Name: 在神经退行性疾病的高内涵筛选 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-01-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 32 s
Description: 了解高内涵筛选技术在神经退行性疾病研究中的应用，利用自动化细胞培养系统和高内涵成像技术，通过神经母细胞瘤细胞模型分析神经元生长和线粒体功能，为疾病机制研究和药物靶点发现提供高效方法。

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感谢 Hamilton 的程序员和专家们持续提供的支持，以及 Eva Blaas 提供的技术协助。本工作得到了两项荷兰科学研究组织（NWO）投资拨款（911-07-031 和 40-00506-98-10011）、2009 年 Princess Beatrix 基金会科学奖以及阿姆斯特丹神经科学园区的支持；S.J. 的研究由 Ti-Pharma（T5-207）资助。

1. 自动化贴壁细胞培养过程（图1）20
<ol>
	<li>为自动化细胞培养系统准备细胞培养板的输入。使用图形用户界面（GUI）将耗材（例如移液吸头、细胞培养板、检测板）装入系统。确保机器人系统中有足够的细胞培养基、磷酸盐缓冲液（PBS）和胰蛋白酶。</li>
	<li>手动将SH-SY5Y神经母细胞瘤细胞系以每板2 × 106个细胞的密度接种到两个omnitray板中。使用含10%胎牛血清（FBS）的Opti-MEM培养基培养细胞。通过图形用户界面（GUI）将培养板放入细胞培养机器人系统中。细胞将在37°C、5% CO2条件下孵育。</li>
	<li>选择需要启动的细胞培养方案20。可从贴壁细胞培养流程22、在小鼠饲养层细胞上培养与扩增胚胎干细胞（ES细胞）23，或悬浮细胞培养22中进行选择。</li>
	<li>选择贴壁细胞培养方案（图1），并调整与贴壁细胞系相关的参数文件，使融合度阈值（即omnitray板上含有细胞的区域比例）设定为70%。将总胰蛋白酶消化时间设为两分钟。</li>
	<li>指示机器人准备新的omnitray板，每板接种细胞数为2 × 106个。</li>
	<li>使用自动化贴壁细胞培养方案（图1）将omnitray板输入细胞培养系统。该方案包括以下步骤：培养板在系统中孵育并成像，直至达到预设的融合度阈值。若在连续5次读数内细胞未达到融合度阈值，则将培养板从系统中移除。当细胞达到用户设定的融合度阈值后，进行洗涤、胰蛋白酶消化和细胞计数。将预定数量的细胞接种至新的omnitray板中；若细胞数量充足，则将指定数量的检测板传送至工作台，并向每孔分配设定数量的细胞。检测板可通过集成显微镜直接成像，或从系统中取出进行后续处理。</li>
	<li>指示系统为每块omnitray板准备4块检测板，每孔接种5,000个细胞。</li>
</ol>
2. shRNA 病毒的制备及接种至检测板（所需时间：6 天）
<ol>
	<li>在含有 100 μg/ml 氨苄青霉素（Sigma-Aldrich）的 2 ml LB 培养基中，过夜培养含有 shRNA 载体（Open Biosystems, TRC1）的细菌甘油菌种。</li>
	<li>按照生产商的说明（Promega Wizard MagneSil Tfx）提取质粒。</li>
	<li>采用 RNAi 联合会高通量慢病毒生产（96 孔板）方案24制备病毒。慢病毒操作相对安全，因为用于转导的病毒颗粒为复制缺陷型，且其制备过程中采用了分裂基因包装策略。然而，操作慢病毒时仍需采取额外的生物安全措施，以最大限度降低对自身及他人的风险25。所有实验必须在 MLII 或 BSL2 级别的生物安全实验室中进行。所有接触过慢病毒颗粒的塑料制品（移液器吸头、培养皿、培养基）在丢弃前应使用漂白剂孵育 24 小时。</li>
	<li>使用 pLKO.1 GFP 质粒（Sigma-Aldrich）通过测定 GFP 阳性细胞百分比，计算慢病毒的感染复数（MOI）。</li>
	<li>将慢病毒以 MOI 为 3 的剂量接种至检测用培养板中。</li>
</ol>
3. SH-SY5Y 细胞的慢病毒转导与神经元分化（所需时间：6 天）
<ol>
	<li>将细胞加入检测板中（参见步骤1.7）。将含有shRNA慢病毒的检测板装入自动细胞培养系统。</li>
	<li>24小时后，将检测板中的培养基更换为含0.5% FBS和0.1 μM视黄酸的Opti-MEM，以启动分化过程。SH-SY5Y细胞的分化可使神经突结构可视化，并同步细胞分裂。</li>
	<li>在分化培养基中继续孵育检测板5天。此步骤可确保目标基因表达的最大程度敲低。</li>
	<li>第5天，向一半检测板中加入50 μM H2O2，处理24小时，以诱导DJ1向线粒体转位。</li>
	<li>第6天，向细胞中加入Mitotracker CmxROS（Invitrogen），每孔终浓度为200 nM，37°C孵育30分钟。</li>
	<li>可指示系统直接使用HC成像仪对检测板进行成像，也可将检测板从系统中导出以进行后续处理。</li>
</ol>
4. 检测板的自动化免疫染色（所需时间：2天）
图像质量对于进行灵敏且可靠的高内涵筛选（HCS）至关重要。不准确的移液操作可能导致细胞单层受损，从而造成图像质量下降和结果不可重复。为了最大限度减少对细胞层的损伤，免疫染色过程采用机器人工作站完成。该流程类似于先前报道的方法26，但已针对提高通量和减少耗材使用进行了优化定制。
<ol>
	<li>用 100 μl 预热至 37°C 的 4% 多聚甲醛固定细胞，在室温下孵育 20 分钟。</li>
	<li>用 200 μl PBS 洗涤细胞，每次 5 分钟，共洗 3 次。</li>
	<li>用含 0.1% Triton 的 200 μl PBS（PBST）孵育检测板，孵育 10 分钟。</li>
	<li>用 200 μl PBS 洗涤细胞，每次 5 分钟，共洗 3 次。</li>
	<li>用 200 μl 封闭缓冲液（含 5% FBS 的 PBST）在室温下孵育检测板 1 小时。</li>
	<li>用 200 μl PBS 洗涤细胞，每次 5 分钟，共洗 3 次。</li>
	<li>在 4°C 下，用以下一抗孵育过夜：
	<ol>
		<li>Goat DJ1 N20（Santa Cruz，5 μg/ml）</li>
		<li>Rabbit β-III tubulin（Sigma-Aldrich，1 μg/ml）</li>
	</ol>
	</li>
	<li>次日，用 200 μl PBS 洗涤细胞，每次 5 分钟，共洗 3 次。</li>
	<li>在室温下，用以下二抗孵育检测板 1 小时：
	<ol>
		<li>AlexaFluor 488 驴抗山羊抗体（Invitrogen，2 μg/ml）</li>
		<li>AlexaFluor 647 山羊抗兔抗体（Invitrogen，2 μg/ml）</li>
	</ol>
	</li>
	<li>用 200 μl PBS 洗涤细胞，每次 5 分钟，共洗 3 次。</li>
	<li>用 Hoechst（Invitrogen；1 μg/ml）孵育细胞 10 分钟。</li>
	<li>用 200 μl PBS 洗涤细胞，每次 5 分钟，共洗 3 次。</li>
	<li>将检测板置于 4°C 保存，直至进行成像。</li>
</ol>
5. 高内涵图像采集与图像分析（所需时间：5 天）
<ol>
	<li>使用 20 倍物镜对每个孔总共成像 30 个视野。采用 FITC 滤光片组观察 DJ1，TRITC 滤光片组观察线粒体，Cy5 滤光片组观察 β-III 微管蛋白，UV 滤光片组观察细胞核（图 3）。</li>
	<li>使用 Compartmental Analysis 生物应用软件（Cellomics, ThermoFisher）分析图像，测定线粒体内 Mitotracker 信号的平均强度（图 4B, F）。</li>
	<li>为测定 DJ1 与线粒体之间的平均共定位系数，使用 Cellomics Colocalisation 生物应用软件（Cellomics, ThermoFisher）分析图像。按如下方式定义感兴趣区域（ROI）：ROI A — 细胞核（图 4A, E），ROI B — 线粒体（图 4B, F）。从 ROI B 中排除 ROI A，以确保仅对细胞质进行分析。将线粒体定义为目标区域 I，DJ1 定义为目标区域 II（图 4C, G）。</li>
	<li>使用 Neuronal Profiling 生物应用软件（Cellomics, Thermofisher）分析图像，根据 β-III 微管蛋白染色结果追踪神经突的平均长度（图 4D, H）。</li>
	<li>使用 Opera LX 自动共聚焦成像系统（Perkin-Elmer）对微孔板进行成像。使用 60 倍水浸物镜，对每个孔总共成像 30 个视野。采用 561 nM 激光激发线粒体，UV 激发细胞核。</li>
	<li>使用斑点-边缘-脊（Spot-Edge-Ridge, SER）纹理特征算法分析图像。SER-Ridge 滤波器可传递呈脊状模式的像素强度信号。线粒体越碎片化，SER-Ridge 评分越高（图 8）。</li>
</ol>
6. 数据标准化与分析
<ol>
	<li>将图像分析软件中的数据导入 R 软件环境（R 版本 2.11.1，BioConductor 版本 2.6）中的 BioConductor CellHTS2 包。</li>
	<li>在基于每块板中位数进行归一化之前，对数据进行以 2 为底的对数转换27, 28。不要对每块板应用方差调整。</li>
	<li>为鉴定表型的调控因子，对不同处理组之间进行双向方差分析，即：Scrambled 感染未处理细胞 vs. scrambled 毒素处理细胞 vs. 目标基因未处理细胞 vs. 目标基因处理细胞（图 5-7）。</li>
</ol>
7. 典型结果
DJ1 基因内的突变会导致早发性隐性帕金森综合征21，但目前尚不清楚 DJ1 功能缺失如何引发该疾病的表型。已知缺乏 DJ1 的细胞更容易因氧化应激而发生细胞死亡，并且在氧化应激条件下，DJ1 会从细胞质转位至线粒体29, 30。通过构建高通量筛选实验以监测这些表型，我们可以鉴定调控或影响 DJ1 相关表型的基因。该方法有助于解析 DJ1 所参与的生物学通路，以及这些通路在疾病发生机制中的潜在作用。
DJ1 存在表观遗传相互作用的一个示例（图5）：在暴露于毒素的细胞中，DJ1 敲低导致细胞活力显著下降（BAR-B：图像-B），相较于感染乱序慢病毒的细胞（BAR-A：图像-A）。靶基因A的敲低所产生的效应与DJ1敲低细胞中观察到的效应相似（BAR-C：图像-C）。同时敲低DJ1和靶基因A所导致的细胞活力下降程度显著大于单独敲低任一基因的情况（BAR-D：图像-D）。这表明DJ1与靶基因A之间存在表观遗传相互作用。
调控DJ1转位的基因示例（图6）：当细胞暴露于毒素时，DJ1从细胞质转位至线粒体，DJ1与线粒体之间的重叠系数升高可量化该过程（BAR-A：图像A与BAR-C：图像C）。在靶基因B被沉默的细胞中，当暴露于毒素时，转位至线粒体的DJ1减少。这表明靶基因B参与了DJ1向线粒体的转运过程（BAR-B：图像B与BAR-D：图像D）。
参与神经元轴突发育的基因示例（图7）：在野生型SH-SY5Y细胞中，靶基因C的表达被敲低后，与感染表达乱序shRNA的慢病毒的细胞（BAR-A：图像A）相比，神经突长度显著增加（BAR-B：图像B）。该效应在经毒素处理的细胞中消失（BAR-C和D）。
参与线粒体形态调控的基因示例（图8）：与感染了乱序慢病毒的细胞（图8，图像A和B）相比，用靶向基因D的shRNA感染野生型SH-SY5Y细胞会导致线粒体SER-脊状结构分割值降低（图8，图像C和D）。
<img alt="贴壁细胞系培养流程图；过程包括孵育、成像和传代。" src="/files/ftp_upload/3452/3452fig1.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图1."> 图1. 自动化细胞培养方案的流程概述。请<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3452/3452fig1_lg.jpg">点击此处</a>查看此图的高清版本。
<img alt="包含免疫染色步骤和高内涵成像结果的自动细胞培养流程示意图。" src="/files/ftp_upload/3452/3452fig2.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 2。"> 图 2。 筛选过程、图像分析及筛选过程中所用统计方法的示意图：i) 细胞培养至融合后，接种至含有 shRNA 慢病毒的检测板中。细胞分化 5 天后，向检测板中加入毒素并作用 24 小时。随后将检测板从系统中取出并进行免疫染色。各步骤所需时间在括号中注明。ii) 使用高内涵成像仪（检测细胞活力、蛋白转位和神经元突起生长）和自动共聚焦成像仪（检测线粒体形态）获取数据。数据导出至 R 语言中的 CellHTS2 软件包，进行以 2 为底的对数转换并归一化处理。采用双因素方差分析（Two-way ANOVA）识别不同变量间的显著性相互作用。请<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3452/3452fig2_lg.jpg">点击此处</a>查看本图的高清版本。
<img alt="神经细胞荧光显微镜图像，显示图A和图B中的细胞形态比较。" src="/files/ftp_upload/3452/3452fig3.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 3。"> 图 3。 通过高内涵成像获取的细胞复合图像。A）未经处理的细胞，B）经 H2O2 处理的细胞。DJ1 标记为绿色，线粒体为红色，细胞核为蓝色。神经突染色未突出显示。
<img alt="显示细胞结构的荧光显微镜分析，突出细胞核和细胞骨架特征。" src="/files/ftp_upload/3452/3452fig4.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 4。"> 图 4。 高内涵筛选（HCS）获得的多种细胞特征的定量分析。A-D) 未经处理的 SH-SY5Y 细胞；E-H) 经 H2O2 处理的 SH-SY5Y 细胞。A, E) 细胞核分割及 ROI A 的定义；B, F) 线粒体的识别与定量，ROI B；C, G) DJ1 的识别，靶标通道 II；D, H) 神经突平均长度的识别与计算。位于图像边缘附近的细胞被排除在分析之外。插图显示的是分析前的原始图像。
<img alt="DJ1基因调节因子的细胞活力图；红色通道荧光显微镜图像。" src="/files/ftp_upload/3452/3452fig5.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图5。"> 图5。 与DJ1基因存在上位性关系的基因的鉴定（柱状图上的字母对应图像中的标注）。图像A至D为SH-SY5Y细胞，用Mitotracker CMXRos（红色）标记，用于细胞健康状态的定量分析。
<img alt="DJ1 转位分析；柱状图与荧光显微镜图像；线粒体定位。" src="/files/ftp_upload/3452/3452fig6.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图6。"> 图6。 调控DJ1转位的基因鉴定（柱状图上的字母对应图像中的标注）。图像A至D为SH-SY5Y细胞，分别标记DJ1（绿色）、线粒体（红色）和细胞核（蓝色），用于定量分析DJ1向线粒体的转位。
<img alt="神经突起生长的调节因子图表及显微镜图像，显示基因在有/无毒素条件下的作用效果。" src="/files/ftp_upload/3452/3452fig7.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 7。"> 图 7。 鉴定参与神经元突起生长的基因（柱状图上的字母对应图像中的标注）。图像 A 至 D 为 SH-SY5Y 细胞，经 β-III 微管蛋白（绿色）和细胞核（蓝色）标记，用于神经突长度的定量分析。
<img alt="线粒体形态修饰；A-D细胞样本的柱状图、荧光显微镜图像。" src="/files/ftp_upload/3452/3452fig8.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图8。"> 图8。 参与调控线粒体形态的基因鉴定。图像A和C分别为感染了对照shRNA或靶向基因D的shRNA的SH-SY5Y细胞的复合图像。线粒体显示为红色，细胞核显示为蓝色。图像B和D为SER-Ridge定量分析的可视化结果。

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</ol>

我们无任何利益冲突需要披露

随着高通量/高内涵（HT/HC）细胞筛选系统的成本不断降低，以及能够有效调控基因功能的全基因组工具的广泛应用，HT/HC筛选在学术界正变得越来越普遍。该方法已成功应用于多个研究领域，例如癌症药物靶点的鉴定9, 31-33和胚胎发育研究34-36，甚至在解析神经精神疾病相关通路方面也展现出应用潜力37,38。然而，此类系统的实施需要投入大量时间和精力，流程优化通常至少需要6个月。所有步骤，如胰酶消化时间、移液速度和接种密度等，都必须进行调整，以确保细胞健康并保持稳定的生长状态。防止细菌污染是自动化细胞培养面临的最大挑战之一，必须每周进行系统清洁，并持续使用70%乙醇冲洗所有液体管路，才能实现无污染的培养。此外，还需进一步改进机器人系统，以便整合更多仪器，例如用于更高分辨率成像的共聚焦显微镜以及用于化合物储存的-80°C超低温冰箱。
此外，还需要解决一些局限性，以提高该方法在研究基因网络和鉴定参与致病分子通路的基因方面的灵敏度、速度和实用性。
为了开展高通量/高内涵筛选并确保收集到可靠的数据，需要优化多个方面。首先，测量的可靠性至关重要，而这取决于检测方法的稳健性和灵敏度。例如，上文所述的检测方法适用于较小规模的筛选，但由于图像采集前需要进行较多的处理步骤，因此难以在全基因组范围内实施。因此，需要构建稳定表达报告基因的细胞系，从而实现直接成像，并因减少处理步骤而降低变异程度。目前，设计一种能够准确呈现并可靠量化目标表型的检测方法，仍是高内涵筛选过程中的主要瓶颈。
许多筛选在哺乳动物细胞中进行，使用不同的RNAi文库，而这些文库均存在脱靶效应、基因沉默效率有限以及基因组覆盖不完全的问题。因此，需要构建更具特异性、更强效且覆盖更全面的文库。目前已有多个项目正在致力于开发此类文库<a href="http://www.sigmaaldrich.com/life-science/functional-genomics-and-rnai/shrna/library-information.html">(http://www.sigmaaldrich.com/life-science/functional-genomics-and-rnai/shrna/library-information.html)</a>，期望这些努力能够提高高通量/高内涵筛选结果的可重复性。
许多大规模基于细胞的筛选实验存在一个局限性，即这些实验通常在神经母细胞瘤细胞中进行，因为此类细胞易于进行遗传操作，并可相对容易地培养至较大数量。然而，在离体细胞培养模型中鉴定出的“阳性结果”与体内实际情况的相关性 体内 其功能尚存疑问，尤其是因为大脑由高度特化的细胞类型组成，这些细胞类型通过密集而复杂的突触连接网络，形成功能高度整合的统一体。因此，通常需要利用其他技术以及更具生理相关性的模型，在二次筛选中对上述筛选方法所鉴定出的阳性结果进行验证 39为了提高高内涵筛选（HCS）中所鉴定出的阳性结果的可转化性，需要开发并优化更具代表性且更为复杂的模型，例如原代细胞、分化后的干细胞或共培养系统，以适用于高通量/高内涵（HT/HC）研究方法。
通过结合自动化的细胞培养和高内涵成像技术，可以快速深入了解神经元的功能机制，并确定哪些通路在疾病发生过程中起重要作用。将高内涵筛选/高通量筛选数据与其他组学方法产生的信息相结合，将有可能构建脑部疾病的系统生物学全景，从而推动治疗策略的开发。

<table><tbody><tr><td>AI.CELLHOST</td><td>汉密尔顿公司</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.hamiltonrobotics.com/en-uk/applications/cellomics/">http://www.hamiltonrobotics.com/en-uk/applications/cellomics/&lt;/a&gt;</td><td></td></tr><tr><td>OPTI-MEM</td><td>Invitrogen</td><td>31985-054</td><td></td></tr><tr><td>视黄酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R2625</td><td></td></tr><tr><td>OMNITRAY 培养板</td><td>Nalge Nunc International</td><td>465219</td><td></td></tr><tr><td>96 孔培养板</td><td>Greiner Bio-One</td><td>655086</td><td></td></tr><tr><td>DJ1 N20 抗体</td><td>Santa Cruz Biotechnology, Inc.</td><td>SC27004</td><td></td></tr><tr><td>βIII 微管蛋白抗体</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T3952</td><td></td></tr><tr><td>MitoTracker CMXRos</td><td>Invitrogen</td><td>M-7512</td><td></td></tr><tr><td>H&amp;#8211;CHST-33342</td><td>Invitrogen</td><td>H1399</td><td></td></tr><tr><td>过氧化氢</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>216763-100ML</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶</td><td>Invitrogen</td><td>25050014</td><td></td></tr><tr><td>杜尔贝科&amp;rsquo;S 磷酸盐缓冲液</td><td>Invitrogen</td><td>14190086</td><td></td></tr><tr><td>PROMEGA WIZARD MAGNESIL TFX </td><td>Promega Corp.</td><td>A2380</td><td></td></tr><tr><td>shRNA 克隆</td><td>Open Biosystems</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.openbiosystems.com/RNAi/shRNALibraries/TRCLibraryDetails/">http://www.openbiosystems.com/RNAi/shRNALibraries/ TRCLibraryDetails/&lt;/a&gt;</td><td></td></tr><tr><td>CELLomics 生物应用</td><td>赛默飞世尔科技公司</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.thermo.com/hcs">http://www.thermo.com/hcs&lt;/a&gt;</td><td></td></tr></tbody></table>

神经退行性疾病中的高内涵筛选

High Content Screening in Neurodegenerative Diseases

基因组的功能注释、分子网络的构建以及新药物靶点的鉴定，是亟需解决的重要挑战1-4。多种互补的“组学”方法为揭示众多神经退行性疾病的遗传风险因素和致病机制提供了线索，但大多数发现仍需要进行功能验证5。例如，最近一项针对帕金森病（PD）的全基因组关联研究鉴定出许多新的位点作为该疾病的風險因素，但其潜在的致病变异或致病机制尚不清楚6, 7。由于每个相关区域可能包含多个基因，若使用传统的细胞生物学技术对每个基因在与疾病相关的表型中进行功能评估，将耗时过长。
	还迫切需要理解将基因突变与其所导致的表型联系起来的分子网络。疾病表型很可能是多个被破坏的相互作用共同作用的结果。利用传统的分子方法重建这些网络将耗费大量时间。此外，通过独立研究各个组分（即还原论方法）所得到的网络预测，可能会低估网络的复杂性8。这种低估可能部分解释了由于不良或毒性副作用而导致药物审批成功率较低的原因。通过高通量/高内涵细胞筛选方法获得与疾病相关通路的网络视角，并识别这些通路中的关键节点，可能有助于发现更适合作为治疗干预靶点的分子靶标。
	高通量筛选（HTS）是解决这些问题的理想方法9-12，但传统方法依赖于一维的全孔细胞检测，仅对复杂的生物过程采用简化的读出方式。这些方法无法同时量化神经退行性疾病中观察到的多种表型，例如轴突运输缺陷或形态学特性的改变13, 14。该方法也不能用于研究细胞过程中或在部分细胞中发生的致病事件的动态特性。为了量化此类特征，必须转向被称为高内涵筛选（HCS）的多维表型分析方法4, 15-17。HCS 是一种基于细胞的多过程同步定量技术，相较于 HTS，能够更详细地反映细胞对各种扰动的响应。
	HCS 与 HTS 相比具有多种优势18, 19，但在神经元模型中开展高通量（HT）-高内涵（HC）筛选仍存在困难，主要由于成本高昂、环境变异以及人为误差。为了利用高内涵成像在“表型组学”尺度上检测细胞反应，必须在提高灵敏度和可重复性的同时，降低变异性和误差。
	本文介绍了一种利用自动化细胞培养20和高内涵成像技术在神经元细胞模型中准确、可靠地进行shRNA筛选的方法。我们描述了如何应用该方法学鉴定某一特定蛋白DJ1的调节因子，DJ1基因突变可导致常染色体隐性遗传性帕金森病21。
	将高内涵成像的多功能性与高通量方法相结合，可精确量化多种表型。这有助于进一步深入理解基因组、疾病发病机制中涉及的通路，并识别潜在的治疗靶点。

我们介绍了一种将自动细胞培养与高内涵成像相结合的方法，可高通量地可视化并定量多种细胞过程和结构。此类方法有助于进一步完善基因组的功能注释，同时识别疾病相关基因网络及潜在的药物靶点。

基因组的功能注释、分子网络的构建以及新药物靶点的鉴定是亟需解决的重要科学挑战。

以下实验的总体目标是利用高内涵检测技术，在细胞疾病模型中定量分析神经退行性疾病中受影响的信号通路。为实现这一目标，将具有疾病表型的细胞模型接入自动化细胞培养系统，并培养细胞至达到所需细胞数量。随后对细胞进行传代、计数，并接种至96孔板中，孔板内含有表达多种SH RNA的慢病毒。经过六天的细胞分化后，将细胞从系统中取出进行免疫染色和高内涵成像。最后，利用多种分析算法对图像进行分析，以定量评估与细胞健康相关的特征，包括神经元突起生长和线粒体功能。结果还通过诺瓦斯中的双向分析来识别显著的交互作用效应。该方法可加快回答关于疾病相关基因功能及其整体作用通路的关键问题，进而加深对神经退行性疾病中致病机制的理解。开始细胞培养过程时，准备自动化细胞培养系统以接收细胞培养板。将移液器吸头、细胞培养板和检测板等耗材装入系统中。同时，手动确保系统内含有足够的细胞培养基、PBS 和胰蛋白酶。将SH-SY5Y神经母细胞瘤细胞系以每孔两乘以十的六次方个细胞的密度接种到两个万用培养板中。使用含10%胎牛血清（FBS）的完全培养基培养细胞，并将培养板放置于细胞培养机器人中的输入架上。通过图形用户界面（GUI）选择A型贴壁细胞培养程序，并调整针对该贴壁细胞系的特定参数文件，使融合度阈值设定为70%。将总时间设定为两分钟。指示系统准备新的 Omni Tray 培养板，每板接种细胞数量为每板 2 × 10⁶ 个细胞。指示系统为每块 Omni Tray 培养板准备检测板，每孔接种总量为 5,000 个细胞，并将细胞在 37°C 和 5% CO₂ 条件下孵育。本黏附细胞培养方案包含以下步骤。将培养板孵育并成像，直至细胞达到预设的汇合度阈值。若细胞在五次读数内未达到汇合度阈值，则将培养板从系统中移除。当细胞达到用户设定的汇合度阈值后，进行洗涤、胰酶消化并计数。将预定数量的细胞接种至新的多功能培养板中；若细胞数量充足，则将指定数量的检测板转移至仪器平台，并向每孔中分配设定数量的细胞。最后，可使用系统内置显微镜直接对检测板进行成像，或将其从系统中取出进行后续处理，以启动病毒制备流程。在含有氨苄青霉素的LB培养基中接种含有HRNA载体的细菌甘油菌种，于次日过夜培养。随后离心收集菌体，弃去上清液，使用Wizard Magnus细胞质粒纯化系统提取质粒。最终含有质粒DNA的洗脱液收集至96孔板中。S-H-R-N-A慢病毒由RNAi联盟提供，在96孔板中进行慢病毒生产。所有实验必须在生物安全二级（ML2或BSL-2）实验室中进行，使用过的所有试剂和耗材必须用30%氯溶液进行消毒处理。本视频中不会演示慢病毒的制备过程，但该过程需要四天，包括以下步骤。首先，在第零天下午接种包装细胞。第一天，在转染后18小时，用三种慢病毒质粒转染包装细胞。第二天，更换为新鲜的高BSA或高血清培养基。换液后24小时。第三天，收集病毒，并再次更换为新鲜的高BSA或高血清培养基。最后，在首次收获病毒后的24小时（即第四天）再次收获病毒，并弃去包装细胞，以计算慢病毒转导的感染复数（MOI）。用病毒进行连续稀释，转导SH-SY5Y细胞，于37°C培养72小时。在显微镜下观察GFP表达情况，确定GFP阳性细胞的比例。将S-H-R-N-A慢病毒以MOI为3的条件接种至检测用培养板中。将SHRNA慢病毒接种至检测板后，将培养板放入自动细胞培养系统中进行慢病毒转导。24小时后，将检测板中的培养基更换为含有0.5% FBS和0.1微摩尔视黄酸的最适培养基。为启动分化过程，继续在分化培养基中孵育检测板5天，以确保在第5天时目标基因表达达到最大程度的敲低。在第6天，向一半检测板中加入H2O，处理24小时以诱导DJ-1蛋白向线粒体的转位。随后以每孔200纳摩尔的终浓度向细胞中加入MIT tracker，在37°C下孵育30分钟。此后，可将培养板转移至高内涵（HC）成像仪进行成像。或者，也可将培养板从系统中导出，进行进一步处理，例如免疫染色。对于高内涵成像，将使用20倍物镜，针对每个孔采集共30个视野的图像：使用Fitzy滤光片组观察线粒体，使用Trixy滤光片组观察βIII微管蛋白，使用S5滤光片组观察细胞核，使用紫外（UV）滤光片组观察细胞核。这是通过高内涵成像获得的细胞复合图像示例。图中A面板显示三个未经处理的细胞，B面板显示经H2O2处理的细胞。DJ1以绿色标记，线粒体为红色，细胞核为蓝色。为确定DJ1与线粒体之间的平均重叠系数，需使用共定位生物分析应用程序对图像进行分析。定义感兴趣区域。ROI 如下：ROIA 为细胞核，见图四 A 和 E；ROIB 为线粒体，见图四 B 和 F，从 ROIB 中排除 ROIA。为确保仅对细胞质进行分析，将线粒体定义为目标区域一，DJ1 定义为目标区域二，见图四 C 和 G。使用 com compartmental analysis bio 应用程序分析图像，以确定线粒体内 MIT tracker 信号的平均强度。利用 βIII 微管蛋白染色结果追踪图四 B 和 F 中神经突的平均长度。使用 Opera LX 自动共聚焦成像系统，结合神经元形态分析生物应用（图四 D 和 H 所示的下一张图像板块）对图像进行分析。使用561纳米激光观察线粒体，并用紫外激发光成像细胞核。采用60倍水浸物镜，每孔共采集30个视野。最后利用斑点边缘脊或SER纹理特征算法分析图像。SER脊状滤波器可检测形成脊状模式的像素强度。线粒体越破碎，SER脊状评分越高。在本视频中，采用高内涵（HC）检测方法来鉴定DJ-1A蛋白的调节因子，该蛋白的缺失会导致常染色体隐性遗传性帕金森综合征。首个代表性结果展示了与 DJ one 之间的上位性相互作用。左侧的柱状图显示了归一化的荧光单位，右侧的图像显示了用线粒体追踪染料（mito tracker）标记为红色的 SHSY5Y 细胞，用于细胞活力的定量分析。观察到，在暴露于毒素的细胞中，DJ one 基因敲低导致细胞活力下降程度显著高于感染乱序慢病毒的细胞。靶基因 A 的敲低所产生的效应与 DJ one 基因敲低的细胞中所观察到的结果相似。然而，同时敲低 DJ one 和靶基因 A 导致的细胞活力下降程度显著大于任一基因单独缺失所造成的影响，这表明 DJ one 与靶基因 A 之间存在上位性相互作用。下一个例子涉及一个调控 DJ one 转位的基因。柱状图显示了DJ1与线粒体之间的归一化重叠系数，该系数反映了DJ1从细胞质向线粒体的转位。图A至图D为SH-SY5Y细胞的图像，其中DJ1以绿色标记，线粒体以红色标记，细胞核以蓝色标记。当细胞暴露于毒素时，DJ1会从细胞质转位至线粒体，这通过DJ1与线粒体之间更高的重叠系数得以量化。在目标基因B被沉默的细胞中，当细胞暴露于毒素时，较少的DJ一转运至线粒体，这表明目标基因B参与了DJ一向线粒体的转运过程。此处展示了一个参与神经元突起生长的基因示例。柱状图显示了标准化后的神经突长度，用于神经突长度定量分析的细胞图像中，βIII微管蛋白以绿色显示，细胞核以蓝色显示。在野生型SHSY5Y细胞中，靶基因C的敲低导致神经突长度较感染表达乱序shRNA的慢病毒的细胞显著增加。在用毒素孵育的细胞中，该效应消失。最后，这些结果展示了一个参与线粒体形态调控的基因实例。图中显示了经乱序HRNA或靶向基因D的A-S-H-R-N-A感染的SHSY五Y细胞的线粒体SER嵴平均分割值。图像A和图像C分别为经乱序HRNA或靶向基因D的A-H-R-N-A感染的SHSY五Y细胞的复合图像。线粒体以红色标记，细胞核以蓝色标记。图像B和D是此处观察到的线粒体SER嵴定量分析的可视化结果。与感染乱序慢病毒的细胞相比，用靶向基因D的HRNA感染野生型SHSY5Y细胞会导致线粒体SER嵴分割值增加。该方法可为神经退行性疾病领域的研究人员及时探索和注释疾病发病机制中涉及的通路提供新的途径。这将有助于确定更优的治疗靶点。

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医学

在神经退行性疾病的高内涵筛选

本文介绍了一种新颖的实验方案和试剂组合，旨在利用高内涵分析技术，对化合物和处理因素在神经元与星形胶质细胞共培养体系中的神经毒性效应进行高灵敏度检测。结果表明，高内涵分析技术是评估神经毒性的全新且富有前景的技术手段。...

一种用于神经毒性高内涵分析的神经元与星形胶质细胞共培养实验方法

来源：Bétemps, D., 等，通过增强型ELISA检测人A53T突变α-突触核蛋白过表达转基因小鼠脑中与疾病相关的α-突触核蛋白。J. Vis. Exp.

利用ELISA检测神经退行性疾病相关蛋白α-突触核蛋白

我们介绍一种快速且低成本的筛选方法，通过高通量机器人转染和自制的双荧光素酶检测技术来鉴定转录调控因子。该方案可快速获得数千个基因的直接平行功能数据，并可轻松修改以靶向任何感兴趣的基因。...

高通量功能筛选：使用自制双发光荧光素酶检测法

本文介绍了4山测试（4MT），一种依赖海马体的他我空间工作记忆测试。海马体在阿尔茨海默病（AD）早期即受到累及，本文阐述了4MT的方法学及患者测试结果，证明了4MT在前痴呆期AD诊断中的价值。...

4山测试：一种对前痴呆期阿尔茨海默病诊断具有高敏感性的简短空间记忆测验

我们描述了一种高通量、多重靶向的脑脊液（CSF）蛋白质组学检测方法，具有临床转化潜力。该检测可定量神经退行性变的潜在标志物和风险因素，例如载脂蛋白E的变异体（E2、E3和E4），并测量其等位基因表达水平。...

一种高通量、多重靶向蛋白质组学脑脊液检测方法，用于定量神经退行性生物标志物及载脂蛋白E亚型状态

本文介绍了一种分阶段的行为学筛选方法，可用于在β-淀粉样蛋白沉积和tau蛋白病变的转基因小鼠模型中，筛选对认知功能和运动功能具有体内疗效的化合物。这些方法经过优化，适用于筛选化合物在短期记忆和工作记忆任务中的活性。...

评估淀粉样蛋白-β和Tau神经病理学转基因小鼠模型中的自发交替、新物体识别和肢体抓握行为

我们介绍了一种定量检测错误折叠蛋白质聚集的方法。本方案详细描述了慢病毒诱导的稳定细胞系构建、自动化共聚焦成像以及蛋白质聚集体的图像分析。作为一个示例性应用，我们研究了小分子在时间和剂量依赖性条件下促进SOD1聚集的作用。...

用于活细胞中 Sod1 突变蛋白聚集体形成高内涵定量的检测方法开发

该方法可生成决策树，用于识别更易患轻度认知障碍的人群，有助于对该疾病的低成本选择性筛查。...

一种基于机器学习的轻度认知障碍高效选择性筛查设计方法

我们描述了由胎儿或成体神经干细胞分化而来的星形胶质细胞与少突胶质前体细胞的混合培养体系，以及体外模拟有害刺激的方法。结合基于细胞的高内涵筛选技术，可构建一个可靠且稳健的药物筛选系统。...

高内涵筛选分析胎儿与成体神经干细胞来源的少突胶质前体细胞培养物的分化与成熟

携带帕金森病致病基因突变的患者成纤维细胞是一种易于获取的 离体...

利用原代人类成纤维细胞监测帕金森病领域中的线粒体表型

了解高内涵筛选技术在神经退行性疾病研究中的应用，利用自动化细胞培养系统和高内涵成像技术，通过神经母细胞瘤细胞模型分析神经元生长和线粒体功能，为疾病机制研究和药物靶点发现提供高效方法。

神经退行性疾病中的高内涵筛选

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