小鼠视网膜经视网膜电图记录：视杆细胞与视锥细胞的光反应

本实验的总体目标是通过对分离的完整小鼠视网膜进行经视网膜电图记录，获得视杆细胞和视锥细胞驱动的光反应。首先准备用于记录的玻璃毛细管和灌流室。将暗适应小鼠的两个眼球杯状组织进行半切处理。

在红外照明下，移除角膜、晶状体和玻璃体。将视网膜从色素上皮层剥离，并将其感光细胞面朝上置于滤纸上。随后将带有视网膜的滤纸转移至显微镜载物台上的灌流室中，并放置于两个电极之间，电极连接至差分放大器的前置放大级。

最后，从平铺的小鼠视网膜记录由视杆细胞和视锥细胞介导的光反应。与传统的单细胞记录等现有方法相比，该技术的主要优势在于，能够对正常类型及基因修饰小鼠的视杆细胞和视锥细胞进行长时间且可施加药物的记录。该方法在获取稀有且脆弱的小鼠视网膜稳定、强健的光反应方面正变得尤为有用。

首先准备玻璃毛细管。在热水浴中配制10毫升1.2%的琼脂溶液。使用塑料注射器将琼脂溶液注入玻璃毛细管中，琼脂会迅速凝固。

使用金刚石刀将毛细管切成两半。将制备好的玻璃电极浸泡在小鼠电极溶液中，在4°C条件下至少浸泡24小时。现在开始常规准备显微镜，以尽量减少机械噪声和电磁噪声。

将显微镜安装在防震台上，并置于法拉第笼内屏蔽。然而，这些措施并非必需。使用位于视网膜平面的光度计校准光源。

对于LED光源，使用塑料管和玻璃毛细管作为光学漫射器，以实现光照均匀。将下电极与电极支架连接，然后向灌流室的下电极空间中加入电极液。

确保电极、连接管路或电极夹中无气泡。若存在气泡，可用注射器冲洗溶液以排除。将记录室置于显微镜下后，将下部电极夹连接至差分放大器的正极探头端。

然后将灌流液（含95%氧气、5%二氧化碳的碳酸氢盐缓冲液）置于40摄氏度水浴中孵育，使其pH值达到7.2，再将记录 chamber 的下电极开口与刺激光斑气泡居中对齐，并将灌流管路连接至记录 chamber，开启灌流。

溶液依靠重力从瓶子流入记录室。流经陶瓷电阻时，被重新加热至36或37摄氏度。为减少热量散失，加热器应尽可能靠近记录室放置。

理想情况下，在显微镜载物台上，将流速调节器设置在溶液通路中，并将其调节至约每分钟一毫升。现在，使用电极夹和O形圈将上电极连接到头段的第二个负极，将热电偶探针固定在该电极上，使其尖端尽可能靠近，以便温度读数在视网膜中心附近获取。接下来，将上电极的尖端浸入灌流液中，并将其置于记录腔的中央位置。

静置10至15分钟以使基线稳定。最后，调节加热器的直流电压，使溶液温度维持在36至37摄氏度。通过将小鼠置于黑暗环境中过夜，使其适应黑暗环境。

使用野生型小鼠（如 C57BL/6）进行视杆细胞驱动的视网膜电图记录，或使用缺乏视杆细胞信号传导的视杆细胞转导素α亚基敲除小鼠进行视锥细胞视网膜电图记录。在进入暗室操作前，准备一张方形滤纸，在其中心打一个直径 2 至 2.5 毫米的孔，并在滤纸四角涂抹油脂。以下所有步骤均需在红外光下进行。解剖显微镜配备有红外图像转换器，用于观察半切开的眼球。

取出双眼的角膜和晶状体，尽量在操作过程中去除尽可能多的玻璃体。随后每次操作一个眼杯。

第二个眼杯可保存数小时，将其置于盛有孵育溶液的培养皿中，并放入充满纯氧且保持室温的透光盒内，以用于全视网膜记录。从色素上皮层剥离第一层视网膜，如有必要，用镊子彻底清理残留的色素上皮颗粒。若需记录视网膜背侧区域，可在剥离视网膜前，使用刀片或显微剪刀去除眼杯的腹侧部分。

根据corry标记物的参考，去除腹侧眼杯。用移液器将分离的视网膜转移至培养皿盖上的一滴灌流液中。然后加入五到六小滴含有氯化钡的电极溶液。

用镊子将带有小孔的制备滤膜放置于一滴灌流液中，并连同视网膜一起操作。将视网膜置于滤纸上方，感光细胞侧朝上。然后从周边轻轻按压边缘，使其展平固定。

视网膜应居中置于滤纸的开孔上方。现在将带有视网膜的滤纸转移至灌流室，并放置在与下部电极空间对齐的刺激点上方。轻轻按压滤纸的凡士林边缘，使其与灌流室粘合。

最后，将上部电极置于视网膜中心上方，使电极轻微接触光感受器层。现在开始进行跨视网膜记录实验。在我们的分析中，使用 Molecular Devices 公司的 Peak Lamp 10 数据采集与分析软件。

在长时间记录过程中，我们使用了该LED光源发出的505纳米LED光。为了有效抑制光反应中的胶质成分，需更换下层电极溶液。每次测试前，每只视网膜均应达到充分准备状态。

LED光源的闪光强度通过计算机控制LED电压、可切换的电阻器以及一组置于LED与视网膜之间的中性密度滤光片共同调节。LED测试闪光的持续时间通常为20毫秒，由计算机控制。这些C57黑六小鼠视杆细胞驱动的跨视网膜记录显示，在弱光强度下为五到六个反应的平均值，而在饱和光强度下为两到三个反应的平均值。

该视锥细胞驱动的视网膜重编码数据来自视杆细胞转导素α亚基敲除小鼠，每条曲线代表在弱光强度下5到10次反应的平均值，以及在饱和光强度下3到5次反应的平均值。因此，在观看本视频后，我们应能充分理解如何从小鼠离体视网膜记录视网膜电图，以获得视杆细胞和视锥细胞驱动的光反应。