隔离LacZ基因表达的小鼠内耳组织用流式细胞仪检测细胞
2011年12月23日
流式细胞术是一种强大的工具，可用于分离和研究特定细胞群。该方案描述了从新生转基因小鼠的耳蜗组织中分离表达 LacZ 的细胞的步骤。在通过流式细胞术分离之前，使用 β-半乳糖苷酶的荧光偶联底物标记解离的耳蜗细胞。
以下实验的总体目标是使用流式细胞术从新生小鼠耳蜗中分离松弛的 Z 阳性细胞。这是通过首先在相对较短的时间内分离大量小鼠耳蜗来实现的，以保持细胞活力并拥有足够的起始组织。第二步，解离 LAX Z 阳性细胞，然后标记以准备组织进行分选。
然后通过流式细胞术对细胞进行分类。然后，可以将得到的 LAX Z 高种群和松弛低种群用于进一步的实验。这种方法可以帮助回答耳研究领域的关键问题，例如内耳内的基因图谱或特定细胞群是什么。
演示该程序的将是来自我们实验室的 Taha Gen A 医学生。首先，用 HBSS 填充 35 毫米培养皿并将它们放在冰块上。然后在使用虹膜剪刀将 12 至 15 只斩首后，对产后、0 至 3 天大的轴突、2 只松弛报告小鼠和野生型小鼠实施安乐死。
将头部放在冰块上的 60 毫米培养皿上。接下来，使用五号杜蒙镊子和虹膜剪刀从头部切除下颌骨和舌头，然后在调色板的水平上切开颅底。现在去除小牛的覆盖皮肤，通过将剪刀插入大孔下部到上颚中间来横切颅底。
用剪刀从上颚的切割边缘到两侧的上部再切开一个切口。小心不要损坏耳囊。然后通过做 2 个 45 度倾斜的切口来完成颞骨的隔离，从框架和大酒瓶的上部开始，延伸到硬腭的冠状切口。
然后将分离的颞骨放入冰块上含有 HBSS 的 35 毫米培养皿中，并将冰块转移到无菌解剖罩中。接下来，这次用 PBS 填充另一个 35 毫米的培养皿，并将其放在冰块上。使用两个 55 号镊子。
通过轻轻地从耳囊上方的颞骨中取出皮层、脑干和小脑来开始显微解剖。然后在不取出耳囊的情况下，从前庭耳蜗神经的入口开始，继续进入耳囊，切掉部分人工耳蜗囊。暴露耳蜗基部后，轻轻拉出皮质器官和周围组织。
然后从底部开始，去除任何剩余的螺旋神经节和纹状体，并将耳蜗转移到装有 PBS 第一移液管的培养皿中。将 50 微升无菌 PBS 放入未包被的六孔培养皿的一到两个孔的中心。然后将不超过 20 个轴蛋白、两个松弛的耳蜗转移到每个 PBS 液滴中。
接下来，将50 微升等分试样的 0.125% 胰蛋白酶在 37 摄氏度的水浴中预热约两分钟。然后将胰蛋白酶添加到耳蜗中。注意不要摇晃盘子。
将耳蜗在 37 摄氏度下孵育 8 分钟。通过向每个液滴中加入 50 μL 大豆 tripsin 抑制剂来终止胰蛋白酶化，然后在将 P 200 移液器人设置为 125 μL 后再添加 50 μL 全培养基。使用 300 微升钝移液器吸头轻轻地将细胞切入 80 次，小心不要产生气泡。
然后，在每个液滴研磨后，向每个液滴中额外添加 200 微升的全培养基。现在将细胞通过 40 微米的细胞过滤器进入新孔。在同一个 6 孔板内，然后将细胞从每个孔转移到单独的标准传真管中。
接下来，将 100 微升野生型细胞加入三个试管中，然后用 300 微升全培养基稀释，仅用于 CUG。在 390 微升全培养基中控制稀释 10 微升轴突、两个 LAX Z 细胞。将剩余的轴突两个松散的 Z 细胞转移到 400 微升 OT 中的传真管中。
然后，将试管在 37 摄氏度加湿培养箱中孵育 10 分钟后，向每个适当的传真管中加入 200 微升稀释的 CUG。接下来，保护所有试管避光，将细胞在 37 摄氏度加湿培养箱中孵育 25 分钟。为了在细胞孵育时进行染色，将 10 毫升新鲜制备的堆和 FBS 放入 15 毫升试管中，然后将试管置于冰上。
然后在无菌罩下向每个传真管中加入 1.8 毫升冰冷的堆溶液，关灯以尽量减少光照。接下来，在室温下以 1200 RPM 离心细胞 5 分钟。然后去除上清液，将沉淀重悬于 300 μL 全培养基中。
汇集分选样品的所有等分试样，然后将碘化丙啶添加到每个合适的试管中，最终浓度为 1 微克/毫升。最后，覆盖细胞后，再次将它们放在冰上。通过首先收集 1000 个未染色野生型细胞的事件来确定前向与侧面散点图上的细胞分布，从而设置分选门。
根据需要调整前向和侧向散射参数。然后用未染色的野生型 PI 染色的野生型 和 CUG 染色的轴突进行补偿。两个 LAX Z 细胞。
用 500 微升的满介质填充两个传真管。然后用野生型 PI 染色和轴突两个 Lae CUG 染色细胞门开始分析，以根据前向与侧向散点图排除碎片。使用前向散射高度与前向散射区域图排除双合体和团块。
然后根据前向散射面积与 PE sci 五面积图排除 PI 阳性死细胞。对于每个步态放置，设置前向散射区域与级联或太平洋蓝色区域的图。使用野生型细胞的绘图，使用野生型细胞设置的所有门，分析来自含有轴突、两个松散 PI 和 CUG 染色细胞的分选样品管中的 10， 000 个事件。
为级联蓝色高像元创建门，这些像元小于事件总数的 1%。级联 Blue High Gates 现在应包含 Axon two 松弛样品中约 15% 至 20% 的细胞。现在，使用上述门控策略，使用 Axon two laxy 细胞分析图使这些轴突两个高细胞为最少的流感、15% 至 20% 的细胞创建一个门。
将细胞分选到包含完整培养基的传真管中，在分选过程中将收集管保持在冷却至 4 摄氏度的腔室中。在这两个图中记录流式细胞仪为每个群体计数的细胞数。左侧为解离野生型的侧向散射区域与前向散射区域，右侧为轴突两个 LA Z。
显示耳蜗细胞。请注意，与那些更靠近 Y 轴的事件相比，这些事件组的门控规模要大得多，这些事件被指定为碎片负种群。通常，从这两个面板中的野生型和轴蛋白 2 LAX Z 耳蜗中回收 40% 至 45% 的无碎片细胞。
前向散射高度与前向散射区域用于从先前门控的碎片中排除双峰。偏离图的预期线性性质的负总体事件被排除在外。此准备通常在指定门内生成 71.1%事件。这里。
PE SCI 5 通道检测到的碘化丙啶用于排除在这些散点图中观察到的死细胞。大约 95% 的分选细胞是活的，并且在这些面板中不占用 PI PI。Cascade 蓝色通道用于检测荧光底物 CUG，如右图所示。
平均而言，排名前约 20% CUG 的阳性细胞是 lae 高细胞，与大约 15， 000 个轴突相关，每 10 到 12 只动物有两个高细胞。观看此视频后，您应该对如何使用流式细胞术从内耳组织中制备和分离松弛的高细胞有很好的了解，用于细胞图灵实验和基因分析等实验。
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概述
本协议概述了使用流式细胞术从新生儿转基因小鼠耳蜗组织中分离出表达LacZ的细胞。该方法包括分离耳蜗细胞并用荧光基底标记它们以实现有效分类。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 细胞生物学
- 转基因小鼠模型
背景
- 流式细胞术是一种分析细胞群体的技术。
- LacZ是转基因研究中常用的报告基因。
- 耳蜗细胞对于理解听觉功能至关重要。
- 分离特定细胞类型可以帮助基因表达研究。
研究目的
- 从新生小鼠耳蜗中分离出LacZ阳性细胞。
- 为耳部研究的进一步实验准备细胞。
- 调查特定细胞群体的基因特征。
使用的方法
- 从新生小鼠中分离耳蜗组织。
- 分离耳蜗细胞以保持活力。
- 用荧光结合基底标记细胞。
- 使用流式细胞术对细胞进行分类。
主要结果
- 成功分离出LacZ高表达和低表达细胞群体。
- 为下游应用准备细胞。
- 对内耳基因表达的潜在洞察。
- 建立了一种研究耳蜗细胞类型的方法。
结论
- 该协议能够有效分离特定的耳蜗细胞。
- 流式细胞术是细胞群体分析的有价值工具。
- 这种方法可以促进听觉生物学研究。
常见问题
Executive Industry Relevance
Isolation of LacZ-expressing cells from neonatal mouse cochlea using flow cytometry enables precise interrogation of rare stem/progenitor cell populations relevant to auditory regeneration. This capability supports early-stage target validation and mechanistic de-risking in hearing loss research, directly impacting discovery inflection points for regenerative medicine portfolios. The method enhances predictive confidence in identifying and characterizing Wnt-responsive cell populations with potential translational value.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables functional isolation of Wnt-responsive stem/progenitor cells for pathway interrogation.
- Supports biological de-risking by distinguishing LacZ-high and LacZ-low populations for downstream analysis.
- Facilitates predictive confidence in target selection for regenerative hearing loss strategies.
Screening & Assay Development
- Prepares validated, viable cell populations for quantitative gene profiling and functional assays.
- Standardizes gating and viability controls to ensure reproducibility across experiments.
- Enables scalable sorting of rare cell types for compound screening or phenotypic assays.
Translational & Preclinical Research
- Aligns isolated cell populations with disease-relevant models for translational biomarker discovery.
- Provides continuity from discovery through preclinical validation of regenerative targets.
- Supports risk-adjusted advancement of candidate cell populations for further in vivo studies.
Pipeline & Workflow Integration
This flow cytometry-based isolation method integrates at the interface of early discovery and preclinical research, enabling hypothesis-driven studies of cochlear stem/progenitor cells.
- Discovery Biology: Supports null hypothesis testing and mechanistic clarification of Wnt pathway involvement in cochlear regeneration.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative cell sorting outputs for downstream functional assays.
- Analytics: Provides robust viability and population gating metrics to compare experimental conditions.
- Translational Research: Bridges in vitro findings to preclinical models by enabling isolation of disease-relevant cell types.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for isolating genetically labeled cell populations across auditory research programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Delivers standardized, scalable, and reproducible cell isolation workflows.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision-making and capital efficiency in regenerative medicine pipelines.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of candidate targets and cell populations for advancement.
Implementation Considerations
- Requires expertise in flow cytometry, cell dissociation, and viability gating.
- Demands access to advanced cytometry instrumentation and analytical software.
- Necessitates rigorous cross-team standardization of gating and viability controls.
- May require adaptation for different reporter systems or tissue sources.
- Limited by the availability of suitable transgenic reporter models and cell yield from neonatal tissues.
