电场控制下神经前体细胞在二维和三维环境中的定向迁移

本实验的总体目标是记录施加的电场对二维培养和三维离体模型中神经前体细胞迁移的影响。首先通过体外分离并扩增神经前体细胞来实现该目标，第二步是制备神经前体细胞的单细胞悬液。

接下来，对于二维培养的制备，将神经前体细胞接种于定制设计的电趋性室中。或者，对于三维离体模型的制备，将神经前体细胞用标记物3, 3, 3, 4, 2进行标记，并注射到脊髓切片类器官模型中。最终，在电趋性室中施加电场，并进行延时成像记录，以显示在二维和三维环境中，前体细胞均向电场的阴极迁移。

该技术的主要优势在于，它提供了一种新颖的方法，可用于在将单个细胞移植到三维类器官模型后，实时追踪电场诱导的细胞迁移过程，该模型高度模拟了天然环境。该方法不仅能够深入揭示电技术在脊髓切片中移植的神经前体细胞迁移行为，还可应用于其他类似的小型脑切片模型系统。开始本实验前，通过将经高压灭菌处理的 22 × 22 毫米玻璃片分割成 22 × 11 毫米的条状，制备所需玻璃条。

使用金刚石笔将一号厚度的盖玻片对半切割。接下来，用高真空硅脂将四条竖直立起的 22 × 11 毫米玻璃条粘合在一起，制成一个内径为 22 × 10 毫米的独立玻璃小室，置于室温下过夜，使其完全干燥并固化。次日，用硅脂将两条 22 × 11 毫米的玻璃条平行固定于 100 毫米培养皿底部，两条玻璃条之间留出 10 毫米的间隙。

然后用硅脂将22 mm × 22 mm的盖玻片密封在这些条带之间。将玻璃小室放置在盖玻片上，使其内壁形成一个用于接种细胞的封闭空间。用硅脂对所有接缝处进行防水密封。

按照随附文稿中的描述，依次用多聚赖氨酸和层粘连蛋白包被该限定区域。在此步骤中，取 E14 至 E16 小鼠的脑组织，并将其置于冷的 D-M-E-M-F12 基础培养基中。接着，在解剖显微镜下去除脑膜。

随后，将脑组织转移至35毫米的培养皿中。使用精细镊子将脑组织分离成组织碎片。然后将其转移至15毫升离心管中。

将样品在800 RPM条件下离心三分钟，以去除D碎片。接下来，向样品中加入含有BFDF和DGF的A-D-M-E-M-F 12。使用1毫升移液器充分混匀。

然后使用细胞筛获取单细胞悬液。将细胞以每毫升20,000至50,000个细胞的密度接种到培养瓶中。每三天进行一次完全换液，即以1,300 RPM离心5分钟收集细胞。

弃去上清液，将传代细胞悬浮于新鲜培养基中，并在至少传代五次后，每六天将细胞重新接种至培养瓶中。将神经球转移至15毫升离心管中，在1,500 RPM条件下离心五分钟。弃去上清液。

用EDTA重悬沉淀，重复三次，以获得单细胞悬液。在进行细胞计数前，准备含有10,000个细胞的1毫升悬液。接下来，去除玻璃小孔中的层粘连蛋白，并使其完全干燥。

加入一毫升细胞悬液进行替换。随后，将培养皿置于37摄氏度的培养箱中孵育至少四小时，以促进细胞贴壁。待细胞达到足够的汇合度后，移除腔室中的培养基。

小心取下玻璃。然后用硅脂将一块 22 × 22 毫米的灭菌玻璃盖玻片小心地固定在两片 22 × 11 毫米的玻璃条之间，形成覆盖细胞的顶盖。注意用几滴培养基覆盖细胞，以防止干燥。

然后在培养皿两端的腔室末端分别形成一个独立的培养基储液区，方法是创建两条从培养皿一端延伸至另一端的防水硅脂屏障。用新鲜培养基填充腔室，确保培养基从一个储液区流至另一个储液区。随后将培养皿放回培养箱中孵育12小时，以使细胞恢复。

下一步，通过在迁移室的每个储液区上方各钻一个孔，制备用于覆盖培养皿的盖子。然后将迁移室中的培养基更换为含有25毫摩尔HEPES缓冲液的培养基。之后，将培养皿转移至温度可控的成像系统中。

设置延时和多点记录的实验参数。调整腔室位置，使阴极和阳极分别位于左侧和右侧，以确保在显微镜下观察及成像系统记录时，电场矢量呈水平方向。接下来，填充两个烧杯。

用 Steinberg 溶液。使用预先准备好的、内含 2% Steinberg 琼脂溶液的玻璃桥，将每个培养基储液器分别连接到一个独立的烧杯。然后将连接至直流电源的银电极放入 Steinberg 溶液中。

在每个烧杯中，将电源上的电压调节旋钮设为零，然后打开电源。使用电压表测量趋电性小室两端的电压，同时逐渐调高电压旋钮。然后根据实验要求调节电压至合适值。

此后，开始进行延时成像记录。根据需要更换培养基并重新调整电压。每隔一小时，可根据需要向储液槽中添加新鲜培养基、药物或化学试剂。

利用在培养皿盖上额外钻出的孔，每个孔位于一个培养基储液槽上方。在此步骤中，解剖两周龄小鼠的腰段脊髓。然后在解剖显微镜下，使用麦切尔-韦恩组织切片器将脊髓切成500微米厚的切片。

分离切片，并挑选出具有完整矢状轴向脊髓结构的切片。随后将切片置于一个含有30 µL MA凝胶的100 mm培养皿中，尽可能放置在中心位置。

将它们置于37摄氏度、5%二氧化碳培养箱中孵育至少30分钟。为了使基质胶蛋白自组装形成覆盖脊髓切片表面的薄膜，确保基质胶完全聚合至关重要。如有必要，将培养皿在37摄氏度下再孵育30分钟，然后加入4至6毫升含25毫摩尔HEPES缓冲液和15%至20%胎牛血清的D-M-E-M-F12培养基。

非常轻柔地操作，避免培养基直接流到切片上，确保切片未完全浸没在培养基中，使茄子的表面充分暴露于空气中。每周更换两次培养基。现在将神经前体细胞悬液在含有五微摩尔钩素的培养基中进行培养。

3、3、3、4、2，持续30分钟。在显微镜下，使用毛细玻璃管将两微升悬浮液微量注射至脊髓切片中。缓慢操作，确保毛细玻璃管穿过Matrigel并到达脊髓切片内部。

将玻璃管置于脊髓切片内至少30秒，以避免细胞悬浮。操作完成后，将含有脊髓切片的培养皿放入37°C、含5%二氧化碳的培养箱中孵育过夜。次日，在含有标记为3 3 3 4 2的神经发生细胞的脊髓切片周围构建电趋化室，随后施加500毫伏/毫米的电场。

此处神经前体细胞在电场作用下表现出向阴极高度定向的迁移，其中红线和蓝箭头分别表示细胞运动的轨迹和方向。此处展示的是迁移路径的图示。这些是用标记物 hooks 3 3, 3, 4 2 标记的神经前体细胞。

将它们移植到器官型脊髓切片中，并在电场处理的起始点施加。神经前体细胞在电场作用下向阴极定向迁移2.5小时后，电场的极性被反转。电场极性的改变触发了轴突迅速转向新的阴极方向。

这是脊髓切片内移植的神经前体细胞的图像。此处展示了延时记录结束时对脊髓切片内移植神经前体细胞进行三维重建的结果。任务圆满完成。

如果操作得当，该技术可在开发完成后两周内完成。该技术目前为细胞生物学领域的研究人员探索神经前体细胞在二维和三维培养系统中的迁移行为，以及其对电场的响应提供了新的途径。