素。然后将细胞悬液逐滴加入培养皿中，并轻轻晃动培养皿使细胞均匀分散。将细胞在含5%二氧化碳的培养箱中于34°C培养4小时，4小时后。

吸弃培养板中的培养基，以去除残留的DMSO保护剂。在培养4至7天后，更换为7毫升新鲜培养基。当细胞融合度达到70%至80%时，吸弃培养基，并用移液器将1毫升消化液滴加到细胞层上，在室温下孵育5分钟。

然后收集细胞，将收获的细胞以每毫升0.1×10⁶个细胞的密度接种到一个10厘米的组织培养皿中，并将该培养皿放入组织培养箱中。经过一次进一步传代后，细胞可用于活细胞成像实验。进行该实验时，按前述方法收集细胞，取30 µL细胞悬液，使用血细胞计数板对细胞进行计数。

接下来，使用无菌镊子将未包被的玻璃盖玻片放入六孔板的孔中。每孔加入细胞，密度为每毫升0.1 × 10⁶个细胞。加入2 mL含10% FBS和1%青霉素-链霉素的无酚红高糖DMEM培养基，在34°C、5% CO₂条件下培养过夜，然后进行转染。

第二天，将100微升无血清培养基与0.5至4微克纯化的质粒DNA以及4微升FU gene hd混合。轻轻涡旋振荡混合物两次，然后在室温下孵育5分钟，使DNA形成复合物。孵育结束后，直接将FU gene HD DNA混合物加入培养的细胞中。

轻轻倾斜培养板以混匀。随后在处理或实验前，将细胞在34摄氏度和5%二氧化碳条件下继续培养48小时。首先打开LCI Cham light活细胞成像仪器的控制箱。

应在实验开始前3小时进行此操作，以确保载物台充分预热。至少应在实验开始前1小时打开控制箱。接下来，在超净工作台内，用70%乙醇喷洒LCI Cham光磁式培养室和镊子，并静置5分钟使其干燥。

从培养箱中取出细胞，在显微镜下观察以确认细胞状态健康。细胞应贴附于玻璃盖玻片上，形态饱满且充分铺展，具有丰富的膜突起。若细胞的突起数量减少，或细胞核形态不规则，则可能因转染而处于应激状态，不适合在通风橱中继续进行后续实验。

倾斜六孔板，用镊子取出盖玻片。迅速将盖玻片有细胞的一面朝上放入孵育腔的底板中。切勿让盖玻片干燥。

接下来，安装培养室的磁性主体部分，并从原始的六孔板中吸取500微升培养基，加入盖玻片顶部。重复使用原有培养基可减少因环境变化给细胞带来的应激反应，同时也有助于评估细胞外分泌因子。加入培养基后，将玻璃盖片放置到培养室上，用蘸有70%乙醇的Kimwipe编织布擦拭盖玻片底部，去除可能干扰显微观察的残留物质。

将培养皿置于34摄氏度、5%二氧化碳的培养箱中孵育30分钟。此步骤可确保培养皿自身升温至34摄氏度，从而减少盖玻片的移位。当金属部件升温时，在后续操作中需尽可能降低环境光照强度。

首先，Thora 之前已在室温下准备好了核视野的等渗溶液。然后从培养箱中取出培养腔，并迅速将其放入显微镜的环境腔内。打开带有双调节器的 5% 预混合二氧化碳气罐。

接下来，使用10倍物镜，将显微镜光源调至约2.5伏，曝光时间为240毫秒。通过明场显微镜观察，在计算机显示器上聚焦细胞。然后通过蠕动泵进行缓慢且局部的灌流，更换培养基，向细胞中加入80毫摩尔浓度的钾离子或其他凋亡诱导剂。

nuke view 4 88 基底在细胞培养中具有稳定性，适用于持续长达 36 小时的实验。因此，可以在此时间段内开展实验。首先设置显微镜，以观察红色和绿色荧光蛋白的荧光信号。

然后点击红色通道以显示转染的细胞。选择并保存约12个包含多个转染细胞的图像帧，并保存这些XY载物台位置。设置显微镜在这些已保存的载物台位置每六分钟采集一次明场、红色通道和绿色通道的图像。

在从重复或三重实验中收集多个 XY 数据点后，整合不同日期进行的独立实验数据，并按照书面实验方案中所述方法进行数据分析和统计检验，以比较 CASP bay 阴性细胞与 CASP bay 阳性细胞的比例。Nuke view 4 88 底物可提示 N 19 寡核苷酸 DDR 胶质细胞培养物的凋亡率升高。在使用高浓度细胞外钾处理后，采用 10 倍物镜采集了这些基线图像。

N 19 细胞被转染了 RFP，并分别用三微升 Nuke View 488 底物处理对照细胞，或用三微升 Nuke View 488 底物和 80 毫摩尔钾处理。这些图像表明，在给予 80 毫摩尔钾处理后，随着时间的推移（3、6 和 9 小时），凋亡细胞的数量增加。在对照条件下，与经 80 毫摩尔钾处理的培养物相比，未观察到显著水平的细胞凋亡。在对照条件下观察到的背景绿色信号表明，这些细胞在未添加细胞外钾的情况下正在进行凋亡。

对于涉及神经系统损伤的研究，12 小时的时间过程已足够。在 12 小时后，经钾处理的培养物显示出约 45% 的细胞死亡。在 12 小时时间点，对照实验中几乎没有任何细胞表现出凋亡。尽管在其他情况下，实验可能需要更长的运行时间。

该图表显示了在12小时实验过程中，caspase-3阳性细胞数量随时间的增加情况。一旦熟练掌握，该技术可在1小时内完成，若操作得当，数据可整夜收集。在进行该实验时，重要的是要记住在不同处理组之间保持操作的一致性。

其他方法，例如免疫染色，可用于检测所研究通路中涉及的其他下游蛋白。观看本视频后，您应能够充分理解如何制备用于成像的样品、获取数据集以及分析您的数据。