采用快速扫描循环伏安法检测纹状体脑切片中的突触前多巴胺动态变化

本实验的总体目标是展示一种用于脑片快速扫描循环伏安遥测的通用方案。该方案首先对脑组织进行冠状切片前处理，然后将电极放置于特定的目标脑区。

下一步是通过电极以三角波形式施加电压，以检测多巴胺。最后，将感兴趣的药理学试剂施加于脑切片，并观察其对突触前多巴胺动态的影响。最终，该方案可揭示突触前多巴胺动态的变化，例如通过快速扫描循环伏安法检测到的刺激诱导多巴胺释放及多巴胺摄取速率的变化。

尽管该方法可用于研究突触前多巴胺动态，但也同样适用于其他系统，包括动物和神经递质，例如大鼠和果蝇，以及血清素和去甲肾上腺素。演示该实验操作的人员为 Francis Mena、MEA Khalid 和 Erin oo，他们是我实验室的研究生。根据随附的手稿开始此操作：配制三种类型的人工脑脊液溶液，即用于伏安法记录的蔗糖型 A-CSF 溶液，以及用于电极校准的改良型 A-CSF 溶液。接下来，将 10 毫升蔗糖 A-CSF 溶液转移至一个小烧杯中，并将其放入冰桶内。然后将瞬干胶（Loctite）也置于冰桶中。

随后，用酒精棉片擦拭剃刀刀片以及解剖所需工具（如镊子、刮匙和剪刀），进行准备。然后通过断头法处死一只小鼠，并迅速取出其大脑。将大脑置于含有冰冻蔗糖人工脑脊液（A CSF）的烧杯中，放置约10分钟。

在此期间，准备将VIBRAM进行切片。在标本槽中放入一些碎冰，然后将标本盒放入Vibram中并牢固固定。

在样本室周围添加更多冰块以填满空隙，并确保冰块不会进入室内。随后，将清洁的刀片放入刀架中。然后用冰冷的蔗糖人工脑脊液填充样本室。

随后，将一些冰冷的蔗糖A型脑脊液倒在倒置培养皿中的一张纸巾上。用镊子将 freshly dissected 小鼠脑组织转移至其上。然后用刀片沿中侧轴切开，去除小脑。

这将形成一个平整的基底，可将其固定在Vibram平台上。接下来，在样本台上滴加一滴Loctite胶水。立即将已制备脑组织的平整端固定在台面上，并尽可能保持其直立状态。

然后将载物台放入样本室，并拧紧螺丝。确保脑组织完全浸没在样本室内的蔗糖人工脑脊液中。接着，使用控制器调节载物台，使剃刀刀片与脑组织顶部对齐。

通过将振动频率和速度设置为低档，可获得振动切片机的最佳参数。接着，将切片厚度设为400微米。最初的几片切片通常不包含纹状体。

重复切片，直至获得包含纹状体的切片。一旦到达纹状体AAL区域，使用画笔将切片提起并置于含有充氧室温人工脑脊液（CSF）的烧杯中。

通常，可获得包含尾状壳核复合体（caudate putamen）和伏隔核（nucleus accumbens）的三到四个脑片。将脑片置于持续通入95% O₂和5% CO₂混合气体的人工脑脊液（A CSF）中，在室温下孵育至少一小时，使其充分适应环境，然后再进行实验。开始该操作时，将管路连接至浸没式记录室。

然后以每分钟1毫升的流速泵入含氧的室温人工脑脊液（A CSF）。当人工脑脊液充满自制的脑片孵育槽后，将温度控制器设定为32摄氏度。使用针头注射器去除金属网下方的任何气泡。

使用注射器在流出管路中产生负压，以启动液体流动并控制缓冲液溢出。将一片Kim擦拭纸放在切片固定器的边缘，作为吸水灯芯。然后将一片脑片转移至记录室中的切片固定器内，记录室持续灌流室温的含氧人工脑脊液（ACSF）。

将银/氯化银参比电极浸入切片孵育槽中，并用鳄鱼夹将其连接到前置放大器。将碳纤维微电极固定在显微操作器上，并用鳄鱼夹将其连接到前置放大器。接着，将钨刺激电极和碳纤维微电极 lowered 至脑片表面。

刺激电极将用于向脑片传递单次脉冲或多次电刺激脉冲，以诱发神经递质释放，从而通过快速扫描循环伏安法（FSCV）测量电刺激诱发的多巴胺信号。对电极施加三角波形电压，将碳纤维微电极的电位维持在负0.4伏，然后将其 ramp 至正向极限1.2伏。

然后以每秒400伏的扫描速率将其电位重新降至负0.4伏。每5分钟刺激一次脑片，并在至少三次稳定的电刺激多巴胺释放记录（定义为峰高差异小于10%）之后，每次持续15秒，对所引起的多巴胺FLX进行体积测量。

以每分钟1毫升的流速灌注含有目标药理学试剂的脑脊液30分钟，以获得与基线记录相似的最大效应。在药理学灌注期间，每5分钟进行一次电刺激，以诱导多巴胺释放。图A为使用FSCV技术在尾状壳核中单脉冲刺激后，电刺激诱导的多巴胺释放测量示例。

图B显示了一个三维伪彩色图，该图整合了电流-时间曲线和循环伏安图（cyclic voltammogram）的双重信息。类似地，图A和图C分别展示了在伏隔核核心部和壳部通过单次电刺激脉冲诱发的多巴胺释放，而伏隔核核心部和壳部的三维伪彩色图则分别显示在图B和图D中。此处展示的是脑片经药物处理30分钟后，再施加单脉冲刺激以诱发尾状壳核中多巴胺释放的代表性记录轨迹。

实验中使用的试剂包括喹啉、甲基苯丙胺和脑源性神经营养因子。观看本视频后，您应能够充分理解如何制备小鼠冠状脑切片，以利用快速扫描循环伏安法获取并测量突触前多巴胺动态变化。