定量和自动化高通量的全基因组RNAi屏幕 C。线虫

此程序的总体目标是以定量方式分析基因功能，并在基因组范围内观察优雅。这是通过首先使用RNA眼法降低每个基因的表达来实现的。在96孔板中。

接下来，进行基因功能的相关测试。在这个例子中，通过分析可诱导的荧光报告基因的表达来评估海洋优雅对真菌感染的正常反应能力。然后使用Coss bio sortt进行自动化定量分析，最终通过分析可量化的性状（如荧光报告基因的表达），显示出调节特定通路、控制发育、行为或生理所需的基因子集。

该方法可以帮助回答不同领域中关于优雅的关键问题，如发育、神经生物学以及宿主病原体相互作用。当Oranger实验室首次发表大规模RNA眼筛查时，我们首先想到了这种方法。开发所需的工具并完善自动化需要付出相当大的努力。

我将与Olivia ti、Jonathan Eubanks实验室的一位科研员和研究助理一起展示该程序。要制作10至12个96孔板，首先准备100毫升的线虫生长介质或NGM，在去离子水中。请参阅书面协议以获取说明。

当介质仍然温暖时，加入每毫升100微克的氨苄青霉素，每毫升12.5微克的四氯环素四毫摩尔的IPTG，并迅速分配75微升到96孔平底板的每个孔中。立即检查并移除孔中存在的任何气泡。将板存放在四摄氏度的湿度室中。

接下来，通过在每个孔中加入1.5毫升含有氨苄青霉素和四氯环素的LB来准备96个深孔板。为每个孔添加唯一的标签或条形码。如果提前准备，请在四摄氏度下存放每个板，并摇动含有RNAI的96孔LB母液板。

使用含有氨苄青霉素、四氯环素和甘油的细菌克隆，并将每个细菌克隆的3微升分配到之前准备好的96个深孔板的相应孔中。用空孔作为对照，用粘附膜覆盖96个深孔板，并在37摄氏度下摇动，过夜孵育。将使用过的96孔复制板在次日清晨置于零下80摄氏度。

将96孔NGM板从四摄氏度转移到无菌层流柜中，让它们升温并在五到15分钟内干燥。然后为每个板添加适当的标签或条形码。从孵育器中取出96孔过夜培养板。

观察成功生长的细菌培养物离心。将96个深孔板在4,000 RPM下离心五分钟。通过将板快速倒置并快速干燥来排出上清液。

将板的边缘放在纸巾上，通过涡旋使残留液体中的细菌沉淀重新悬浮。理想情况下，使用专门的摇晃器，以便每个板都能得到完全相同的处理。使用八通道或十二通道多重移液器，将五微升的悬浮细菌转移到96孔NGM板上。

避免接触NGM。让细菌在无菌层流柜中干燥约两小时。定期检查以避免NGM变得过于干燥。在湿度室中以37摄氏度过夜孵育96孔R-N-A-I-N-G-M板。

参考书面协议，在室温下冷却96孔R-N-A-I-N-G-M板后，准备同步化的蠕虫群体。在每个孔中加入约100至200条蠕虫，在两微升的M九中。检查每个孔中是否有蠕虫。

蠕虫应该在游泳。让板在无菌层流柜中干燥最多一小时。定期检查板。

蠕虫应该在爬行而不是游泳。将板置于25摄氏度的湿度室中过夜。在选择了高度感染性的Judge Miria spora批次后。

使用M九缓冲液从九厘米的板上收集孢子。将四微升的孢子分配到每个孔中，并检查每个孔中是否有孢子。蠕虫应该在游泳。

将板置于无菌层流柜中干燥约一小时。定期检查板，直到蠕虫开始爬行。然后将感染的板置于25摄氏度的湿度室中过夜。

在分析之前，通过在荧光显微镜下快速观察蠕虫，检查是否成功发育，是否在阴性对照中有良好的GFP诱导，以及在阳性对照孔中是否有GFP荧光减少。如果诱导良好，使用八通道或十二通道多重移液器，将蠕虫与100微升50毫摩尔的NACL和0.05%的Triton转移到新的标记或条形码的96孔圆底板上。

在分析日之前，将板在零下80摄氏度下冷冻。在分析日，将冷冻板在室温下解冻。一旦板解冻，继续使用COPA bios进行自动化分析。

SORTT机器逐个处理板上的孔，并分析每个蠕虫的参数，例如它们的荧光。将从COPA bios sortt获得的信息转录到Excel文件中，以验证数据质量。然后将包括光密度、轴长和荧光发射在内的原始数据存储在limbs包中，以便进行后续的详细定量分析。

在这个实验中，转基因蠕虫构成性表达了P call 12 ds red报告基因和可诱导的PNLP 29 GFP。报告蠕虫暴露于控制或A-G-F-P-R-N-A眼克隆48小时。左侧的图板是未感染的蠕虫，