RNAi筛选识别胚后的表型 C。线虫

本实验的目的是利用基于RNAi的基因组筛选和荧光标记蛋白，在秀丽隐杆线虫（C. elegans）中鉴定胚胎后调控蛋白表达与定位的因子。在构建合适的筛选菌株后，选择一个RNAi文库。实验的第一步是将文库中的克隆包装到细菌中。

随后对细菌进行筛选、扩增培养，并喂食给处于特定发育阶段的秀丽隐杆线虫。在让线虫生长72小时后，观察其目标表型是否发生改变。最终，通过荧光显微镜观察目标蛋白的表达水平或亚细胞定位的变化。

该方法可用于鉴定对荧光标记蛋白正确亚细胞定位所必需的基因。然而，本实验方案可经修改，用于鉴定影响其他感兴趣的胚胎后表型的基因。与现有已发表的实验方案相比，该技术的主要优势在于，我们在将细菌接种到培养板之前，先诱导其产生双链RNA，从而优化了动物体内RNA干扰反应的一致性和强度。

演示该实验步骤的是来自我实验室的研究助理 Kathy Fuss。在开始实验后的两个月内，首先从所选喂养文库克隆以及阳性对照和阴性对照中，在 LB 碳酸盐四环素平板上划线培养细菌。阳性对照应使用含有能产生剂量依赖性胚胎后表型的基因克隆，例如 BLE four；阴性对照则使用空载体或含有预测为无表型的假基因的克隆。

将每个克隆接种到含有50微克/毫升碳酸酸的2毫升LB培养基中，37℃过夜培养。从划线平板上挑取单菌落接种，37℃振荡培养过夜，次日清晨进行后续操作。加入IPTG诱导双链RNA的表达，使菌液变浑浊，继续在相同条件下培养额外4至5小时。

加入IPTG可确保RNAi诱导的基因产物敲低效果比仅依赖NGM平板中的IPTG和大肠杆菌更为一致和显著。在IPTG诱导后，将每个克隆的30微升培养物点种到已准备好的24孔NGM RNAi平板的每个孔中，每个孔接种一个克隆。每块平板应设有两个孔用于对照。

仔细标记每个文库的位置。将24孔板中的克隆置于无菌超净台中，敞口干燥约20分钟。注意不要让琼脂边缘从板上脱离。

将线虫分阶段接种到培养板并干燥后，即可进行线虫制备操作。下一节中，需从处于第一幼虫期（L1期）的线虫群体开始。从L1幼虫开始可避免潜在的胚胎致死表型干扰。

拥有经过分期的动物群体进行筛选，也能提高研究者对所观察到的变异源于RNAi处理而非不同发育阶段正常变异的信心。然而，如果RNAi导致发育延迟，筛选者应通过漂白法注意这一情况。筛选所用菌株为混合发育阶段的群体。

只有卵壳完整的胚胎才能在此步骤中存活，若在20摄氏度下操作，可使动物发育阶段控制在12小时以内；若在16摄氏度下操作，则可使发育阶段控制在18小时以内，该操作应在接种细菌培养物的当天进行。选取三个健康的100毫米培养皿，其中含有筛选品系的动物，并确保这些培养皿中同时存在重力感应正常的成虫和胚胎。

用无菌M9培养基清洗所有动物，并将清洗液转移至含有螺旋盖的无菌15毫升离心管中。如果清洗液体积大于3.5毫升，则离心动物并除去液体，仅保留3.5毫升；如果小于3.5毫升。

加入水或M9培养基，将体积调至3.5毫升，使胚胎从成虫中游离出来；每次清洗加入1.5毫升氢氧化钠与次氯酸钠混合液。动物在此溶液中孵育时间不得超过10分钟。启动计时器后，对每根试管涡旋震荡10秒，之后每2分钟重复一次涡旋震荡。

每次涡旋振荡后，在解剖显微镜下观察溶液中的动物尸体。6至8分钟内，成虫将被破碎，胚胎应被释放出来。通过离心收集胚胎，并尽可能移除上清液，注意不要扰动沉淀。

然后通过加入无菌M9培养基并进行振荡，将沉淀重悬于10毫升体积中。重复此洗涤步骤至少一次，直至漂白剂气味完全不可察觉。为了更精确地同步动物发育阶段，可将胚胎置于无食物的M9培养基中孵化，使其停滞在L1阶段。

将胚胎转移至含有M9培养基的小锥形瓶中进行此操作。在适合该品系和实验的温度下，将锥形瓶振荡培养过夜。在此期间，线虫将全部孵化，并于次日停滞在L1期休眠阶段。

通过将幼虫转移至表达双链RNA的预处理细菌中，从设定的时间点恢复其生长。此操作与在24孔板上点加细菌为同一天。首先将L1期动物转移至15毫升离心管中，并进行离心沉淀。随后将动物浓缩至0.5至1毫升M9培养基中，并取5微升浓缩的线虫接种到平板上。

统计平板上动物的数量，并调整浓缩的线虫溶液，每3至10微升加入30条线虫。最后，将约30微升处于同一发育阶段的动物点样到已制备好的每个孔中的细菌上。

每孔超过30只动物可能导致饥饿。待液滴干燥（需几分钟）后，用橡皮筋固定板盖，将培养板倒置于所需温度下孵育至目标时间，以便在期望的发育阶段对动物进行表型评分。当线虫准备就绪可进行筛选时，需确认阳性与阴性对照组表现出预期的表型。随后观察实验组动物是否存在发育异常。

接下来，使用解剖显微镜，将每个孔中的 8 到 12 个动物用 5 µL 麻醉剂移至含 4% Agri PET 的载玻片上。盖上适当的盖玻片后，使用复式显微镜观察至少 5 个动物。系统记录基因名称、观察动物数量及表型结果的数据库。

对于每个RNAi实验，应尽可能通过另一种次要表型来验证由R RNAi产生的表型，并通过重复实验进行确认；重复实验可使用来自同一划线培养的细菌。较陈旧的划线培养物可能导致液体过夜培养中生长不良，应先重新划线培养。某些细菌培养物可能因质粒中表达的基因产物而生长不佳。

在这种情况下，只需在涂板前浓缩细菌即可。对于持续进行的筛选，重要的是始终保持大量胚胎处于随时可用于分期的状态。筛选所用菌株应始终处于喂养状态，而非饥饿状态，并且必须无任何可能影响目标表型的污染物。

我们制定了动物喂养的维护时间表。通过RNAi技术，利用为此筛选设计的菌株，鉴定了影响DBL-1定位的基因。GFP标签dbl-1的正常表达包括腹神经索的细胞体，以及一排在喂食了针对DBL的反义RNA的动物中出现的点状结构。

一种mRNA显示出DBL one的表达显著减弱。这些动物的体型也较小，与缺乏功能性DBL L one的动物相似。RNAi筛选成功鉴定出许多其他影响DBL one定位的基因，从而拓展了我们对TGFβ亚细胞运输机制的理解，并为后续更多研究提供了切入点。

采用此方法，一个人每周可合理地准备并观察两到四组实验。例如，周一和周二准备的动物可在周四和周五分别进行观察，而动物又可在周五和周六进行准备，用于周一和周二的观察。在整个筛选过程中，请遵循此操作步骤进行观察。

保持充足的胚胎以备分期非常重要，因此需定期维护筛选品系。同时，详细记录所有观察结果也至关重要。