神经退行性疾病中的高内涵筛选

以下实验的总体目标是利用高内涵检测技术，在细胞疾病模型中定量分析神经退行性疾病中受影响的信号通路。为实现这一目标，将具有疾病表型的细胞模型接入自动化细胞培养系统，并培养细胞至达到所需细胞数量。随后对细胞进行传代、计数，并接种于96孔板中，孔板内含有表达多种SH RNA的慢病毒。

经过六天的细胞分化后，将细胞从系统中取出进行免疫染色和高内涵成像。最后，利用多种分析算法对图像进行分析，以定量评估与细胞健康、神经元突起生长和线粒体功能相关的特征。

结果还通过诺瓦斯中的双向分析来识别显著的交互作用效应。该方法可加快回答关于疾病相关基因功能及其整体作用通路的关键问题，进而加深对神经退行性疾病中致病机制的理解。

开始细胞培养过程时，需先为自动化细胞培养系统准备细胞培养板的输入。将移液器吸头、细胞培养板和检测板等耗材装入系统中。同时，需手动确保系统内含有足够的细胞培养基、PBS 和胰蛋白酶。

用SH-SY5Y神经母细胞瘤细胞系接种两个万能托盘培养板，每板接种量为2 × 10⁶个细胞。使用含10%胎牛血清（FBS）的最适培养基培养细胞，并将培养板放置于细胞培养机器人中的输入架上。通过图形用户界面（GUI）选择A型贴壁细胞培养程序，并调整针对该贴壁细胞系的特定参数文件，使融合度阈值设定为70%。

将总时间设定为两分钟。指示系统准备新的 Omni Tray 培养板，每板接种细胞数量为 2 × 10⁶ 个细胞。指示系统为每块 Omni Tray 培养板准备检测用培养板，每孔接种总量为 5,000 个细胞，并将细胞在 37°C 和 5% CO₂ 条件下孵育。

本贴壁细胞培养方案包含以下步骤。将培养板孵育并成像，直至细胞达到预设的融合度阈值。若细胞在五次读数内未达到融合度阈值，则将培养板从系统中移除。

当细胞达到用户定义的汇合度阈值后，进行洗涤、胰酶消化并计数。将预定数量的细胞接种至新的多功能培养板中；若细胞数量充足，则将指定数量的检测板转移至仪器平台，并向每孔中分配设定数量的细胞。最后，可使用集成显微镜直接对检测板进行成像，或将其从系统中取出进行后续处理，以启动病毒制备流程。

在含有氨苄青霉素的LB培养基中接种含有HRNA载体的细菌甘油菌种，过夜培养。次日，离心收集菌体并弃去上清，使用Wizard Magnus细胞质粒纯化系统提取质粒。最终含有质粒DNA的洗脱液收集至96孔板中。S-H-R-N-A慢病毒由RNAi联盟提供，采用96孔板进行慢病毒生产。所有实验必须在ML 2级或BSL-2级生物安全实验室中进行，使用过的所有试剂和耗材必须用30%氯溶液去污染处理。

本视频中不会演示慢病毒的制备过程，但该过程需要四天，包括以下步骤：首先，在第零天下午接种包装细胞；第一天，在转染后18小时，用三种慢病毒质粒转染包装细胞。

第二天，更换为新鲜的高BSA或高血清培养基。换液后24小时。第三天，收集病毒，并再次更换为新鲜的高BSA或高血清培养基。

最后，在首次收获病毒后的24小时，即第四天，再次收获病毒，并弃去包装细胞，以计算慢病毒转导的感染复数（MOI）。用病毒进行连续稀释，转导SHSY5Y细胞，在37摄氏度下孵育，转导后72小时，在显微镜下观察GFP表达情况，并确定GFP阳性细胞的百分比。将SHRNA慢病毒以MOI为3的条件接种至检测用培养板中。将SHRNA慢病毒接种至检测板后，将培养板放入自动细胞培养系统中进行慢病毒转导。

24小时后，将检测板中的培养基更换为含有0.5% FBS和0.1微摩尔视黄酸的最适培养基。为启动分化过程，继续在分化培养基中孵育检测板5天，以确保在第5天时目标基因表达达到最大程度的敲低。在第6天，向一半检测板中加入H2O，处理24小时以诱导DJ-1蛋白向线粒体的转位。随后以每孔200纳摩尔的终浓度向细胞中加入MIT tracker，在37°C下孵育30分钟。

此后，可将培养板转移至高内涵（HC）成像仪进行成像。或者，也可将培养板从系统中导出，进行进一步处理，例如免疫染色。对于高内涵成像，每孔将使用20倍物镜拍摄共30个视野，其中线粒体采用Fitzy滤光片组，βIII微管蛋白采用Trixy滤光片组，细胞核采用UV滤光片组进行成像。

这是通过高内涵成像获得的细胞复合图像示例。图中A面板显示三个未经处理的细胞，B面板显示经H2O处理的两个细胞。DJ one以绿色标记，线粒体为红色，细胞核为蓝色。为确定DJ one与线粒体之间的平均共定位系数，需使用共定位生物应用软件分析这些图像。

定义感兴趣区域。ROI 如下：ROIA 为细胞核，见图四 A 和 E；ROIB 为线粒体，见图四 B 和 F，并从 ROIB 中排除 ROIA。为确保仅对细胞质进行分析，将线粒体定义为目标区域一，DJ1 定义为目标区域二，见图四 C 和 G。使用 com compartmental analysis bio 应用程序分析图像，以确定线粒体内 MIT tracker 信号的平均强度。

图四 B 和 F 显示了通过 βIII 微管蛋白染色追踪神经突平均长度的结果。使用 Opera LX 自动共聚焦成像仪，结合神经元形态分析生物应用软件（图四 D 和 H）对图像进行分析，并进一步处理下一张图像板。

使用561纳米激光观察线粒体，利用紫外激发光成像细胞核。采用60倍水浸物镜，每孔共采集30个视野。最后使用斑点边缘脊或SER纹理特征算法分析图像。

SER脊状滤波器可检测形成脊状模式的像素强度。线粒体越破碎，SER脊状评分越高。在本视频中，采用高内涵（HC）检测方法来鉴定DJ-1A蛋白的调节因子，该蛋白的缺失会导致常染色体隐性遗传性帕金森综合征。

第一个代表性结果展示了与 DJ one 之间的上位性相互作用。左侧的柱状图显示了归一化的荧光单位，右侧的图像显示了用 MitoTracker 红色标记的 SHSY5Y 细胞，用于细胞活力的定量分析。

观察到，在暴露于毒素的细胞中，DJ one 基因敲低导致细胞活力下降程度显著高于感染乱序慢病毒的细胞。靶基因 A 的敲低所产生的效应与 DJ one 基因敲低的细胞中所观察到的结果相似。然而，同时敲低 DJ one 和靶基因 A 所导致的细胞活力下降程度显著大于任一基因单独缺失时的效应，这表明 DJ one 与靶基因 A 之间存在上位性相互作用。下一个例子涉及一个调控 DJ one 转位的基因。

柱状图显示了DJ1与线粒体之间的归一化重叠系数，该系数反映了DJ1从细胞质向线粒体的转位。图A至图D为SH-SY5Y细胞的图像，其中DJ1以绿色标记，线粒体以红色标记，细胞核以蓝色标记。当细胞暴露于毒素时，DJ1会从细胞质转位至线粒体，DJ1与线粒体之间的重叠系数升高可量化这一过程。

在目标基因B被沉默的细胞中，当细胞暴露于毒素时，较少的DJ一转运至线粒体，这表明目标基因B参与了DJ一向线粒体的转运过程。此处展示了一个参与神经元突起生长的基因示例。柱状图显示了标准化的神经突长度，用于神经突长度定量分析的细胞图像中，β-III微管蛋白以绿色显示，细胞核以蓝色显示。

在野生型SHSY5Y细胞中，靶基因C的敲低导致神经突长度较感染表达乱序shRNA的慢病毒的细胞显著增加。在用毒素孵育的细胞中，该效应消失。最后，这些结果展示了一个参与线粒体形态调控的基因实例。

图中显示了经乱序HRNA或靶向基因D的A-S-H-R-N-A感染的SHSY-5Y细胞的线粒体SER嵴平均分割值。图像A和图像C分别为经乱序HRNA或靶向基因D的A-H-R-N-A感染的SHSY-5Y细胞的复合图像。线粒体以红色标记，细胞核以蓝色标记。

图B和图D展示了此处观察到的线粒体内膜嵴定量结果的可视化图像。与感染对照型慢病毒的细胞相比，用靶向基因D的HRNA感染野生型SHSY5Y细胞会导致线粒体内膜嵴分段值增加。该方法可为神经退行性疾病领域的研究人员及时探索和注释疾病发病机制中涉及的通路提供新的途径。

这将有助于确定更优的治疗靶点。