C. elegans 中的定量自动化高通量全基因组 RNAi 筛选

本实验的总体目标是以定量的方式检测基因功能，并在全基因组范围内观察其效应。该目标通过 RNA 干扰技术在 96 孔板中逐个降低每个基因的表达水平来实现。

接下来，进行基因功能的相关检测。在此示例中，通过分析可诱导型荧光报告基因的表达，评估海葵（sea elegance）对真菌感染产生正常反应的能力。随后使用 Coss bio sortt 进行自动化的定量分析。最终，对可量化的性状（如荧光报告基因的表达）进行分析，可揭示调控特定通路、发育、行为或生理过程所必需的基因亚群。

该方法有助于回答您在发育、神经生物学以及宿主与病原体相互作用等不同领域中所关注的关键问题。当奥兰治实验室首次发表大规模 RNA 干扰眼筛实验时，我们便萌生了这一方法的构想。开发所需工具并完善自动化流程耗费了大量努力。

我将与来自乔纳森·尤班克斯实验室的科研人员奥利维亚·蒂（Olivia Ti）一同演示该实验流程。要制备10至12块96孔板，首先需用去离子水配制100毫升线虫生长培养基（nematode growth medium，NGM）。具体操作步骤请参见书面实验方案。

在培养基仍温热时，加入终浓度为 100 微克/毫升的氨苄青霉素、12.5 微克/毫升的四环素以及 4 毫摩尔的 IPTG，并迅速将 75 微升分配至 96 孔平底板的每个孔中。立即检查并去除孔中可能出现的气泡。将该板置于 4 摄氏度的湿润环境中保存。

接下来，通过加入含有氨苄青霉素和四环素的1.5毫升LB培养基来准备96深孔板。向每个孔中添加唯一的标签或条形码。若提前制备，请将每块板覆盖后储存在4摄氏度；同时震荡含有RNAI的96孔LB储备板。

取含有氨苄青霉素、四环素和甘油的细菌克隆，并将每个细菌克隆各3 µL分配至预先准备好的96深孔板中相应的孔内。使用空孔作为对照，用粘性封口膜覆盖96深孔板，并在37°C下振荡培养过夜。在过夜培养后的次日早晨，将使用过的96孔复制板置于-80°C保存。

将96孔NGM平板从4摄氏度转移至无菌超净工作台，静置5至15分钟使其升温并干燥。随后为每块平板贴上相应的标签或条形码。从培养箱中取出96孔深孔过夜培养板。

观察成功培养的细菌菌液，将96深孔板在4,000 RPM条件下离心5分钟。将孔板迅速倒置以弃去上清液，并快速干燥。

将平板边缘置于纸巾上，通过涡旋振荡使细菌沉淀在残留液体中重悬。理想情况下应使用专用振荡器，以确保每块平板接受完全相同的处理。使用八通道或十二通道多通道移液器，将5 µL重悬的细菌转移至96孔NGM平板上。

避免接触 NGM。在无菌超净工作台中让细菌干燥约两小时。定期检查，防止 NGM 变得过干。将 96 孔 R-N-A-I-N-G-M 板置于 37 摄氏度的湿润环境中过夜培养。

在将96孔RNAi NGM平板冷却至室温后，请参考书面实验方案以制备同步化的线虫群体。向每个孔中加入约100至200条线虫，悬浮于2微升M9缓冲液中。检查每个孔中是否均有线虫。

蠕虫应处于游泳状态。将培养皿在无菌超净台中干燥，最多不超过一小时。定期检查培养皿。

蠕虫应呈爬行状态而非游动状态。将培养皿置于25摄氏度的湿润环境中过夜。在选定一批高感染性的Judge Miria孢子后。

使用 M9 缓冲液从直径九厘米的培养皿中收集孢子。将 4 µL 孢子分配至每个孔中，并检查每个孔内的孢子情况。线虫应处于游动状态。

将培养皿置于无菌超净工作台中晾干，约需一小时。定期检查培养皿，直至观察到线虫开始爬行。随后将已感染的培养皿放入湿润的培养盒中，在25摄氏度下过夜培养。

在分析前，通过荧光显微镜快速观察线虫，检查阴性对照孔中线虫是否正常发育且绿色荧光蛋白（GFP）诱导良好，以及阳性对照孔中GFP荧光是否减弱。若诱导效果良好，使用八通道或十二通道多通道移液器，将线虫连同100 µL 50 mM NaCl和0.05%吐温（Triton）转移至新的带标签或条形码的96孔圆底板中。

将培养板置于-80摄氏度冷冻，直至分析当天。在室温下解冻冷冻的培养板。待培养板完全解冻后，使用COPA bios进行自动化分析。

Sortt 仪器逐孔处理样品板，并分析每条线虫的参数，例如其荧光强度。将从 COPA bios sortt 获得的信息转录至 Excel 文件中，以验证数据质量。随后将原始数据（包括光密度、轴向长度和荧光发射）存储于 limbs 软件包中，用于后续详细的定量分析。

在本实验中，转基因蠕虫组成型表达 P call 12 ds red 报告基因和可诱导的 PNLP 29 GFP。报告基因蠕虫分别暴露于对照组或 A-G-F-P-R-N-A eye clone 处理 48 小时。左侧图示为未感染的蠕虫，右侧图示为感染 D spora 后 18 小时的蠕虫。

当关注的表型为 A GFP 报告基因的表达时，含有 GFP RNAi 克隆的基因筛选孔可提供可靠的对照。COPA bios SORTT 为每条被分析的线虫生成数值数据。这些图表显示了每孔转基因线虫的平均值及标准差。

在RNAi及感染diaspora后，组成型表达p call 12 DS red报告基因和可诱导的PNLP 29 GFP报告基因。分选仪分析飞行时间（TOF），该时间对应于线虫的大小、红色荧光，以及绿色荧光与TOF的比值。某些克隆会引发生长缺陷和/或影响P 12 DS red的表达。

某些因素则特异性影响荧光蛋白的表达。例如，该特定克隆靶向的基因 NS Y1，此前已被证明在调控 NLP 29 中具有重要作用。绿色和红色荧光以及 TOF 均以任意但恒定的单位进行测量。

本方案的创新之处之一在于使用培养板进行冷冻，以推迟其分析时间。如本文所示，冷冻可使培养板保存长达两周，且不会显著改变实验结果。尽管所测荧光的绝对值可能发生变化，但其相对比值仍保持相似。

携带PNLP-29::GFP和Pcall-12::dsRed转基因的L4期线虫分为两组，一组感染diaspora，另一组未感染。18小时后，每块平板大致分为两半，其中一半立即进行分析，另一半在-80°C下冷冻24小时后解冻再行分析。对每个样本计算平均大小、浑浊度以及绿色和红色荧光的分析值。

该图显示了此处所示冻存样本和活体样本中，感染样本平均值与非感染样本平均值的比值。通过对一块代表性微孔板进行重复分析，得到每个孔的标准化荧光比值，即每个孔的荧光均值除以该微孔板的修剪均值。一旦掌握该方案，由两到三名研究人员组成的团队可在两到三个月内完成一次全基因组筛选。

成功实施本方案需要良好的团队合作。我团队的成员投入了巨大努力，以制定出高效且相对易于操作的方案。