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Quantitative and Automated High-throughput Genome-wide RNAi Screens in C. elegans

定量和自动化高通量的全基因组RNAi屏幕 C。线虫

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10:58 min

February 27, 2012

DOI: 10.3791/3448-v

Barbara Squiban¹, Jérôme Belougne¹, Jonathan Ewbank¹, Olivier Zugasti¹

¹Centre d’Immunologie de Marseille-Luminy,Université de la Méditerranée

Please note that some of the translations on this page are AI generated. Click here for the English version.

Summary

我们描述了协议使用

Transcript

该程序的总体目标是以定量方式检测基因功能，并在全基因组范围内看到优雅。这是通过首先通过 RNA 眼睛敲低每个基因的表达来实现的。在 96 孔板中。

接下来，进行基因功能的相关测试。在这个例子中，通过分析诱导型荧光报告基因的表达来评估 sea elegance 对真菌感染的正常反应能力。然后使用 Coss 生物排序进行自动定量分析，最终，对可量化性状的分析，例如荧光报告基因的表达，显示了调节特定途径、控制发育、行为或生理学所需的基因子集。

这种方法可以帮助回答您认为优雅的不同领域的关键问题，例如发育、神经生物学以及宿主病原体的相互作用。当 Oranger 实验室发表第一个大规模 RNA 眼筛选时，我们第一次有了这种方法的想法。开发所需的工具和完善自动化需要付出相当大的努力。

我将与 Jonathan Eubanks 实验室的科学家兼研究助理 Olivia ti 一起演示该程序，以制作 10 到 1296。孔板首先在去离子水中制备 100 毫升线虫生长、培养基或 NGM。有关说明，请参阅书面协议。

当培养基仍然温暖时，每毫升添加 100 μg 氨苄青霉素、每毫升 12.5 μg 四环素、4 毫摩尔 IPTG，并迅速将 75 μL 分配到 96 孔平底板的每个孔中。检查并立即清除孔中存在的任何气泡。将板存放在 4 摄氏度的潮湿室中。

接下来，通过添加 96 毫升含有氨苄青霉素和四环素的 LB 制备 1.5 个深孔板。对于每个孔，添加唯一的标签或条形码。如果提前准备好，则盖上每个板并储存在 4 摄氏度，搅拌含有 RNAI 的 96 孔 LB 储备板。

用氨苄青霉素、四环素和甘油进行细菌克隆，并将每个细菌克隆的 3 微升分配到先前制备的 96 深孔板的相应孔中。使用空孔进行对照，用粘合膜覆盖 96 个深孔板，并在 37 摄氏度下搅拌孵育过夜。在过夜培养后的早晨，将用过的 96 孔复制板置于零下 80 摄氏度。

将 96 孔 NGM 板从 4 摄氏度转移到无菌层流柜中，让它们预热并干燥 5 到 15 分钟。然后为每个板添加适当的标签或条形码。从培养箱中取出 96 个深孔过夜培养板。

观察成功生长的细菌培养物离心。将 96 个深孔板以 4， 000 RPM 的速度放置 5 分钟。将板急剧倒置并快速干燥，以沥干上清液。

纸巾上的板边缘通过涡旋将细菌沉淀重悬在残留液体中。理想情况下，使用专用搅拌器，以便每个板都接受完全相同的处理。使用 8 或 12 通道多移液器将 5 微升 Resus 悬浮细菌转移到 96 孔 NGM 板上。

避免触摸 NGM。让细菌在无菌层流柜下干燥约两个小时。定期检查以避免 NGM 变成两个干孵育，将 96 孔 R-N-A-I-N-G-M 板在 37 摄氏度下在潮湿室中过夜。

在室温下冷却 96 孔 R-N-A-I-N-G-M 板后，请参阅书面方案以制备同步的蠕虫种群。将大约 100 至 200 条蠕虫加入 2 微升 M 9 中。检查每个井是否有蠕虫。

蠕虫应该在游泳。让板在无菌层流柜下干燥最多一小时。定期检查板。

蠕虫应该是爬行而不是游泳。将板放入 25 摄氏度的潮湿室中过夜。在选择了一批具有高度传染性的 Judge Miria 孢子之后。

使用 M nine Buffer 从 9 厘米板中收集孢子。将 4 微升孢子分配到每个孔中，并检查每个孔的孢子。蠕虫应该在游泳。

将板在无菌层流柜下干燥约一小时。定期检查板，直到蠕虫开始爬行。然后将受感染的板放入 25 摄氏度的潮湿室中过夜。

通过在荧光显微镜下快速观察蠕虫，在分析前检查蠕虫，以成功开发在阴性对照上实现良好的 GFP 诱导，并在阳性对照孔上减少 GFP 荧光。如果诱导效果良好，使用 8 或 12 通道多移液器将含有 100 微升 50 毫摩尔 NACL 和 0.05% triton 的蠕虫转移到新的标记或条形码中。96 孔圆底板。

在零下 80 摄氏度下冷冻板，直到分析当天在室温下解冻冷冻板。板解冻后。使用 COPA BIOS 继续进行自动分析。

分拣机器对板进行逐个处理，并分析每个蠕虫的参数，例如它们的荧光。将从 COPA bios 排序获得的信息转录到 Excel 文件中，以验证数据质量。然后将原始数据（包括光密度、轴向长度和荧光发射）存储在 limbs 包中，以便进行后续的详细定量分析。

在本实验中，转基因蠕虫组成型表达 P 调用 12 ds 红色报告基因和诱导型 PNLP 29 GFP。将报告蠕虫暴露于对照或 A-G-F-P-R-N-A 眼克隆 48 小时。左侧的面板是未感染的蠕虫，右侧的面板是感染孢子 D 细胞 18 小时后的蠕虫。

当感兴趣的表型是 A GFP 报告基因的表达时，带有 GFP RNAi 克隆的基因 Wells 提供了稳健的对照。COPA bios SORTT 为分析的每个蠕虫生成数值数据。这些图表显示了转基因蠕虫每个孔的平均值和标准偏差。

在 RNAI 和散居感染后组成性表达 p call 12 DS 红色报告基因和诱导型 PNLP 29 GFP 报告基因。分拣机分析飞行时间或 TOF，它对应于蠕虫的大小、红色荧光以及绿色荧光与 TOF 的比率。某些克隆会引起生长缺陷和/或影响 P 12 DS red 的表达。

其他因素特别影响 FP 表达。例如，这个特定的克隆靶向基因 NS Y，该基因先前显示对 NLP 29 的调节很重要。绿色和红色荧光以及 TOF 以任意但恒定的单位进行测量。

该方案的创新之一是使用冷冻板来推迟他们的分析。冷冻允许板储存长达两周，而不会显著改变结果，如图所示。尽管测得的荧光的绝对值可能会发生变化，但它们的相对比率仍然相似。

L 4 条携带 PNLP 29 GFP 和 P call 12 ds 红色转基因的蠕虫要么感染散居，要么未感染。18 小时后，将每个板大致分成两半，立即分析，另一半在零下 80 摄氏度下冷冻 24 小时，然后解冻。计算每个样品的平均大小不透明度以及绿色和红色荧光的分析值。

该图显示了此处显示的冷冻和活样本的感染平均值除以未感染样本的比率。从代表性板的重复分析中得出每个孔的归一化荧光比率，即孔的荧光平均值除以板的修整平均值。一旦掌握，该方案可以允许一组两到三个人在两到三个月内进行基因组宽筛选。

该协议的成功执行需要大量良好的团队合作。我的小组成员投入了巨大的努力来制定高效且相对容易执行的协议。

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