Name: 定量和自动化高通量的全基因组RNAi屏幕 C。线虫 /em (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-02-27T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 58 s
Description: 了解利用C. elegans进行全基因组RNAi高通量筛选的定量自动化方法。该技术通过RNA干扰敲低基因表达，结合荧光报告基因检测真菌感染反应，实现表型特征的自动化定量分析。

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感谢 D. Braendle、C. L. Kurz 和 F. Montañana-Sanchis 的贡献。本项目获得了法国国家研究局（ANR）和普罗旺斯-阿尔卑斯-蓝色海岸大区议会（Conseil Regional PACA）的资助，以及法国国家健康与医学研究院（INSERM）和法国国家科学研究中心（CNRS）的机构资金支持。

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<li>Okoli, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+antifungal+compounds+active+against+Candida+albicans+using+an+improved+high-throughput+Caenorhabditis+elegans+assay%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Identification of antifungal compounds active against Candida albicans using an improved high-throughput Caenorhabditis elegans assay.</a> PLoS One. 4, e7025-e7025 (2009).</li>
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<li>Ballestriero, F., Thomas, T., Burke, C., Egan, S., Kjelleberg, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+compounds+with+bioactivity+against+the+nematode+Caenorhabditis+elegans+by+a+screen+based+on+the+functional+genomics+of+the+marine+bacterium+Pseudoalteromonas+tunicata+D2%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Identification of compounds with bioactivity against the nematode Caenorhabditis elegans by a screen based on the functional genomics of the marine bacterium Pseudoalteromonas tunicata D2.</a> Appl. Environ. Microbiol. 76, 5710-5717 (2010).</li>
</ol>

Ewbank 实验室与 Union Biometrica 和 Modul-Bio 合作。

本方案允许在固体培养基上对C. elegans进行大规模RNAi筛选，以荧光报告基因的表达水平作为检测指标。该方法已通过自动化工具优化，便于高通量检测，能够高效、可靠且可重复地快速处理大量样本。此外，已有其他方法被报道，这些方法对自动化液体样本处理的依赖程度较低8。
	该实验方案的一个关键组织环节是通过与公司 ModulBio 合作，将商用 MBioLIMS 软件适配于 RNAi 筛选流程，从而建立了一种可靠的样本追踪方法。在操作的每个阶段，目前均通过 LIMS 系统生成的条形码对微孔板进行识别。由于 LIMS 还记录了每块板上每个孔中克隆的身份信息，因此从孔到候选基因的追溯变得十分简便。此外，LIMS 与公共数据库 WormBase 相关联，可直接获取任意特定基因的分子与功能数据。LIMS 还支持在微孔板、染色体乃至全基因组水平上进行数据分析。对于这些分析，数据的存储方式与先前描述的工具（如 COPAmulti 16）完全兼容。
	该方法中的一个关键实验要点是根据线虫数量调整食物的用量。对于许多实验而言，必须确保线虫在实验结束时不处于饥饿状态，但同时在实验开始时也不应提供过多食物。我们观察到，在携带 pnlp-29::GFP 报告基因的线虫中，食物密度过高会降低荧光诱导水平。这可能反映出当线虫培养在过多细菌中时，感染效率有所下降（BS，未发表结果）。同时，RNAi 细菌的培养条件也至关重要，因为它决定了 dsRNA 是否能够达到最佳表达水平。某些大规模 RNAi 实验方案要求在接种液体培养物之前，先将 RNAi 克隆培养于琼脂平板上8。我们在省略该步骤的情况下仍获得了稳定的基因沉默效果。我们选择过量培养每种菌液，以确保结果的一致性。事实上，本方案所提供的材料足以同时进行 2 至 3 次筛选实验。然而，为了获得最可靠的结果，我们更倾向于使用独立培养的线虫、RNAi 细菌和真菌孢子，进行平行重复实验。
	另一个关键步骤是使用湿度适中的培养基，既不能太潮湿也不能太干燥。如果培养板不够干燥，RNAi细菌无法充分干燥，线虫会在实验过程中游动，这可能导致问题。例如，线虫在液体环境中无法被D. coniospora有效感染（C. Couillault，未发表结果）。相反，在过于干燥的培养板上，培养基的渗透压会升高，这会直接影响线虫的生理状态17，包括诱导某些抗菌肽基因（如nlp 29）的表达18。接种线虫和孢子时所用液体的体积至关重要，需确保能够快速有效地干燥。若向新鲜培养板中加入超过10 μL的液体，孔板可能需要数小时才能干燥，这使得难以采用机器人系统将线虫加入培养板。例如，Biosort每次分配单个线虫时会携带约1 μL的液体。目前我们仍采用手动分配线虫，这种方法也有助于避免线虫在溶液中发生沉降。
	我们此前报道过对Biosort的调整，使一个96孔板可在36分钟内完成分析19。该设备的制造商UBI现已推出Biosort的改进版本，可进一步缩短分析时间。采用“FastReFlex”模式后，样品将直接进入流动池进行分析，从而绕过气泡捕获过滤器。这显著缩短了数据采集时间，整个孔板可在22分钟内完成分析，每天可处理约20块孔板。然而，如果孔板在分析前不进行冷冻，则第一块与最后一块孔板之间将存在8小时的时间间隔。考虑到实验持续时间相对较短（感染过程仅18小时），这会在不同孔板间引入不可接受的变量。冷冻孔板不仅可在分析前解决这一问题，而且在高通量分析中至关重要，因为根据当前方案并结合标准液体处理机器人，两名人员每周可轻松处理多达50块孔板。目前，我们常规每周筛选30块孔板，使得全基因组筛选可在不到两个月内完成一次。
	该实验方案的一个有趣特征是使用固体琼脂培养基，从而能够开展在液体培养条件下无法进行的检测。由于线虫的生理状态会因培养条件不同而有所差异20,21，在固体培养基上进行检测也可作为常规液体培养筛选的补充。对于某些表型（例如运动能力），可直接使用96孔固体培养板进行分析。然而，在本项筛选中，由于Biosort无法从固体培养板中取样，需先将线虫转移至液体环境中再进行冷冻保存。另一方面，COPAS Biosort可实现多参数定量分析，适用于多种不同表型的测量。在任何特定筛选中，很可能并非所有测量参数都是主要的检测指标。尽管如此，这些测量数据仍具有多方面的用途。它们可用于判断实验是否正常运行。例如，可检查每个孔中线虫的数量和大小。只有在预期RNAi克隆会抑制生长或繁殖的情况下，才应出现偏离正常值的结果。若某孔中线虫数量少于20条，或个体体积比对生长无影响的标准对照（例如 gfp(RNAi)）小30%以上（以TOF为指标），则该孔应从后续分析中剔除。对于这些克隆的功能，可通过另一种实验方案进行研究，即在线虫发育已较为成熟后再使其接触RNAi细菌15。此外，不同参数还可用于优化候选基因（命中基因）的筛选，例如仅保留影响绿色荧光而不影响红色荧光的基因。具体采用何种方法筛选命中基因，将取决于筛选的类型及其确切的检测指标。鉴于定量全基因组筛选所产生的数据较为复杂，可能需要与统计学家合作进行分析。
	我们所描述的方案可轻松适用于其他类型的检测。例如，在感染步骤中，D. coniospora 可替换为任何能够在固体培养基上感染的其他病原体。这一点可能具有重要意义，因为我们发现，许多在液体培养中对粘质沙雷氏菌（Serratia marcescens）感染至关重要的毒力因子，在固体培养基上的感染过程中并不发挥作用（E. Pradel，个人交流）。该方案也完全适用于化学化合物的测试22-24，或利用不同的细菌文库筛选具有生物活性的化合物25，因此应在 C. elegans 研究领域中具有广泛的实用性。

<table><tbody><tr><td>细菌琼脂（BactoAgar）</td><td>BD Biosciences</td><td>214010</td><td></td></tr><tr><td>氨苄青霉素（Ampicillin）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9518</td><td></td></tr><tr><td>蛋白胨（BactoPeptone）</td><td>BD Biosciences</td><td>211677</td><td></td></tr><tr><td>氯化钙（CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;）</td><td>任意供应商（Any Supplier）</td><td></td><td></td></tr><tr><td>密封膜（AeraSeal adhesive film）</td><td>Dutscher</td><td>760214</td><td></td></tr><tr><td>异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（Isopropyl &amp;#946;-d-Thiogalactopyranoside, IPTG）</td><td>赛默飞世尔科技公司（Thermo Fisher Scientific, Inc.）</td><td>AB-0481</td><td></td></tr><tr><td>磷酸氢二钾（K&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;）</td><td>任意供应商（Any Supplier）</td><td></td><td></td></tr><tr><td>磷酸二氢钾（KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;）</td><td>任意供应商（Any Supplier）</td><td></td><td></td></tr><tr><td>硫酸镁（MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;）</td><td>任意供应商（Any Supplier）</td><td></td><td></td></tr><tr><td>氯化钠（NaCl）</td><td>任意供应商（Any Supplier）</td><td></td><td></td></tr><tr><td>磷酸氢二钠（Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;）</td><td>任意供应商（Any Supplier）</td><td></td><td></td></tr><tr><td>氢氧化钠（NaOH）</td><td>任意供应商（Any Supplier）</td><td></td><td></td></tr><tr><td>96孔深孔板（96 deep well plate）</td><td>赛默飞世尔科技公司（Thermo Fisher Scientific, Inc.）</td><td>AB-0932</td><td></td></tr><tr><td>96孔平底板（96 well flat plate）</td><td>Falcon BD</td><td>353072</td><td></td></tr><tr><td>96孔圆底板（96 well round plate）</td><td>Falcon BD</td><td>353077</td><td></td></tr><tr><td>四环素（Tetracycline）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8032</td><td></td></tr><tr><td>吐温X-100（Triton X-100）</td><td>任意供应商（Any Supplier）</td><td></td><td></td></tr><tr><td>帝肯机器人（TECAN robot）</td><td>Tecan Group Ltd.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>多通道移液器96（Liquidator96&lt;sup&gt;TM&lt;/sup&gt;）</td><td>Rainin</td><td></td><td></td></tr><tr><td>COPAS Biosort</td><td>Union Biometrica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>实验室信息管理系统（LIMS）</td><td>Modul-Bio</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

c. elegans 中的定量自动化高通量全基因组 rnai 筛选

Quantitative and Automated High-throughput Genome-wide RNAi Screens in C. elegans

RNA干扰是一种用于研究基因功能的强大方法，尤其是在全基因组范围内并结合定量分析时尤为有效。在C. elegans中，通过喂食表达与特定基因对应的dsRNA的细菌，即可简便高效地实现基因功能的敲低1。尽管已构建覆盖大部分C. elegans基因组的RNAi克隆文库2,3，为真正意义上的功能基因组学研究铺平了道路（例如参见4-7），但大多数既有的方法仍较为耗时费力。Moy及其同事开发了半自动化的实验流程，以促进全基因组范围的筛选8。该方法依赖于显微成像与图像分析。
	本文介绍一种基于机器人操作细菌RNAi克隆、采用COPAS Biosort（Union Biometrica（UBI））进行定量分析，并结合集成软件MBioLIMS（Modul-Bio实验室信息管理系统，MBioLIMS）的高通量全基因组筛选替代方案。该技术可提高数据管理和样本追踪的通量。该方法支持在固体培养基平板上开展筛选实验，这对于某些研究尤为重要，例如涉及秀丽隐杆线虫（C. elegans）宿主-病原体相互作用的研究，因为某些微生物在液体培养条件下无法有效感染线虫。
	我们展示了该方法如何用于量化基因在C. elegans抗真菌先天免疫中的重要性。在此情况下，该方法依赖于使用一种转基因品系，该品系携带一个表皮感染可诱导的荧光报告基因，其中绿色荧光蛋白（GFP）受抗菌肽基因nlp 29启动子的调控，同时携带一个在表皮持续表达的红色荧光报告基因。后者可作为表皮功能完整性和非特异性转基因沉默的内部对照9。当对照线虫被真菌感染时，会发出绿色荧光。通过RNAi敲低对nlp 29表达必需的基因后，感染后的荧光强度会减弱。目前，该实验方案每周可测试和分析超过3,000个RNAi克隆，使得在不到两个月的时间内完成全基因组筛选成为可能。

我们描述了一种利用 C. elegans 和RNAi饲喂文库的实验方案，可对群体中单个线虫的荧光强度、体型大小和不透光度等多个参数进行自动化测量。我们以一个筛选参与C. elegans抗真菌先天免疫相关基因的实验为例进行说明。

C. elegans 中的定量自动化高通量全基因组 RNAi 筛选

RNA干扰是一种用于理解基因功能的强大方法，尤其是在全基因组范围内并以定量方式进行时。在C. ...

本实验的总体目标是以定量的方式检测基因功能，并在全基因组范围内观察其效应。该目标通过 RNA 干扰技术在 96 孔板中逐个降低每个基因的表达水平来实现。接下来，进行基因功能的相关检测。在此示例中，通过分析可诱导型荧光报告基因的表达，评估海葵（sea elegance）对真菌感染产生正常反应的能力。随后使用 Coss bio sortt 进行自动化的定量分析。最终，对可量化的性状（如荧光报告基因的表达）进行分析，可揭示调控特定通路、发育、行为或生理过程所必需的基因亚群。该方法有助于回答您在发育、神经生物学以及宿主与病原体相互作用等不同领域中所关注的关键问题。当奥兰治实验室首次发表大规模 RNA 干扰眼筛实验时，我们便萌生了这一方法的构想。开发所需工具并完善自动化流程耗费了大量努力。我将与来自乔纳森·尤班克斯实验室的科研人员奥利维亚·蒂（Olivia Ti）一同演示该实验流程。要制备10至12块96孔板，首先需用去离子水配制100毫升线虫生长培养基（nematode growth medium，NGM）。具体操作步骤请参见书面实验方案。在培养基仍温热时，加入终浓度为 100 微克/毫升的氨苄青霉素、12.5 微克/毫升的四环素以及 4 毫摩尔的 IPTG，并迅速将 75 微升分配至 96 孔平底板的每个孔中。立即检查并去除孔中可能出现的气泡。将该板置于 4 摄氏度的湿润环境中保存。接下来，通过加入含有氨苄青霉素和四环素的1.5毫升LB培养基来准备96深孔板。向每个孔中添加唯一的标签或条形码。若提前制备，请将每块板覆盖后储存在4摄氏度；同时震荡含有RNAI的96孔LB储备板。取含有氨苄青霉素、四环素和甘油的细菌克隆，并将每个细菌克隆各3 µL分配至预先准备好的96深孔板中相应的孔内。使用空孔作为对照，用粘性封口膜覆盖96深孔板，并在37°C下振荡培养过夜。在过夜培养后的次日早晨，将使用过的96孔复制板置于-80°C保存。将96孔NGM平板从4摄氏度转移至无菌超净工作台，静置5至15分钟使其升温并干燥。随后为每块平板贴上相应的标签或条形码。从培养箱中取出96孔深孔过夜培养板。观察成功培养的细菌菌液，将96深孔板在4,000 RPM条件下离心5分钟。将孔板迅速倒置以弃去上清液，并快速干燥。将平板边缘置于纸巾上，通过涡旋振荡使细菌沉淀在残留液体中重悬。理想情况下应使用专用振荡器，以确保每块平板接受完全相同的处理。使用八通道或十二通道多通道移液器，将5 µL重悬的细菌转移至96孔NGM平板上。避免接触 NGM。在无菌超净工作台中让细菌干燥约两小时。定期检查，防止 NGM 变得过干。将 96 孔 R-N-A-I-N-G-M 板置于 37 摄氏度的湿润环境中过夜培养。在将96孔RNAi NGM平板冷却至室温后，请参考书面实验方案以制备同步化的线虫群体。向每个孔中加入约100至200条线虫，悬浮于2微升M9缓冲液中。检查每个孔中是否均有线虫。蠕虫应处于游泳状态。将培养皿在无菌超净台中干燥，最多不超过一小时。定期检查培养皿。蠕虫应呈爬行状态而非游动状态。将培养皿置于25摄氏度的湿润环境中过夜。在选定一批高感染性的Judge Miria孢子后。使用 M9 缓冲液从直径九厘米的培养皿中收集孢子。将 4 µL 孢子分配至每个孔中，并检查每个孔内的孢子情况。线虫应处于游动状态。将培养皿置于无菌超净工作台中晾干，约需一小时。定期检查培养皿，直至观察到线虫开始爬行。随后将已感染的培养皿放入湿润的培养盒中，在25摄氏度下过夜培养。在分析前，通过荧光显微镜快速观察线虫，检查阴性对照孔中线虫是否正常发育且绿色荧光蛋白（GFP）诱导良好，以及阳性对照孔中GFP荧光是否减弱。若诱导效果良好，使用八通道或十二通道多通道移液器，将线虫连同100 µL 50 mM NaCl和0.05%吐温（Triton）转移至新的带标签或条形码的96孔圆底板中。将培养板置于-80摄氏度冷冻，直至分析当天。在室温下解冻冷冻的培养板。待培养板完全解冻后，使用COPA bios进行自动化分析。Sortt 仪器逐孔处理样品板，并分析每条线虫的参数，例如其荧光强度。将从 COPA bios sortt 获得的信息转录至 Excel 文件中，以验证数据质量。随后将原始数据（包括光密度、轴向长度和荧光发射）存储于 limbs 软件包中，用于后续详细的定量分析。在本实验中，转基因蠕虫组成型表达 P call 12 ds red 报告基因和可诱导的 PNLP 29 GFP。报告基因蠕虫分别暴露于对照组或 A-G-F-P-R-N-A eye clone 处理 48 小时。左侧图示为未感染的蠕虫，右侧图示为感染 D spora 后 18 小时的蠕虫。当关注的表型为 A GFP 报告基因的表达时，含有 GFP RNAi 克隆的基因筛选孔可提供可靠的对照。COPA bios SORTT 为每条被分析的线虫生成数值数据。这些图表显示了每孔转基因线虫的平均值及标准差。在RNAi及感染diaspora后，组成型表达p call 12 DS red报告基因和可诱导的PNLP 29 GFP报告基因。分选仪分析飞行时间（TOF），该时间对应于线虫的大小、红色荧光，以及绿色荧光与TOF的比值。某些克隆会引发生长缺陷和/或影响P 12 DS red的表达。某些因素则特异性影响荧光蛋白的表达。例如，该特定克隆靶向的基因 NS Y1，此前已被证明在调控 NLP 29 中具有重要作用。绿色和红色荧光以及 TOF 均以任意但恒定的单位进行测量。本方案的创新之处之一在于使用培养板进行冷冻，以推迟其分析时间。如本文所示，冷冻可使培养板保存长达两周，且不会显著改变实验结果。尽管所测荧光的绝对值可能发生变化，但其相对比值仍保持相似。携带PNLP-29::GFP和Pcall-12::dsRed转基因的L4期线虫分为两组，一组感染diaspora，另一组未感染。18小时后，每块平板大致分为两半，其中一半立即进行分析，另一半在-80°C下冷冻24小时后解冻再行分析。对每个样本计算平均大小、浑浊度以及绿色和红色荧光的分析值。该图显示了此处所示冻存样本和活体样本中，感染样本平均值与非感染样本平均值的比值。通过对一块代表性微孔板进行重复分析，得到每个孔的标准化荧光比值，即每个孔的荧光均值除以该微孔板的修剪均值。一旦掌握该方案，由两到三名研究人员组成的团队可在两到三个月内完成一次全基因组筛选。成功实施本方案需要良好的团队合作。我团队的成员投入了巨大努力，以制定出高效且相对易于操作的方案。

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