Name: RNAi筛选识别胚后的表型 C。线虫 /em (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-02-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 40 s
Description: 了解利用RNAi基因组筛选和荧光标记蛋白在秀丽隐杆线虫中识别胚后蛋白表达与定位调控因子的方法。该技术通过细菌喂养和荧光显微镜观察，帮助研究人员发现关键基因功能。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

作者谨此感谢新泽西州罗格斯大学沃克斯曼研究所的 Rick Padgett 博士惠赠 dbl-1 cDNA，以及 Christopher Rongo 博士（新泽西州罗格斯大学沃克斯曼研究所）提供的注射标记物。Barth Grant 博士实验室完成了基因枪轰击实验，以实现低拷贝数整合 gfp 标记的 dbl-1 构建体。René Garcia 实验室在构建 texIs100 过程中提供了技术支持。René Garcia、Robyn Lints 和 Hongmin Qin 实验室提供了有益的建议。本研究由德克萨斯农工健康科学中心分子与细胞医学系的启动资金资助。复合显微镜和旋转盘共聚焦显微镜由该系及德克萨斯农工健康科学中心医学院院长办公室提供的资金购置。

1. 筛选菌株的构建
筛选菌株的精心设计对于筛选的成功至关重要，相关方法已在别处描述。3对于某些研究人员而言，实验需要使用表达可见产物的转基因品系。许多携带整合型转基因的品系可从秀丽线虫基因中心（CGC）或个别研究人员处获得。若筛选实验所需的转基因品系尚不可获取，则可通过已发表的方法（如基因枪轰击法）自行构建。4，紫外/三甲基苯醌5或 Mos 转座子插入6为了可视化我们的目标蛋白，我们插入了 gfp-编码序列与成熟的 cDNA 序列保持阅读框一致（我们使用了 dbl-1 序列）。由于该GFP融合蛋白在解剖镜下不可见，我们使用了一种可见的共注射标记物，该标记物不会影响目标蛋白的观察（ttx-3p::rfp，有关其他几种标准标记物的综述，请参见 7）。随后，我们从染色体外阵列构建了一个整合型转基因。我们发现，通过基因枪轰击法将该转基因整合，获得的整合株系拷贝数较低，既不能挽救解剖显微镜下的表型，也无法检测到可见水平的GFP标记产物（Beifuss 和 Gumienny，未发表）。通过UV/TMP方法对最初由显微注射构建的多拷贝染色体外阵列进行整合8,9 产生可见的、具有挽救效应的转基因产物水平（图3A）。使用抗GFP抗体进行Western blot检测，证实了转基因（等位基因名称 texIs100) 的表达和加工是正确的（Beifuss 和 Gumienny，未发表）。无论来源如何，整合的转基因都应进行五次回交以去除额外的背景突变。
在我们的筛选实验中，我们希望唯一关注的蛋白是转基因的带标签形式。因此，我们通过引入一个功能丧失型突变的 dbl-1 等位基因，去除了内源基因的功能。
最后，我们使该品系对RNAi效应更为敏感。若动物携带可增强其对RNAi效应敏感性的突变，则文库中的RNAi对许多基因而言将导致基因产物更显著的降低10,11。在选择合适的RNAi敏感化遗传背景时，应考虑目标组织11。我们采用经典的rrf-3(pk1426)等位基因构建筛选用菌株。RRF-3是一种RNA依赖性RNA聚合酶（RdRP）同源蛋白，通常抑制体细胞中的RNAi10。也可使用其他RNAi超敏感基因（如eri-1或eri-1 lin-15b）的突变，以增强RNAi的效果11-13。
我们构建的筛选菌株基因型为 rrf-3(pk1426); texIs100; dbl-1(nk3)。
2. 选择和准备RNAi文库
市售的 C. elegans cDNA 文库分别代表了 C. elegans 中约 55% 或 87% 的预测基因（分别为 Vidal 实验室和 Ahringer 实验室的文库）。单个克隆可购买（Open Biosystems，Geneservice, Ltd.）。我们选择了由 Vidal 实验室构建的 ORF-RNAi 文库（Open Biosystems），因为其克隆大多为全长 cDNA，并通过 Gateway 克隆技术构建，可直接用于下游应用（Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA）。原始的 Ahringer 实验室基因组 cDNA 文库包含的 cDNA 片段在后续功能鉴定实验中的适用性较窄14,15。两个文库均使用含有两个 T7 启动子、并插入片段位于其间的载体（图 1）。这些构建体在细菌菌株 HT115 中培养，该菌株在异丙基-β-D-硫代半乳糖吡喃糖苷（IPTG）诱导下表达 T7 聚合酶。含有文库克隆的细菌经 IPTG 诱导后可产生 dsRNA（见步骤 3.4）。
收到文库后立即制作完整副本，并使用该副本来进行所有实验。原始文库和复制文库应分别储存于连接在不同电路线路上的-80°C冰箱中。
3. 含文库克隆菌株的制备
<ol>
 <li>（实验前两个月内）从选定的喂食文库克隆以及阳性和阴性对照中挑取细菌，在标记好的LB-羧苄青霉素/四环素平板上划线接种（每个100 mm平板培养8个菌落），于37°C过夜培养（>16小时）（图1）。每块24孔板使用两个对照：阳性对照为bli-4（K04F10.4），可产生剂量依赖性的胚胎后表型16,17；阴性对照C06C3.5是WormBase.org预测的一个假基因（<a href="http://WormBase.org">WormBase.org</a>），未观察到任何表型（Beifuss和Gumienny，未发表数据）。</li>
 <li>（实验前两个月内，最好更早）制备含有25–50 μg/ml羧苄青霉素和1 mM IPTG的24孔线虫生长培养基（NGM）平板，4°C保存。</li>
 <li>（第1天）针对每个克隆，使用无菌操作技术，从第3.1步划线培养的平板上挑取单菌落，接种至2 ml含有50 μg/ml羧苄青霉素的LB液体培养基中。在37°C、220–240 rpm振荡条件下过夜培养（>16小时）（图1）。培养16小时后，溶液应呈现浑浊状态。</li>
 <li>（第2天）次日早晨，向各培养物中加入IPTG，使其终浓度达到1 mM，以诱导双链RNA（dsRNA）的产生。继续在37°C、220–240 rpm条件下培养4–5小时。此步骤可实现比仅依赖NGM平板琼脂中IPTG更一致且更强效的RNA干扰介导的基因产物敲低效果（见第3.5步）。</li>
 <li>将每种诱导后的细菌培养物各30 μl点种至24孔NGM RNAi平板的不同孔中，该平板含有25–50 μg/ml羧苄青霉素和1 mM IPTG（图1，RNAi实验追踪所用模板见图4）。将平板敞口置于无菌超净工作台中约20分钟，或直至菌液斑干燥。注意不可过度干燥，否则琼脂边缘会脱离平板，若线虫爬入由此形成的缝隙中将无法回收。</li>
</ol>
4. 线虫的制备
从经过发育阶段同步的线虫群体开始实验。对动物进行发育阶段同步可降低因动物发育阶段不同而导致对照组与实验组RNAi结果差异的可能性（然而，若RNAi引起发育延迟，观察者应予以记录（图2））。此外，使用L1期幼虫起始RNAi实验，可避免因靶基因在胚胎期致死效应而对研究其在胚胎后发育中的潜在功能造成干扰。
通过首先漂白筛选品系的混合发育阶段群体来实现分期，该过程中仅有卵壳保护的胚胎能够存活。在20°C下，动物的发育阶段可同步至约12小时内；在16°C下，可同步至约18小时内18。为了更精确地进行分期，可通过将胚胎置于无食物的M9培养基中孵化，使动物停滞在第一幼虫阶段（L1）。饥饿状态的L1动物在放置到食物上后，将从相同的起始年龄恢复生长19。
<ol>
 <li>（第1天）使用三个含有抱卵成虫和胚胎的健康筛选品系动物的100 mm培养皿。用无菌M9缓冲液冲洗培养皿中的动物，轻轻吹打液体使其在皿表面流动，以松动动物和胚胎。将冲洗液转移至一个无菌的15 ml带螺口盖离心管中。 </li>
 <li> 如果洗涤液体积大于 3.5 ml，离心样品（约 3000 rpm，30 秒），并吸除液体至 3.5 ml；如果洗涤液体积小于 3.5 ml，加入 H20 或 M9 加入试管中，使总体积达到 3.5 ml。 </li>
 <li>处理化学品时需穿戴适当的防护装备（实验服、手套和护目镜）。将0.5 ml 5 N NaOH与1 ml新鲜次氯酸钠溶液（5% sodium hypochlorite，使用期限少于1年）混合，加入3.5 ml线虫洗涤液中。启动正向计时器。该过程不应超过10分钟；若超过，胚胎将受到损害，得率可能降低，或提示次氯酸钠溶液已失效，应予以更换。 </li>
 <li>涡旋混匀试管约10秒。每2分钟重复涡旋一次，持续4至10分钟。每次涡旋后，在解剖显微镜下观察溶液中的动物尸体。 </li>
 <li>当胚胎释放且成虫破碎后（6–8 分钟），将试管在台式离心机中离心（约 3000 rpm，30 秒），使胚胎沉淀。 </li>
 <li>尽可能吸除上清液，勿扰动沉淀。操作需谨慎，切忌贪多。 </li>
 <li>加入无菌M9培养基至约10 ml，涡旋振荡片刻或充分振荡以重悬沉淀。 </li>
 <li> 离心并再次移除上清液。若试管中仍能闻到漂白剂气味，根据需要重复洗涤步骤。 </li>
 <li>将胚胎重悬于 10 – 15 ml 无菌 M9 溶液中，转移至一个小的（25 ml）锥形瓶（用于通气）。根据菌株和实验要求，在适宜温度下振荡培养（15 – 25°C）过夜（&gt; 16 小时 20°C在此期间，所有动物将孵化并停滞在L1休眠期。 </li>
 <li>（第2天）将L1期动物置于15 ml离心管中离心并重悬于0.5–1 ml M9溶液中（约3000 rpm，30秒）。放置 5 μL 在另一块平板上加入溶液，并统计动物数量。如有需要，调整体积，以获得每3–30条线虫/ 10 μL 溶液 </li>
 <li>在已准备好的24孔板的每个孔中的细菌上，点样约30只次氯酸盐同步化的L1期动物。每孔动物数量超过30只可能导致种群在达到成熟前因食物不足而饥饿。将平板盖子倾斜放置，使其自然晾干。盖上盖子，并用橡皮筋固定。将平板倒置，并置于适当温度下，孵育至目标发育阶段所需的时间。因为 rrf-3(pk1426) 是一种温度敏感等位基因，我们的筛选菌株动物在15 – 17°C 持续三到四天，以观察从L4期至成虫期的动物（图1）。 </li>
</ol>
5. 线虫的观察
（第5天）当线虫生长至所需阶段后（图2A），使用解剖显微镜检查阳性与阴性对照组是否呈现出预期的表型。我们采用bli-4作为RNAi效率的对照，因其可产生剂量依赖性的胚胎后发育缺陷，表型范围从出现水疱的成虫（轻微RNAi表型，未展示）到发育停滞的微小幼虫（强烈且预期的RNAi表型）（图2B）。随后，使用解剖显微镜观察每个实验孔中的个体，并记录由RNAi诱导出的明显异常表型（图2C）。在确认对照组结果并记录宏观表型后，对RNAi实验组进行目标表型的筛选。我们使用配备荧光装置和63倍物镜的复式显微镜，从对照组开始，对每组RNAi实验至少观察五个个体（图3）。
<ol>
 <li>通过制备4%琼脂垫（4%琼脂溶于H2O中）来准备载玻片（标准尺寸为75 × 25 mm）。为确保琼脂垫厚度均匀，将一块洁净的载玻片置于两个垫片之间（每个垫片由一个显微镜载玻片加两层实验室胶带构成）。用移液器吸取约100 μL熔融的4%琼脂（相当于玻璃巴斯德移液管滴加2至3滴），滴加到洁净载玻片中央。迅速但轻柔地将另一块载玻片盖在垫片和熔融琼脂之上，形成琼脂垫。轻轻滑动两块载玻片使其分离，使琼脂垫附着于其中一块载玻片上。</li>
 <li>在琼脂垫上滴加约5 μL麻醉剂（例如左旋咪唑或叠氮化钠）。将8–12个生物样本置于麻醉剂中，盖上22 × 22 mm、厚度为#1.5的盖玻片（或根据复式显微镜选择最合适的盖玻片厚度），使用复式显微镜观察样本。</li>
 <li>记录每次RNAi实验所检测的基因、观察的生物数量及表型结果。对于筛选实验，应制作并使用标准模板（参见示例，图5）。</li>
 <li>若可能，应通过另一个次要表型以及重复实验来验证RNAi诱导的表型。（例如，所示示例筛选使用GFP标记的DBL-1定位改变作为主要筛选指标，以体长作为次要筛选指标20。）细菌可在4°C保存的同一划线平板上使用长达两个月。较老的划线平板可能导致液体过夜培养物生长不良，应先重新划线培养。</li>
 <li>至少对cDNA插入片段的一端进行测序，以确认插入片段与文库标签一致（Ahringer文库已进行过可靠性分析；详见<a href="http://biocompute.bmi.ac.cn/CelRNAi/">http://biocompute.bmi.ac.cn/CelRNAi/</a>）21。推荐使用的引物（适用于任一文库的插入片段）结合于L4440衍生载体上的位点，并位于插入位点两侧：5'-AGCGAGTCAGTGAGCGAG-3' 和 5'-GTAAAACGACGGCCAGT-3'（M13f20引物）。</li>
</ol>
采用该方法，一个人每周可合理地完成并观察两到四组实验。例如，周一和周二处理的动物可在周四和周五分别进行观察，并可在周五和周六再次处理，以便于下周一和周二进行观察。根据每天筛选的表型不同，每组实验可能包含一个24孔板（用于复式显微镜观察），若表型易于快速识别，则可包含更多孔板。因此，在考虑阳性与阴性对照以及筛选速率的情况下，每周至少可观察88种不同的RNAi实验。若采用解剖显微镜进行筛选，则速度可更快，无需将动物固定在载玻片上观察。多人协作亦可通过错开工作时间和/或使用多台显微镜来提高实验室的通量。另一种替代方法是将动物培养在薄层琼脂上，随后直接切取含有动物的琼脂片并转移至载玻片上进行观察，此方法可节省时间。该变体方法已成功用于在400倍放大倍数下筛选雄性尾部异常22。
6. 代表性结果
GFP标记的DBL-1正常与异常定位的示例见图3。GFP标记的DBL-1正常表达包括腹神经索的细胞体以及一排点状结构（图3A）。当线虫摄取可阻止dbl-1 mRNA翻译的RNA后，DBL-1信号显著减弱（图3B）。dbl-1(RNAi) 还会导致动物体型变小，这是本示例中的次级筛选表型（数据未显示）。利用专为此筛选设计的品系，可通过RNAi快速鉴定影响DBL-1定位的基因（图3C）。
<img src="/files/ftp_upload/3442/3442fig1.jpg" alt="大肠杆菌筛选流程图；菌落接种，秀丽隐杆线虫相互作用，IPTG诱导。" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图1"> 
图1. 筛选鉴定DBL-1信号通路细胞外调控因子的实验方案。将取自喂食文库的细菌在液体培养基中过夜培养，随后用IPTG诱导，并在37°C下继续孵育4小时，以使细菌产生双链RNA（dsRNA）。将30 μl诱导后的细菌培养物点样至每孔，接种于含有25 μg/ml羧苄青霉素和1 mM IPTG的24孔NGM（线虫生长培养基）平板上，并在无菌通风橱中晾干。我们通过将经次氯酸盐处理的胚胎置于无食物的培养基中孵化，获得同步化的第一龄幼虫（L1）阶段，此过程可诱导L1期滞育（发育停滞）。将约30只同步化的L1期线虫接种至含有RNAi文库细菌的各孔中，使处于特定发育阶段的线虫恢复生长并摄取细菌所产生的dsRNA23。在15°C下培养72小时后，对年轻成虫期的线虫进行可见表型筛选。在此发育阶段，体型异常表型清晰可辨，且由texIs100转基因表达产生的荧光信号较强。
<img src="/files/ftp_upload/3442/3442fig2.jpg" alt="秀丽隐杆线虫RNAi实验结果；显微镜图像显示正常、bli-4、dpy-13基因效应。" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图2"> 
图2. 筛选前用于识别表型的示例所有动物在培养板孔中的图像均使用解剖显微镜在相同放大倍数下拍摄。所有动物均在接种后约72小时以饥饿状态的L1幼虫形式成像。所有图像均经过相同方式处理。A）对一个不引起明显形态缺陷的基因进行RNA干扰。动物表型呈野生型。B）对 bli-4动物发育停滞，体型远小于A图中的动物。C) RNAi干扰 dpy-13动物与A图中的动物处于相同的发育阶段，但表现出“粗短型”体形。 
<img src="/files/ftp_upload/3442/3442fig3.jpg" alt="荧光显微镜结果；组织切片中蛋白质的定位；箭头指示蛋白质。" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图3"> 
图3. 荧光标记蛋白的示例，以及特定基因的RNA干扰如何改变其定位模式。所有图像均使用旋转盘共聚焦显微镜在630倍放大下拍摄，曝光时间为5秒。比例尺 = 10 μm。所有图像均经过相同处理。空心箭头指示细胞体。箭头标记成簇点状结构的连线。实心箭头指示部分异常定位的GFP标记DBL-1蛋白。A) 饲喂RNA干扰对照假基因C06C3.5（“野生型”）。B) dbl-1(RNAi) 对照。C) 干扰一个对GFP标记DBL-1正常定位必需的基因。
<img src="/files/ftp_upload/3442/3442fig4.jpg" alt="用于记录数据的空白6×4网格图表；行标记为A-D，列编号为1-6。" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图4"> 
图4. 在24孔板中追踪RNAi实验（文库克隆）的模板示例。该模板可用于创建实验的永久记录，相较于直接标记培养板更为可靠。
<img src="/files/ftp_upload/3442/3442fig5.jpg" alt="秀丽隐杆线虫RNAi筛选；表型、组织、细胞效应及观察记录用表。" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 5"> 
图5. RNAi表型记录模板示例。可根据需要扩展。

<ol><li>Giacomotto, J., Segalat, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+screening+and+small+animal+models%2C+where+are+we%5BTitle%5D)+AND+%22Br.+J.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">High-throughput screening and small animal models, where are we.</a> Br. J. Pharmacol. 160, 204-216 (2010).</li>
<li>Lamitina, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+genomic+approaches+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Functional genomic approaches in C. elegans.</a> Methods in Molecular Biology. 351, 127-138 (2006).</li>
<li>Boutros, M., Ahringer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+art+and+design+of+genetic+screens%3A+RNA+interference%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Genet%22%5BJournal%5D)">The art and design of genetic screens: RNA interference.</a> Nat. Rev. Genet. 9, 554-566 (2008).</li>
<li>Praitis, V., Casey, E., Collar, D., Austin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Creation+of+low-copy+integrated+transgenic+lines+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Creation of low-copy integrated transgenic lines in Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 157, 1217-1226 (2001).</li>
<li>Yandell, M. D., Edgar, L. G., Wood, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trimethylpsoralen+induces+small+deletion+mutations+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Trimethylpsoralen induces small deletion mutations in Caenorhabditis elegans.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91, 1381-1385 (1994).</li>
<li>Frokjaer-Jensen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-copy+insertion+of+transgenes+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Single-copy insertion of transgenes in Caenorhabditis elegans.</a> Nature Genetics. 40, 1375-1383 (2008).</li>
<li>Giordano-Santini, R., Dupuy, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selectable+genetic+markers+for+nematode+transgenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.+Mol.+Life.+Sci%22%5BJournal%5D)">Selectable genetic markers for nematode transgenesis.</a> Cell. Mol. Life. Sci. , (2011).</li>
<li>Berkowitz, L. A., Knight, A. L., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+Stable+Transgenic+C.+elegans+Using+Microinjection%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Generation of Stable Transgenic C. elegans Using Microinjection.</a> J. Vis. Exp. (18), e833(2008).</li>
<li>Mello, C., Fire, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+transformation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">DNA transformation.</a> Methods in Cell Biology. 48, 451-482 (1995).</li>
<li>Simmer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+the+putative+RNA-directed+RNA+polymerase+RRF-3+makes+C.+elegans+hypersensitive+to+RNAi%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Loss of the putative RNA-directed RNA polymerase RRF-3 makes C. elegans hypersensitive to RNAi.</a> Curr. Biol. 12, 1317-1319 (2002).</li>
<li>Zhuang, J. J., Hunter, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-specificity+of+Caenorhabditis+elegans+enhanced+RNAi+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Tissue-specificity of Caenorhabditis elegans enhanced RNAi mutants.</a> Genetics. , (2011).</li>
<li>Samuelson, A. V., Klimczak, R. R., Thompson, D. B., Carr, C. E., Ruvkun, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+Caenorhabditis+elegans+genes+regulating+longevity+using+enhanced+RNAi-sensitive+strains%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Symposia+on+Quantitative+Biology%22%5BJournal%5D)">Identification of Caenorhabditis elegans genes regulating longevity using enhanced RNAi-sensitive strains.</a> Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology. 72, 489-497 (2007).</li>
<li>Wang, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Somatic+misexpression+of+germline+P+granules+and+enhanced+RNA+interference+in+retinoblastoma+pathway+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Somatic misexpression of germline P granules and enhanced RNA interference in retinoblastoma pathway mutants.</a> Nature. 436, 593-597 (2005).</li>
<li>Fraser, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+genomic+analysis+of+C.+elegans+chromosome+I+by+systematic+RNA+interference%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Functional genomic analysis of C. elegans chromosome I by systematic RNA interference.</a> Nature. 408, 325-330 (2000).</li>
<li>Kamath, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+functional+analysis+of+the+Caenorhabditis+elegans+genome+using+RNAi%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Systematic functional analysis of the Caenorhabditis elegans genome using RNAi.</a> Nature. 421, 231-237 (2003).</li>
<li>Peters, K., McDowall, J., Rose, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+in+the+bli-4+%28I%29+locus+of+Caenorhabditis+elegans+disrupt+both+adult+cuticle+and+early+larval+development%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Mutations in the bli-4 (I) locus of Caenorhabditis elegans disrupt both adult cuticle and early larval development.</a> Genetics. , 129-195 (1991).</li>
<li>Thacker, C., Peters, K., Srayko, M., Rose, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+bli-4+locus+of+Caenorhabditis+elegans+encodes+structurally+distinct+kex2%2Fsubtilisin-like+endoproteases+essential+for+early+development+and+adult+morphology%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">The bli-4 locus of Caenorhabditis elegans encodes structurally distinct kex2/subtilisin-like endoproteases essential for early development and adult morphology.</a> Genes & Development. 9, 956-971 (1995).</li>
<li>Byerly, L., Cassada, R. C., Russell, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+life+cycle+of+the+nematode+Caenorhabditis+elegans.+I.+Wild-type+growth+and+reproduction%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">The life cycle of the nematode Caenorhabditis elegans. I. Wild-type growth and reproduction.</a> Dev. Biol. 51, 23-33 (1976).</li>
<li>Stiernagle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maintenance+of+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22WormBook%22%5BJournal%5D)">Maintenance of C. elegans.</a> WormBook. , 1-11 (2006).</li>
<li>Savage-Dunn, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+screen+for+small+body+size+mutants+in+C.+elegans+reveals+many+TGFbeta+pathway+components%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">Genetic screen for small body size mutants in C. elegans reveals many TGFbeta pathway components.</a> Genesis. 35, 239-247 (2003).</li>
<li>Qu, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reliability+analysis+of+the+Ahringer+Caenorhabditis+elegans+RNAi+feeding+library%3A+a+guide+for+genome-wide+screens%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Reliability analysis of the Ahringer Caenorhabditis elegans RNAi feeding library: a guide for genome-wide screens.</a> BMC Genomics. 12, 1471-2164 (2011).</li>
<li>Nelson, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Bow-Tie+Genetic+Architecture+for+Morphogenesis+Suggested+by+a+Genome-Wide+RNAi+Screen+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">A Bow-Tie Genetic Architecture for Morphogenesis Suggested by a Genome-Wide RNAi Screen in Caenorhabditis elegans.</a> PLoS Genetics. 7, e1002010(2011).</li>
<li>Timmons, L., Fire, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+interference+by+ingested+dsRNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Specific interference by ingested dsRNA.</a> Nature. 395, 854(1998).</li>
<li>Sarin, S., Prabhu, S., O'Meara, M. M., Pe'er, I., Hobert, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caenorhabditis+elegans+mutant+allele+identification+by+whole-genome+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Caenorhabditis elegans mutant allele identification by whole-genome sequencing.</a> Nature Methods. 5, 865-867 (2008).</li>
<li>Lewis, J. A., Fleming, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basic+culture+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Basic culture methods.</a> Methods in Cell Biology. 48, 3-29 (1995).</li>
<li>Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genetics+of+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">The genetics of Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 77, 71-94 (1974).</li>
</ol>

我们无任何披露事项。

本文介绍的RNAi筛选方法能够灵敏且快速地分析正常（或转基因）胚胎后表型所需的基因产物。示例展示的是针对影响荧光标记蛋白亚细胞定位相关基因的筛选。然而，该方案可经修改用于鉴定影响其他特定胚胎后表型的基因。
该方法利用RNAi文库，基于候选基因策略进行研究。采用诱变技术的正向遗传学筛选能够鉴定随机诱导产生的新等位基因，但鉴定这些等位基因通常需要大量时间、人力和/或资金24。相比之下，使用cDNA文库时，只需对导致特定RNAi表型的cDNA插入片段进行测序，即可快速确认候选基因。此外，适用于克隆的cDNA插入片段有利于对鉴定出的候选基因进行后续分析。同时，对于突变后致死的基因，也可通过RNAi技术实现鉴定与分析。通过将孵化后的动物置于诱导表达的细菌上，该方法可实现对同时具有重要胚胎功能的基因进行幼体后发育缺陷的观察。
务必确认所观察的动物未处于饥饿状态。饥饿会影响动物的表型。若在饥饿动物中鉴定出新的RNAi表型，应重复实验以确认该表型是由RNAi引起，而非由饥饿所致。为防止饥饿，应使用已生长至稳定期的新鲜细菌...

<table><tbody><tr><td>NGM 琼脂</td><td>线虫生长培养基</td><td>IPM Scientific, Inc</td><td>可按照 NGM 琼脂方案制备&lt;sup&gt;25&lt;/sup&gt;</td></tr><tr><td>M9 培养基 </td><td></td><td></td><td>22 mM KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;、&lt;br/&gt;42 mM Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;、&lt;br/&gt;86 mM NaCl、&lt;br/&gt;1 mM MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td></tr><tr><td>琼脂粉</td><td>EMD Millipore</td><td>1.01614.1000</td><td>用于 NGM 平板时为 2% 水溶液；用于显微镜载玻片垫片时为 4% 水溶液（首次需高压灭菌，之后可用微波炉熔化）。</td></tr><tr><td>胰蛋白胨</td><td>BD Biosciences</td><td>211677</td><td>0.25%</td></tr><tr><td>IPTG</td><td>Research Products International Corp.</td><td>I56000-5.0</td><td>终浓度为 1 mM</td></tr><tr><td>羧苄青霉素</td><td>Research Products International Corp.</td><td>C46000-5.0</td><td>工作稀释液浓度为 50 &amp;#x03BC;g/ml</td></tr><tr><td>LB 肉汤（Lennox 配方）</td><td>BD Biosciences</td><td>240230</td><td>20 g/升</td></tr><tr><td>四环素</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>268054</td><td>工作稀释液浓度为 12.5 &amp;#x03BC;g/ml</td></tr><tr><td>次氯酸钠</td><td>任意供应商</td><td>5% 家用漂白剂</td><td>使用新鲜漂白剂。</td></tr><tr><td>氢氧化钠</td><td>任意供应商</td><td>CAS 1310-73-2</td><td>5 N 储存液</td></tr><tr><td>M9 培养基</td><td>Wormlab 食谱手册</td><td>&lt;a href=&quot;http://130.15.90.245/wormlab_recipe_book.htm#Commonlab">http://130.15.90.245/wormlab_recipe_book.htm#Commonlab&lt;/a&gt;</td><td>&lt;sup&gt;26&lt;/sup&gt; </td></tr><tr><td>左旋咪唑</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>31742</td><td>工作稀释液浓度为 100 &amp;#x03BC;M 至 1 mM</td></tr><tr><td>叠氮化钠</td><td>Fisher Scientific</td><td>S227</td><td>在 M9 中的工作稀释液浓度为 10 mM</td></tr><tr><td>24 孔板</td><td>Greiner Bio-One</td><td>662160</td><td>VWR 分销商</td></tr><tr><td>显微镜载玻片</td><td>任意供应商</td><td>75 × 25 × 1 mm</td><td></td></tr><tr><td>显微镜盖玻片</td><td>任意供应商</td><td>22 × 22 mm，No.1.5</td><td>应使用显微镜制造商推荐的厚度。</td></tr><tr><td>复式显微镜</td><td>Carl Zeiss, Inc.</td><td>A1m</td><td>使用符合实验需求的物镜和滤光片。</td></tr><tr><td>培养基泵</td><td>Manostat 可调速蠕动泵</td><td>Kate 型号 #72-620-000</td><td>使用适用于该设备的管路和设置。</td></tr></tbody></table>

rnai 筛选以鉴定秀丽隐杆线虫（c. elegans）的胚后表型

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

C. elegans 已被证明是发现和功能鉴定众多基因及基因通路的宝贵模式系统1。日益完善的工具和资源正在推动该系统中对具有更细微表型或功能的基因的持续发现。
在此，我们介绍了一种经过改进的通用实验方案，用于鉴定 秀丽隐杆线虫 利用RNAi筛选具有特定 postembryonic 表型的基因2该步骤可根据需要轻松修改，以检测特定表型，无论是通过解剖显微镜还是复式显微镜的透射光或荧光光学系统进行观察。该筛选方案充分利用了生物体的物理特性以及现有的分子工具 秀丽隐杆线虫 科研界已取得的成果。例如，我们展示了一种整合型转基因的应用，该转基因表达一种荧光产物，用于RNAi筛选，以鉴定在幼虫晚期及成虫中维持该产物正常定位所必需的基因。首先，我们使用了一种市售的基因组RNAi文库，其含有全长cDNA插入片段。该文库可通过RNAi介导的候选基因产物下调，实现对多个候选基因的快速鉴定。其次，我们构建了一种整合型转基因，使其在对RNAi敏感的遗传背景下表达我们感兴趣的荧光标记蛋白。第三，通过对孵化后的动物进行RNAi处理，该筛选方法能够鉴定出在胚胎期具有重要功能的基因产物，从而避免其胚胎致死效应掩盖该基因在胚胎后发育阶段对目标蛋白的调控作用。最后，该筛选利用配备单细胞分辨率的复合显微镜进行观察。

我们描述了一种增敏方法，利用基于RNAi的基因组筛选和整合的转基因，该转基因表达一种带有荧光标签的功能性蛋白质，以鉴定秀丽隐杆线虫（C. elegans）中调控蛋白质表达和定位的后胚胎期调节因子。

RNAi 筛选以鉴定秀丽隐杆线虫（C. elegans）的胚后表型

秀丽杆线虫已被证明是发现和功能鉴定众多基因及基因通路的宝贵模式系统1。更复杂的……

本实验的目的是利用基于RNAi的基因组筛选和荧光标记蛋白，在秀丽隐杆线虫（C. elegans）中鉴定胚胎后调控蛋白表达与定位的因子。在构建合适的筛选菌株后，选择一个RNAi文库。实验的第一步是将文库中的克隆包装到细菌中。随后对细菌进行筛选，扩增培养，并饲喂给同步发育的秀丽隐杆线虫。在允许线虫生长72小时后，观察其目标表型是否发生改变。最终，通过荧光显微镜观察被攻击蛋白的表达水平或亚细胞定位的变化。该方法可用于鉴定对荧光标记蛋白正确亚细胞定位所必需的基因。然而，本实验方案可进行修改，以鉴定影响其他感兴趣的胚胎后表型的基因。与现有已发表的实验方案相比，该技术的主要优势在于，我们在铺板前先在细菌中诱导双链RNA的产生，从而优化了动物体内RNA干扰反应的一致性和水平。演示该实验步骤的是来自我实验室的研究助理 Kathy Fuss。在开始实验后的两个月内，首先准备克隆文库，将所选饲喂文库克隆以及阳性和阴性对照分别划线接种于含有碳酸盐和四环素的 LB 平板上。阳性对照应使用含有可产生剂量依赖性胚胎后表型基因的克隆，例如 BLE four；阴性对照则使用空载体或含有预测为无表型表现的假基因的克隆。将每个克隆接种到含有50微克/毫升碳酸酸的2毫升LB培养基中，37℃过夜培养。从划线平板上挑取单菌落接种，37℃振荡培养过夜，次日早晨进行后续操作。加入IPTG诱导双链RNA的产生，使菌液变浑浊，然后在相同条件下继续培养额外4至5小时。加入IPTG可确保RNAI诱导的基因产物敲低效果比仅依赖NGM平板中的IPTG和螺杆更为一致和稳定。在IPTG诱导后，将每个克隆的30微升培养物点样到已准备好的24孔NGM RNAi平板的每个孔中，每个孔对应一个克隆。每块平板应设有两个孔用于对照。仔细标记每个文库的位置。将24孔板中的克隆置于无菌超净台中，敞口干燥约20分钟。注意不要让琼脂边缘从培养板上脱离。将同步化的线虫转移至培养皿后，接下来提供线虫制备的说明。在下一节中，从同步化的第一幼虫期（L1期）线虫开始。采用L1期幼虫可避免潜在的胚胎致死表型干扰。拥有一批处于相同发育阶段的动物进行筛选，也能增强研究者对所观察到的变异是由 RNAi 引起的信心，而非仅仅源于不同发育阶段常见的正常变异。然而，如果 RNAi 导致发育延迟，筛选者应通过漂白法注意并记录这一现象。筛选品系应为混合发育阶段的群体。只有卵壳完整的胚胎才能在此步骤中存活，若在20摄氏度下操作，可使动物发育至12小时内；若在16摄氏度下操作，则可使动物发育至18小时内，操作时间应在接种细菌培养物的当天进行。选取三个100毫米的培养皿，内含健康且同时具有重力感应、成虫和胚胎的筛选品系动物。用无菌 M9 培养基清洗所有动物，并将洗涤液转移至带有螺帽的无菌 15 毫升离心管中。如果洗涤液体积大于 3.5 毫升，离心后保留 3.5 毫升液体，弃去多余部分；如果小于 3.5 毫升，则直接保留全部液体。加入水或 M9 液体使体积增至 3.5 毫升，以使胚胎从成虫中游离出来；每管加入 1.5 毫升氢氧化钠与次氯酸钠混合液进行清洗。动物在此溶液中孵育时间不得超过 10 分钟。启动计时器后，对每根试管涡旋震荡 10 秒，之后每隔 2 分钟重复一次涡旋震荡。每次涡旋振荡后，在解剖显微镜下观察溶液中的动物尸体。六到八分钟内，成虫将被破碎，胚胎应被释放出来。通过离心收集胚胎，并尽可能移除上清液，注意不要扰动沉淀。然后，通过加入无菌M9培养基并振荡，将沉淀重悬于10毫升体积中。重复此洗涤步骤至少一次，直至无法检测到漂白剂气味为止。为了更精确地同步动物的发育阶段，可在不含食物的M9培养基中孵化胚胎，使动物停滞在L1阶段。将胚胎转移至含有M9培养基的小锥形瓶中进行此操作。在适合该品系和实验的温度下，将锥形瓶振荡培养过夜。在此期间，线虫将全部孵化，并于次日停滞在L1期休眠阶段。通过将幼虫转移至已准备好的表达双链RNA的细菌中，从设定的时间点恢复其生长。此操作与在24孔板上点加细菌的日期相同。首先将L1期动物转移至一个15毫升离心管中，并进行离心沉淀。然后将动物浓缩至0.5到1毫升M9缓冲液中，并取5微升浓缩的线虫接种到平板上。统计平板上动物的数量，并调整浓缩的线虫溶液，每3至10微升加入30条线虫。最后，将约30微升处于同一发育阶段的动物点样到已制备好的每个孔中的细菌上。每孔超过30只动物可能导致饥饿。待液滴干燥（需几分钟）后，用橡皮筋固定板盖，将培养板倒置于所需温度下孵育相应时间，以便在目标发育阶段对动物进行表型分析。当线虫准备就绪可进行筛选时，需确认阳性对照与阴性对照均表现出预期的表型。随后观察实验组动物是否存在发育异常。接下来，使用解剖显微镜，将每个孔中的 8 到 12 个动物用 5 微升麻醉剂液滴转移到含 4% Agri PET 的载玻片上。盖上适当的盖玻片后，使用复式显微镜观察至少 5 个动物。系统记录基因名称、观察动物数量及表型结果的数据库。对于每个RNAi实验，应尽可能通过另一种次要表型来验证任何由rRNAi产生的表型，并通过重复实验进行验证；重复实验可使用来自同一划线培养的细菌。较陈旧的划线培养可能导致液体过夜培养中细菌生长不良，因此应先重新划线培养。某些细菌培养物可能因质粒中表达的基因产物而生长不佳。在此情况下，只需在涂板前浓缩细菌即可。对于持续进行的筛选，必须始终保持大量胚胎处于可随时分期的状态。筛选所用菌株应始终处于喂养状态，而非饥饿状态，并且须避免可能影响目标表型的污染。我们制定了动物喂养的维护计划。通过RNAi技术，利用为此筛选设计的菌株，鉴定了影响DBL-1定位的基因。GFP标签标记的DBL-1正常表达包括腹神经索的细胞体，以及一排点状结构，这些动物被喂食针对DBL-1的反义RNA。一种mRNA显示出DBL one的表达显著减弱。这些动物的体型也较小，与缺乏功能性DBL L one的动物相似。RNAi筛选成功鉴定出许多其他影响DBL one定位的基因，从而拓展了我们对TGFβ亚细胞运输机制的理解，并为后续更多研究提供了切入点。采用此方法，一个人每周可合理地准备并观察两到四组实验。例如，周一和周二准备的动物可在周四和周五分别进行观察，而周五和周六准备的动物则可在下周一和周二进行观察。在整个筛选过程中，请遵循此操作步骤进行观察。为确保有充足的胚胎用于分期，需定期维护筛选品系。同时，详细记录所有观察结果也非常重要。

rnai-screening-to-identify-postembryonic-phenotypes-in-c-elegans

Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

RNAi筛选识别胚后的表型 C。线虫</em

神经连接蛋白（neurexins）和神经连接素（neuroligins）是膜性神经元黏附蛋白，在突触分化和信号传递中发挥关键作用。C. elegans...

渗透压回避行为中的Caenorhabditis elegans：两个基因的突触功能——人类NRXN1和NLGN1的同源基因作为自闭症候选基因的研究

C. elegans 胚胎是研究细胞生物学和发育过程的有力体系。本文介绍一种利用常见的落射荧光显微镜和开源软件，通过微分干涉差（DIC）光学或荧光技术对 C. elegans...

使用落射荧光显微镜和开源软件对秀丽隐杆线虫（C. elegans）胚胎进行成像

我们描述了一种利用 C. elegans 和RNAi饲喂文库的实验方案，可对群体中单个线虫的荧光强度、体型大小和不透光度等多个参数进行自动化测量。我们以一个筛选参与C.

C. elegans 中的定量自动化高通量全基因组 RNAi 筛选

我们演示了如何利用RNAi饲喂技术在C.

利用RNA介导的干扰喂养策略筛选参与线虫 C. elegans 体尺寸调控的基因

使用 dsRNA 饲喂文库在 C. elegans 中进行大规模基因敲低以产生稳定的基因功能缺失表型

本方案描述了如何在秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis...

可视化神经母细胞胞质分裂过程 秀丽隐杆线虫 胚胎发生

本方案描述了如何研究细胞命运转换过程中的细胞活动 体内秀丽隐杆线虫利用转基因动物，通过热激启动子驱动神经元命运诱导型转录因子 CHE-1 的过表达，并结合RNAi介导的染色质调控因子 LIN-53 的耗竭，可观察到生殖细胞向神经元的重编程过程 体内.<br...

在 C. elegans 中应用 RNAi 与热激诱导的转录因子表达将生殖细胞重编程为神经元

本研究描述了一种半高通量实验方案，可在一次过夜实验中同时对80–100个C.

一种用于分析的半高通量成像方法与数据可视化工具包 秀丽隐杆线虫 胚胎发育

为了研究分子伴侣与分子伴侣之间以及分子伴侣与底物之间的相互作用，我们在秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis...

利用 Caenorhabditis elegans 筛选组织特异性分子伴侣相互作用

本视频演示了通过显微注射将外源DNA导入秀丽隐杆线虫（C.

利用显微注射法构建稳定的转基因秀丽隐杆线虫

了解利用RNAi基因组筛选和荧光标记蛋白在秀丽隐杆线虫中识别胚后蛋白表达与定位调控因子的方法。该技术通过细菌喂养和荧光显微镜观察，帮助研究人员发现关键基因功能。

RNAi 筛选以鉴定秀丽隐杆线虫（C. elegans）的胚后表型

探索更多视频