Name: 电场控制的二维和三维环境中的神经祖细胞定向迁移 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-02-16T12:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 15 s
Description: 了解电场控制神经祖细胞定向迁移的方法，使用定制电趋化室在二维和三维环境中进行延时记录。该技术可追踪细胞向阴极迁移的动态过程，为神经发育研究提供重要工具。

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本工作获得了英国皇家学会大学研究员奖 UF051616 以及欧洲研究理事会青年研究者奖 243261（授予 BS）的资助。MZ 实验室的工作还获得了加州再生医学研究所资助 RB1-01417 的支持。

1. 神经前体细胞的分离
<ol>
 <li>从 E14-16 天的小鼠中解剖出完整的大脑，并置于冰冷的 DMEM/F12 基础培养基中。在解剖显微镜下去除所有脑膜，并将大脑转移至 35 mm 的培养皿中。</li>
 <li>使用精细镊子将大脑机械解离为组织碎片，并将其转移至 15 ml 离心管中，随后以 800 rpm 离心 3 分钟以去除碎片。</li>
 <li>加入含有 bFGF 和 EGF 的 DMEM/F12 培养基，并用 1 ml 移液器吹打混匀。</li>
 <li>将细胞悬液通过细胞滤器过滤，以获得单细胞悬液。</li>
 <li>以 2-5 × 104 个细胞/ml 的密度将细胞接种至培养瓶中，每 3 天进行一次完全换液，并每 6 天传代一次。</li>
 <li>经过至少 5 次传代后，使用胰蛋白酶和 EDTA 将神经球消化为单细胞，并接种于多聚-D-赖氨酸/层粘连蛋白包被的电趋化室（按下方第 2 步所述方法制备）中进行培养。全程使用含 N2 补充剂、bFGF 和 EGF 的生长培养基，以维持神经前体细胞（NPCs）的特性。</li>
</ol>
2. 电趋化室的制备
<ol>
 <li>使用金刚石笔将经高压灭菌的 22 × 22 mm、厚度为 1 号的盖玻片对半切割，制备 22 × 11 mm 的玻璃条。</li>
 <li>将四条垂直竖立的 22 × 11 mm 玻璃条用高真空硅脂粘合，制成内部尺寸为 22 × 10 mm 的自立式玻璃小室。将小室在室温下静置过夜，使其完全干燥并固化。</li>
 <li>次日，用硅脂将两条 22 × 11 mm 玻璃条平行固定于 100 mm 培养皿底部，两玻璃条之间留出 10 mm 间隙。在间隙两端各放置一片 22 × 22 mm 盖玻片并用硅脂从三侧密封，但靠近培养皿中心的一侧不密封，以封闭该区域。</li>
 <li>将第 2.2 步制备的玻璃小室置于盖玻片上，使其内壁形成一个限制性空间，用于在培养皿底部接种细胞。所有接缝处均用硅脂进行防水密封。依次用聚-D-赖氨酸和层粘连蛋白对这一限制性区域进行包被：向小室内加入 1 ml 聚-D-赖氨酸，孵育 5 分钟，使其充分结合至培养皿底部；用无菌 PBS 洗涤小室两次，然后将层粘连蛋白用无菌 PBS 稀释至 20 μg/ml，并用于覆盖培养皿底部。室温下孵育过夜。</li>
 <li>次日，收集细胞并制备含 1 × 10⁴ 个细胞的 1 ml 悬液。移除玻璃小室中的层粘连蛋白，使其完全风干，随后加入 1 ml 细胞悬液。将培养皿置于 37°C 培养箱中孵育至少 4 小时，以促进细胞贴壁。</li>
 <li>待细胞达到足够汇合度后，吸除小室内的全部培养基，小心移去玻璃小室。用硅脂将一片经高压灭菌的 22 × 22 mm 玻璃盖玻片小心地架设在两条 22 × 11 mm 玻璃条之间，覆盖于细胞上方形成“屋顶”。在细胞上方滴加少量培养基，防止干燥。</li>
 <li>在小室两端各构建一个独立的培养基储液区：通过在培养皿表面从一端到另一端跨越小室“屋顶”处形成两条防水硅脂屏障。向小室内加入新鲜培养基，确保培养基从一个储液区流经小室至另一储液区。将培养皿放回培养箱孵育 12 小时，使细胞恢复。</li>
</ol>
3. 向电趋性室施加电场
<ol>
 <li>通过在培养皿盖上钻两个孔来准备一个盖子，每个孔分别位于迁移室的两个储液槽上方。</li>
 <li>将迁移室中的所有培养基更换为含有 25 mM HEPES 缓冲液的培养基，并将培养皿转移至温控成像系统。设置延时和多点成像的实验参数。调整迁移室的位置，使阴极和阳极分别位于左侧和右侧，以确保在显微镜下观察及成像系统记录时，电场（EF）矢量呈水平方向。</li>
 <li>取两个烧杯，装入 Steinberg 溶液（58 mM NaCl，0.67 mM KCl，0.44 mM Ca(NO3)2·4H2O，1.3 mM MgSO4·7H2O 和 4.6 mM Trizma base，pH 7.4）。使用预先制备的玻璃桥（长约 13 cm、直径约 3 mm 的玻璃管，在本生灯火焰中加热弯成 U 形），将每个烧杯分别连接到迁移室的两个储液槽，玻璃桥中填充 2 %（w/v）的 Steinberg-琼脂溶液，并穿过盖子上的孔。将 Ag/AgCl 电极连接至直流电源，并分别插入两个装有 Steinberg 溶液的烧杯中，以完成电路连接。</li>
 <li>将电源的电压调节旋钮调至 0 后开启电源。使用电压表测量电趋性室两端的电压，并逐步调节电压旋钮至符合实验所需的电压值。</li>
 <li>开始延时成像记录。根据需要每小时进行一次培养基更换并重新调整电压。可根据实验需要向储液槽中添加新鲜培养基、药物或化学试剂。进行培养基更换时，可考虑以下两种方案：
 <ol>
 <li>方案一：暂时暂停延时记录，小心地从迁移室上取下玻璃桥，避免扰动盖子，使用灭菌的巴斯德移液管轻柔地将全部培养基更换为新鲜培养基，然后重新插入玻璃桥，再恢复记录。</li>
 <li>方案二：也可使用定制的带四个孔的盖子（两个孔分别位于迁移室的两个储液槽上方）进行培养基更换，其中两个孔用于连接玻璃桥，另两个孔用于更换培养基。方案二可在更换培养基过程中实现连续记录，避免干扰。</li>
 </ol>
 </li>
</ol>
4. 器官型脊髓切片的制备
<ol>
 <li>取2周龄C57 BL/6小鼠的腰段脊髓进行解剖。</li>
 <li>使用McIlwain组织切片机将脊髓切成500 μm厚的切片。</li>
 <li>在解剖显微镜下分离切片，并挑选具有完整矢状面/轴向脊髓结构的切片。</li>
 <li>将切片接种于含有30 μl Matrigel的35 mm培养皿中，尽量将其置于培养皿中央，并在37 °C、5 % CO2的培养箱中孵育至少30分钟，直至Matrigel蛋白自组装形成覆盖脊髓切片表面的薄膜。确保Matrigel完全聚合至关重要；如有必要，可将培养皿在37 °C下再孵育30分钟。</li>
 <li>非常轻柔地加入4–6 ml含有25 mM HEPES缓冲液和15–20%胎牛血清的DMEM/F-12培养基，避免培养基直接冲刷到组织切片上。确保切片未完全浸没于培养基中，使外植体表面充分暴露于空气中。每周更换培养基两次。</li>
</ol>
5. 将Hoechst 33342标记的NPCs注射到脊髓组织切片中
<ol>
 <li>将NPC悬液配制为1 × 106 个细胞/μl。</li>
 <li>将细胞悬液与5 μM Hoechst 33342培养基共同预孵育30分钟。</li>
 <li>在显微镜下，使用毛细玻璃管将2 μl悬液缓慢微量注射至脊髓切片中。确保毛细玻璃管穿过Matrigel（显微镜下呈粉红色部分），并进入脊髓切片内部（显微镜下呈灰色组织），在脊髓切片内保留至少30秒，以避免细胞悬液溢出。将含有脊髓切片的培养皿放入培养箱（37°C，5%CO2）中过夜培养。</li>
 <li>次日，在电趋化室中对含有Hoechst 33342标记NPC的脊髓切片施加500 mV/mm的电场（采用步骤3中所述方法）。</li>
</ol>
6. 代表性结果
当神经前体细胞暴露于一系列生理电场时，它们表现出高度定向的向阴极迁移（图1）。在脊髓组织切片的单细胞水平上也观察到了相同的现象。 离体 模型，一种模拟的三维环境 体内 条件（图2）。
<img alt="使用追踪箭头进行细胞运动分析；图表显示运动路径、质心和数据点。" src="/files/ftp_upload/3453/3453fig1.jpg" data-altupdatedat="1788840098000" data-alt="图 1"> 
图 1. 神经前体细胞在电场中表现出定向迁移。当暴露于电场时，神经前体细胞（NPCs）表现出高度定向的向阴极迁移，红线和蓝箭头分别代表细胞运动的轨迹和方向（A）。B 显示神经前体细胞的迁移路径。标尺：50 μm。
<img alt="细胞迁移延时成像；荧光显微镜图像；趋化实验分析。" src="/files/ftp_upload/3453/3453fig2.jpg" data-altupdatedat="1788840098000" data-alt="图 2"> 
图 2. 移植的神经前体细胞在脊髓组织切片中朝向阴极定向迁移。（A）用 Hoechst 33342 标记的神经前体细胞被移植至脊髓组织切片中电场处理的起始位置。神经前体细胞在 2.5 小时内朝阴极方向定向迁移，随后电场极性发生反转（B）。改变电场极性后，细胞的电趋性迅速转向新的阴极（C）。（D）延时记录结束时，脊髓切片内移植的神经前体细胞图像。（E）脊髓切片内移植神经前体细胞的三维重建图像。三维扫描切片厚度为 300 μm，从切片中部开始至底部结束。虚线表示同一群移植细胞在电场处理开始、极性反转及结束时的相对位置（分别为 A–C）。箭头指示同一群 Hoechst 33342 标记的神经前体细胞。比例尺：50 μm。

<ol><li>Huttenlocher, A., Horwitz, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wound+healing+with+electric+potential%5BTitle%5D)+AND+%22N.+Engl.+J.+Med%22%5BJournal%5D)">Wound healing with electric potential.</a> N. Engl. J. Med. 356, 303-303 (2007).</li>
<li>McCaig, C. D., Rajnicek, A. M., Song, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlling+cell+behavior+electrically%3A+current+views+and+future+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Controlling cell behavior electrically: current views and future potential.</a> Physiol. Rev. 85, 943-943 (2005).</li>
<li>Borgens, R. B., Jaffe, L. F., Cohen, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large+and+persistent+electrical+currents+enter+the+transected+lamprey+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Large and persistent electrical currents enter the transected lamprey spinal cord.</a> PNAS. 77, 1209-1209 (1980).</li>
<li>Shapiro, S., Borgens, R., Pascuzzi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oscillating+field+stimulation+for+complete+spinal+cord+injury+in+humans%3A+a+phase+1+trial%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosurg.+Spine%22%5BJournal%5D)">Oscillating field stimulation for complete spinal cord injury in humans: a phase 1 trial.</a> J. Neurosurg. Spine. 2, 3-3 (2005).</li>
<li>Zhao, M., Song, B., Pu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrical+signals+control+wound+healing+through+phosphatidylinositol-3-OH+kinase-gamma+and+PTEN%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Electrical signals control wound healing through phosphatidylinositol-3-OH kinase-gamma and PTEN.</a> Nature. 442, 457-457 (2006).</li>
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<li>Li, L., El-Hayek, Y. H., Liu, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct-current+electrical+field+guides+neuronal+stem%2Fprogenitor+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Direct-current electrical field guides neuronal stem/progenitor cell migration.</a> Stem Cells. 26, 2193-2193 (2008).</li>
<li>Meng, X., Arocena, M., Penninger, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PI3K+mediated+electrotaxis+of+embryonic+and+adult+neural+progenitor+cells+in+the+presence+of+growth+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">PI3K mediated electrotaxis of embryonic and adult neural progenitor cells in the presence of growth factors.</a> Exp. Neurol. 227, 210-210 (2011).</li>
<li>Bonnici, B., Kapfhammer, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone+marrow+stromal+cells+promote+neurite+extension+in+organotypic+spinal+cord+slice%3A+significance+for+cell+transplantation+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Neurorehabil.+Neural+Repair%22%5BJournal%5D)">Bone marrow stromal cells promote neurite extension in organotypic spinal cord slice: significance for cell transplantation therapy.</a> Neurorehabil. Neural Repair. 22, 447-447 (2008).</li>
<li>Shichinohe, H., Kuroda, S., Tsuji, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone+marrow+stromal+cells+promote+neurite+extension+in+organotypic+spinal+cord+slice%3A+significance+for+cell+transplantation+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Neurorehabil.+Neural+Repair%22%5BJournal%5D)">Bone marrow stromal cells promote neurite extension in organotypic spinal cord slice: significance for cell transplantation therapy.</a> Neurorehabil. Neural Repair. 22, 447-447 (2008).</li>
<li>Song, B., Gu, Y., Pu, j <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+direct+current+electric+fields+to+cells+and+tissues+in+vitro+and+modulation+of+wound+electric+field+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocol%22%5BJournal%5D)">Application of direct current electric fields to cells and tissues in vitro and modulation of wound electric field in vivo.</a> Nature Protocol. 2, 1479-1479 (2007).</li>
</ol>

我们无任何利益冲突需要披露。

我们所采用的实验方案基于以往的研究5,11. 通过这些方法，可在使用琼脂桥、Steinberg 溶液和 Ag/AgCl 电极向培养于定制设计、尺寸标准化且精确的电趋性培养 chamber 中的细胞或组织切片施加电场时，维持稳定的培养环境和电流条件。chamber 的深度可调节，以适应不同厚度的样品11，并且在细胞实验中，可根据所需细胞数量调整腔室大小（例如，蛋白质印迹分析需要大量细胞）。我们对这些方法进行了改进和优化，以实现对技术上难以追踪的细胞进行操作 体内 在单细胞水平上使用延时记录。以往关于细胞对电场（EFs）反应的大多数研究都是在二维（2D）环境中进行的。 体内 在单细胞水平上研究神经前体细胞（NPCs）的电趋化反应将为证实其任何生理相关性提供关键证据。然而，利用现有技术实现这一目标在技术上非常困难，尤其是在尝试获取细胞迁移实时记录时。我们已进一步采取措施建立一种 离体 类器官型脊髓切片培养模型，可高度模拟 体内 环境，表明细胞在三维环境中仍具有电趋向性反应，如图2所示。该方法也可适用于观察电场对类器官三维环境中多...

<table><tbody><tr><td>重组人碱性成纤维细胞生长因子</td><td>Invitrogen</td><td>PHG0026</td><td>20 ng/mL</td></tr><tr><td>EGF 重组人</td><td>Invitrogen</td><td>PHG0311</td><td>20 ng/mL</td></tr><tr><td>N2补充剂（100倍浓缩液）</td><td>Invitrogen</td><td>02048</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12 培养基（高糖）</td><td>Invitrogen</td><td>31330-095</td><td></td></tr><tr><td>聚-D-赖氨酸</td><td>EMD Millipore</td><td>A-003-E</td><td></td></tr><tr><td>天然小鼠层粘连蛋白</td><td>Invitrogen</td><td>23017-015</td><td></td></tr><tr><td>生长因子减少的基底膜基质（Matrigel）</td><td>BD生物科学</td><td>354230</td><td></td></tr><tr><td>HEPES缓冲液</td><td>GIBCO，隶属于 Life Technologies</td><td>15630</td><td></td></tr><tr><td>McIlwain组织切碎机</td><td>米克尔实验室工程有限公司</td><td>TC752-PD</td><td></td></tr><tr><td>道康宁高真空硅脂</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z273554</td><td></td></tr></tbody></table>

电场控制下神经前体细胞在二维和三维环境中的定向迁移

Electric Field-controlled Directed Migration of Neural Progenitor Cells in 2D and 3D Environments

内源性电场（EFs）天然存在 体内 在组织/器官发育与再生过程中发挥关键作用，包括中枢神经系统的发育与再生1,2这些内源性电场由细胞对离子转运的调控以及细胞和组织的电阻共同产生。已有报道称，施加外源性电场治疗可促进动物和人类脊髓损伤的功能性修复。3,4特别是，已证明电场导向的细胞迁移存在于多种细胞类型中5,6，包括神经前体细胞（NPCs）7,8直流电场（DC EFs）的应用在大多数实验室中并非一种常见的技术。我们此前已描述过将直流电场应用于细胞和组织培养的详细实验方案。5,11在此，我们提供一段视频演示，展示基于计算电场强度的标准方法，用于建立神经前体细胞（NPCs）的二维（2D）和三维（3D）培养环境，并在2D单细胞生长条件以及3D脊髓组织切片环境中研究细胞对电场刺激的响应。脊髓组织切片是研究NPC的理想受体组织 离体 行为，移植后，因为这些培养物中的细胞构筑学组织结构得到了良好保存9,10。此外，这一 离体 该模型还能够对技术上难以实现的细胞追踪过程进行模拟 体内 在单细胞水平上使用延时成像记录。不仅需要在二维环境中评估细胞行为，还必须在模拟真实组织结构的三维类器官环境中进行评估 体内 环境。该系统能够在组织或器官培养中，利用基于盖玻片的培养皿实现高分辨率成像，并对单个细胞迁移进行三维追踪 体外 和 离体 在进入下一步之前，可作为中间步骤 体内 范式

本方案展示了在定制设计的电趋化室中建立二维和三维环境的方法，可用于追踪细胞 体内/离体 利用单细胞水平的时间延时记录，以研究趋电性（galvanotaxis/electrotaxis）及其他细胞对直流电场（DC EFs）的响应。

内源性电场（EFs）在体内自然存在，在组织/器官发育和再生过程中发挥着关键作用，包括……

本实验的总体目标是记录施加的电场对二维培养和三维离体模型中神经前体细胞迁移的影响。首先通过体外分离并扩增神经前体细胞来实现该目标，第二步是制备神经前体细胞的单细胞悬液。接下来，对于二维培养的制备，将神经前体细胞接种于定制设计的电趋性室中。或者，对于三维离体模型的制备，将神经前体细胞用标记物3, 3, 3, 4, 2进行标记，并注射到脊髓切片类器官模型中。最终，在电趋性室中施加电场，并进行延时成像记录，以显示在二维和三维环境中，前体细胞均向电场的阴极迁移。该技术的主要优势在于，它提供了一种新颖的方法，可用于在将单个细胞移植到三维类器官模型后，实时追踪电场诱导的细胞迁移过程，该模型高度模拟了天然环境。该方法不仅能够深入揭示电技术在脊髓切片中移植的神经前体细胞迁移行为，还可应用于其他类似的小型脑切片模型系统。开始本实验前，通过将经高压灭菌处理的 22 × 22 毫米玻璃片分割成 22 × 11 毫米的条状，制备所需玻璃条。使用金刚石笔将一号厚度的盖玻片对半切割。接下来，用高真空硅脂将四条竖直立起的 22 × 11 毫米玻璃条粘合在一起，制成一个内径为 22 × 10 毫米的独立玻璃小室，置于室温下过夜，使其完全干燥并固化。次日，用硅脂将两条 22 × 11 毫米的玻璃条平行固定于 100 毫米培养皿底部，两条玻璃条之间留出 10 毫米的间隙。然后用硅脂将22 mm × 22 mm的盖玻片密封在这些条带之间。将玻璃小室放置在盖玻片上，使其内壁形成一个用于接种细胞的封闭空间。用硅脂对所有接缝处进行防水密封。按照随附文稿中的描述，依次用多聚赖氨酸和层粘连蛋白包被该限定区域。在此步骤中，取 E14 至 E16 小鼠的脑组织，并将其置于冷的 D-M-E-M-F12 基础培养基中。接着，在解剖显微镜下去除脑膜。随后，将脑组织转移至35毫米的培养皿中。使用精细镊子将脑组织分离成组织碎片。然后将其转移至15毫升离心管中。将样品在800 RPM条件下离心三分钟，以去除D碎片。接下来，向样品中加入含有BFDF和DGF的A-D-M-E-M-F 12。使用1毫升移液器充分混匀。然后使用细胞筛获取单细胞悬液。将细胞以每毫升20,000至50,000个细胞的密度接种到培养瓶中。每三天进行一次完全换液，即以1,300 RPM离心5分钟收集细胞。弃去上清液，将传代细胞悬浮于新鲜培养基中，并在至少传代五次后，每六天将细胞重新接种至培养瓶中。将神经球转移至15毫升离心管中，在1,500 RPM条件下离心五分钟。弃去上清液。用EDTA重悬沉淀，重复三次，以获得单细胞悬液。在进行细胞计数前，准备含有10,000个细胞的1毫升悬液。接下来，去除玻璃小孔中的层粘连蛋白，并使其完全干燥。加入一毫升细胞悬液进行替换。随后，将培养皿置于37摄氏度的培养箱中孵育至少四小时，以促进细胞贴壁。待细胞达到足够的汇合度后，移除腔室中的培养基。小心取下玻璃。然后用硅脂将一块 22 × 22 毫米的灭菌玻璃盖玻片小心地固定在两片 22 × 11 毫米的玻璃条之间，形成覆盖细胞的顶盖。注意用几滴培养基覆盖细胞，以防止干燥。然后在培养皿两端的腔室末端分别形成一个独立的培养基储液区，方法是创建两条从培养皿一端延伸至另一端的防水硅脂屏障。用新鲜培养基填充腔室，确保培养基从一个储液区流至另一个储液区。随后将培养皿放回培养箱中孵育12小时，以使细胞恢复。下一步，通过在迁移室的每个储液区上方各钻一个孔，制备用于覆盖培养皿的盖子。然后将迁移室中的培养基更换为含有25毫摩尔HEPES缓冲液的培养基。之后，将培养皿转移至温度可控的成像系统中。设置延时和多点记录的实验参数。调整腔室位置，使阴极和阳极分别位于左侧和右侧，以确保在显微镜下观察及成像系统记录时，电场矢量呈水平方向。接下来，填充两个烧杯。用 Steinberg 溶液。使用预先准备好的、内含 2% Steinberg 琼脂溶液的玻璃桥，将每个培养基储液器分别连接到一个独立的烧杯。然后将连接至直流电源的银电极放入 Steinberg 溶液中。在每个烧杯中，将电源上的电压调节旋钮设为零，然后打开电源。使用电压表测量趋电性小室两端的电压，同时逐渐调高电压旋钮。然后根据实验要求调节电压至合适值。此后，开始进行延时成像记录。根据需要更换培养基并重新调整电压。每隔一小时，可根据需要向储液槽中添加新鲜培养基、药物或化学试剂。利用在培养皿盖上额外钻出的孔，每个孔位于一个培养基储液槽上方。在此步骤中，解剖两周龄小鼠的腰段脊髓。然后在解剖显微镜下，使用麦切尔-韦恩组织切片器将脊髓切成500微米厚的切片。分离切片，并挑选出具有完整矢状轴向脊髓结构的切片。随后将切片置于一个含有30 µL MA凝胶的100 mm培养皿中，尽可能放置在中心位置。将它们置于37摄氏度、5%二氧化碳培养箱中孵育至少30分钟。为了使基质胶蛋白自组装形成覆盖脊髓切片表面的薄膜，确保基质胶完全聚合至关重要。如有必要，将培养皿在37摄氏度下再孵育30分钟，然后加入4至6毫升含25毫摩尔HEPES缓冲液和15%至20%胎牛血清的D-M-E-M-F12培养基。非常轻柔地操作，避免培养基直接流到切片上，确保切片未完全浸没在培养基中，使茄子的表面充分暴露于空气中。每周更换两次培养基。现在将神经前体细胞悬液在含有五微摩尔钩素的培养基中进行培养。3、3、3、4、2，持续30分钟。在显微镜下，使用毛细玻璃管将两微升悬浮液微量注射至脊髓切片中。缓慢操作，确保毛细玻璃管穿过Matrigel并到达脊髓切片内部。将玻璃管置于脊髓切片内至少30秒，以避免细胞悬浮。操作完成后，将含有脊髓切片的培养皿放入37°C、含5%二氧化碳的培养箱中孵育过夜。次日，在含有标记为3 3 3 4 2的神经发生细胞的脊髓切片周围构建电趋化室，随后施加500毫伏/毫米的电场。此处神经前体细胞在电场作用下表现出向阴极高度定向的迁移，其中红线和蓝箭头分别表示细胞运动的轨迹和方向。此处展示的是迁移路径的图示。这些是用标记物 hooks 3 3, 3, 4 2 标记的神经前体细胞。将它们移植到器官型脊髓切片中，并在电场处理的起始点施加。神经前体细胞在电场作用下向阴极定向迁移2.5小时后，电场的极性被反转。电场极性的改变触发了轴突迅速转向新的阴极方向。这是脊髓切片内移植的神经前体细胞的图像。此处展示了延时记录结束时对脊髓切片内移植神经前体细胞进行三维重建的结果。任务圆满完成。如果操作得当，该技术可在开发完成后两周内完成。该技术目前为细胞生物学领域的研究人员探索神经前体细胞在二维和三维培养系统中的迁移行为，以及其对电场的响应提供了新的途径。

electric-field-controlled-directed-migration-neural-progenitor-cells

Research

科研

JoVE Journal

Bioengineering

生物工程

电场控制的二维和三维环境中的神经祖细胞定向迁移

我们利用一种新型的基于琼脂糖凝胶的微流控装置，证明了表皮生长因子受体（EGFR）的过表达可增强神经干细胞（NSCs）的迁移能力。该技术可轻松适用于其他哺乳动物细胞系统，特别是在细胞来源稀少（如人神经干细胞）且实验周期至关重要的情况下。...

利用基于琼脂糖凝胶的微流控装置评估神经干细胞迁移能力

在本实验方案中，我们演示了如何构建定制腔室，以施加直流电场，从而实现对成年脑源性神经前体细胞在电趋化过程中细胞体迁移的延时成像观察。...

一种用于分析神经前体细胞在体外施加直流电场中迁移动力学的电趋性实验方法

本视频展示了利用包被细胞外基质的微流控芯片，通过电刺激诱导神经干细胞和祖细胞（NPCs）分化的实验方法。在接种并黏附于包被区域后，NPCs开始生长，施加直流电可触发其分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞。...

电刺激诱导的神经干细胞与祖细胞分化

一种用于小鼠肠神经前体细胞的定量细胞迁移检测方法

神经母细胞迁移是出生后神经发生过程中的关键步骤。本方案可用于研究候选调控因子在神经母细胞迁移中的作用，方法是利用DNA/短发夹RNA（shRNA）核转染技术，结合从啮齿类动物出生后前脑迁移流中分离的神经母细胞进行三维迁移实验。...

啮齿类动物成神经细胞的核转染以研究成神经细胞迁移 体外

我们介绍一种在定制的电趋性室中对迁移中的永生化前列腺细胞施加生理电场的方法。利用该方法，我们证明了两株非致瘤性前列腺细胞在电场中表现出不同程度的迁移方向性。...

利用定制设计的电趋化室研究前列腺细胞的定向迁移

上皮-间质转化（EMT）使癌症细胞获得侵袭能力。为研究EMT，可采用基于神经干细胞（NSC）的方法 体外...

一种适用于药物发现的无酶无血清神经干细胞培养模型用于EMT研究

我们展示了在一种新型生物材料包被中，自组装形成的三维结构，其中星形胶质细胞的胞体及其突起沿纵向整齐排列成束。这些工程化的"活体支架"具有微米级直径，却可延伸至厘米级长度，可作为研究神经发育机制的实验平台，或通过引导神经元迁移和/或轴突导向来促进神经再生。...

三维组织工程化定向星形胶质细胞网络以模拟发育机制并促进神经系统再生

本研究中，我们介绍了一种仅通过微流控系统中直流脉冲刺激诱导神经干细胞和前体细胞（NPCs）分化的实验方案。...

微流控装置中电场诱导的神经前体细胞分化

在大脑皮层发育过程中，神经元和胶质细胞起源于衬于脑室壁的室管膜区，并向脑表面迁移。许多基因参与了这一过程。本方案介绍了对迁移中的神经元和胶质前体细胞进行活细胞延时成像的技术。...

胚胎小鼠脑切片中迁移神经元和胶质前体细胞的延时成像

了解电场控制神经祖细胞定向迁移的方法，使用定制电趋化室在二维和三维环境中进行延时记录。该技术可追踪细胞向阴极迁移的动态过程，为神经发育研究提供重要工具。

电场控制下神经前体细胞在二维和三维环境中的定向迁移

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