检测内源NADH的荧光双光子成像的小鼠大脑皮层Microregional缺氧

该程序的总体目标是在体内直接可视化小鼠皮层中的微区域组织缺氧。这是通过首先在麻醉小鼠中准备一个开放的颅骨窗来实现的。接下来静脉注射荧光染料以标记脑血管。

最后，在进行内源性 NADH 荧光和荧光标记的皮质微血管系统的光子成像的同时进行。最终，通过可视化还原形式的烟酰胺（腺嘌呤二核苷酸）的存在，可以获得显示脑实质微区域功能性缺氧的结果。与现有方法（如 Clark 型电极）相比，该技术的主要优点是，它在大视场上提供了高的特殊分辨率，并且侵入性较小。

该方法可以在具有两个荧光通道的标准应用双光系统上进行。大家好，我是罗切斯特大学微生物学和免疫学教授兼主席史蒂夫·赫斯特 （Steve Hurst），演示今天的手术将是 Anita 在 Kishka 实验室的儿子，以及我实验室的研究助理教授 Oxana Paulka，开创 NADH 成像技术的 Kshka 博士今天不能在这里，因为他最近搬到了德国。用必要的器械准备手术部位后，这些器械已经用 70% 乙醇高压灭菌或消毒，并且已经用 5% isof 氟麻醉了鼠标，将其放在加热垫上并戴上口罩，以在空气中输送 1.3 至 1.5% isof 氟。

通过捏尾来检查麻醉水平。接下来，插入直肠探针并在整个过程中连续测量动物的体温。将人工泪液凝胶涂抹在老鼠的眼睛上，以防止它们干燥。

然后从头上去除毛发，双腿在大腿上涂抹脱毛剂两分钟以去除剩余的毛发，大腿将用于血氧测定。最后，使用 10% 聚维酮碘溶液和 70% 乙醇对头皮进行消毒。要制作一个从 5 毫米开始的颅窗，用剪刀娇生惯养地贴在头骨上。

在头皮上切开一个，向前推进一厘米。将皮肤向两侧移动，露出头骨 去除头骨顶部的膜。应用 10% 三氯化铁溶液。

擦去多余的溶液，并以 45 度角刮掉膜。第五，镊子 使用解剖显微镜，确定感兴趣的区域。在头板窗口的边缘涂上一层薄薄的快速胶水。

将头板放置在使感兴趣区域暴露在窗口中的方式，并在头板上施加轻微的压力。涂抹少量牙科粘固剂以快速聚合胶水。在胶水聚合时保持 10 秒钟。

窗户边缘涂抹少量快速胶水，以密封头板和头骨。然后将头板拧到解剖镜下的动物支架上。使用 6， 000 RPM 的微扭矩两组钻头和 IRF 0 0 5 钻头。

去除颅骨和头板上的所有多余胶水。然后将钻头设置为 1000 RPM，并在头板窗口内画一个直径约为 5 毫米的圆圈，开始在头骨上钻孔。使用轻柔的扫动动作，就像您正在用非常柔软的铅笔画画一样。

每 20 到 30 秒停止钻孔，并使用压缩空气去除骨尘。随着钻孔的进行，在中心的完整头骨周围形成一个洞穴。注意不要戳穿薄薄的头骨，但要确保这个洞穴的厚度均匀。

此外，在大血管周围要格外小心。它们不应该妥协，如果可能的话，甚至不要触摸 用镊子的一个叉子，掀开窗户中央的骨头，然后在窗户上滴一滴人工脑脊髓液。使用 Kim 湿巾的一角，以 45 度角轻轻擦去人工脑脊髓液。

第五名，镊子。沿着窗户边缘找到受损的硬脑膜区域，然后将其抬起以将其移除。如果发生出血，滴一滴人工脑脊液，等待 2 到 3 分钟，让轻微出血停止。

接下来，准备 10 毫升溶于人工脑脊髓液中的 0.07% 低熔点 aero。将融化的 aeros 加热至体温。擦去大脑表面多余的人工脑脊髓液。

将 aeros 倒入窗户并用玻璃滑梯盖住。然后轻轻按压玻璃，使玻璃和头板接触，并等待 10 到 20 秒，直到空气动力学变硬。使用镊子和软纸巾，去除玻璃盖上多余的空气动力学。

在玻璃周围涂上少量快速胶，使其粘在头板上。然后涂抹少量牙科粘固剂，使胶水凝固，注入股静脉。将动物部分翻转过来，露出左大腿内侧。

使用胶带固定动物。在这个位置，涂抹消毒磨砂膏，然后在皮肤上涂抹 100% 乙醇。接下来，沿着大腿内侧从膝盖到耻骨合成处做一个切口。

如有必要，通过钝性解剖分离软组织。在 1 毫升注射器中加入 130 微升德克萨斯红。连接一根新的 30 号针头，小心地将其弯曲成 30 度角，同时保持斜面向上。

在解剖显微镜下用 Texas Red 溶液填充针头，将针头插入股静脉并注射 100 微升 Texas Red。取下针头，用纱布轻轻按压静脉以止血。使用四缝合线闭合皮肤，以持续监测血氧饱和度。

将血氧仪探头放在之前去除毛发的右大腿上。要开始成像，请将手术准备的小鼠转移到显微镜载物台。使用四倍放大倍率的明场照明拍摄颅窗部位的初始照片，用作参考图，以更高的放大倍率对光子茴香进行配准。

使用 10 倍放大倍率放大感兴趣区域。在皮质层中选择一个感兴趣的区域。一两个开始记录时间序列。

我们建议平均使用 3 到 5 帧来提高图像质量。接下来，通过向动物呼吸的空气中添加 50% 氮来诱导低氧血症。这将使氧气水平达到 10%通过监测血氧仪数据来验证低氧血症。

继续记录低氧血症的时间序列约 30 秒，并在氧气水平恢复后。通过检测、测量和量化血管周围缺氧和含氧组织圆柱体的面积，收集数据以计算氧气分布。为了确定呱呱组织圆柱体半径 R，测量血管中心与检测到高 NADH 荧光的边界之间的距离。

有关数据处理方法，请参阅书面协议。该图显示了短暂性低氧血症期间录制的视频中并发的 NADH an 地理图像，吸入的氧气浓度在 3 分钟内从 21% 降低到 10%。这种实验诱导的低氧血症水平足以在大脑皮层中诱导严重缺氧。

缺氧导致 NADH 荧光增加，最初在距离动脉血供最远的区域显示为绿色。请注意，尖锐的 NADH 组织边界，它代表从皮质微循环扩散的可观察组织边界，以红色显示。这是红色的荧光标记的皮层微血管的并发图像，绿色是来自皮层灰质的内在NADH荧光，NADH荧光强度分布是二进制的。

有些区域具有均匀的低 NADH 荧光，有些区域具有均匀的高 NADH 荧光。黄线表示 NADH 荧光低和高区域之间的组织边界。这些组织边界与附近的微血管表现出空间关系。

这种关系是由氧气从微血管扩散到组织中的决定的。在某些情况下，这些组织边界的圆柱形性质或 CRO 组织圆柱体可以直接识别，如蓝线所示。在这里，组织边界呈圆形，带有同心中央血管一旦掌握。

如果执行得当，这项技术可以在 1.5 小时内完成。在尝试此程序时，请务必记住将盖玻片粘在金属板上，以防止皮质表面因水肿而垂直移动。在此程序之后，可以进行其他分析，例如功能性充血的测量，以解决其他问题，例如组织缺氧和脑血管耦合之间的关系。

观看此视频后，您应该对如何可视化小鼠皮层中的微区域组织缺氧有很好的了解。