γHV68感染小鼠的测量
November 22nd, 2011
γ-疱疹病毒（γ- HVS）在其主机建立终身续保。感染小鼠γ- HV68提供了一种基因听话在体内模型为表征的生命周期/γHVs发病机制。这个协议描述γHV68感染的检测和定量菌斑形成，传染病中心，qPCR实验感染后的急性和潜伏阶段。
在本视频中，通过斑块和感染中心测定评估小鼠鼻内感染后的急性和潜伏性疱疹病毒感染。首先模拟生理暴露，小鼠通过神经元 γ 疱疹病毒的鼻内给药感染。68,5 至 7 天后，收集肺组织并匀浆。
然后进行噬菌斑测定以确定急性病毒载量 为了确定潜在的病毒载量，从小鼠中收获脾脏。感染后 12 至 14 天，产生感染的 SPOC 象的单细胞悬液，并进行感染中心测定。这些测定的结果揭示了体内病毒复制和感染性的时空概况。
因此，与现有方法（如使用组织培养系统研究病毒感染）相比，该技术的主要优点是它利用小鼠的海洋 γ 疱疹病毒感染来对 γ 疱疹病毒的生命周期和/或发病机制进行体内表征。通过用 γ 疱疹病毒 68 或 γ HV 68 感染 6 周龄小鼠来开始此方案，在麻醉后 5 至 10 分钟进行脚趾捏。确保小鼠完全麻醉很重要。
如果他们不是鼻内，病毒的施用会导致他们打喷嚏，并且不会接受正确的剂量。接下来，将移液器的尖端放在小鼠的鼻子开口处，逐滴缓慢输送 15 微升含有 500 至 2， 500 个噬菌斑形成单位的 γ HV 68。鼠标应该吸入滴剂，气泡不应该形成重复的另一个鼻孔。
将鼠标放在加热垫上，让它恢复 10 到 15 分钟。一旦老鼠恢复意识，就可以将其送回笼子，以确定急性感染肺部的病毒滴度。鼻内感染后 5 至 7 天进行斑块测定。
将水貂冷 PBS 短暂搅拌，然后取出 PBS 并再次重复洗涤，以洗涤从处死小鼠中收获的肺。要去除任何剩余的血细胞，请将其中一个肺放入含有 1 毫升冰冷完全 DMEM 的 5 毫升圆底管中。将试管放在冰上，然后将肺的另一侧放入另一根试管中，并将其浸入干冰和乙醇的浆液中。
快速冻结它。将试管储存在零下 80 摄氏度，以便通过 QPCR 检查肺部的病毒 DNA 载量。接下来，取放置在冰上的组织，以最大速度匀浆一秒钟。
然后将试管放在干冰上 10 分钟，冷冻并解冻样品。然后将其转移到 37 摄氏度的水浴中两分钟。用 70% 乙醇和 PBS 洗涤均质器。
然后重复均质化过程，并用下一个样品冻融。清洁每个样品之间的均质器。将匀浆组织以 3000 RPM 的速度离心 4 摄氏度 10 分钟。
将上清液转移到新的微量离心管中。制备连续稀释液。将 S 上清液管标记为 10 至零。
然后将另外 8 个含有 540 微升普通 DMEM 的 1.5 毫升微量离心管标记为 10 到负 10 到负 8。将 60 微升未稀释的匀浆从标记为 10 的试管转移到标记为 10 的试管中，以减一帽涡旋。然后取出 60 微升并将其转移到标有 10 到负 2 的试管中。
继续连续稀释，直到 10 到负 8。接下来，从培养箱中取出前一天制备的 vari 细胞单层。细胞应分布均匀，细胞密度应在噬菌斑测定当天达到 30% 至 40%。
标记板以进行检测。每次稀释一式两份，然后将培养基吸出至 12 个孔中的每一个孔中。每孔添加 200 微升连续稀释的匀浆，顺序从 10 到负，从 8 到 10 到 0。
在孵育过程中，将 vari 细胞置于 37 摄氏度、5% 二氧化碳的加湿培养箱中 1 小时，每 15 分钟一次，轻轻膨胀板以使病毒在孵育后均匀分布在单层细胞上，吸出接种物并用每孔 2 毫升的覆盖培养基代替它们。一周后，将板放回培养箱中一周。吸出覆盖培养基，并用 2 毫升固定染色培养基替换它进行噬菌斑测定。
将板在室温下孵育至少 1 小时。倒出固定的染色介质，用水洗涤两次。然后，当板子干燥时，让板子风干，盖上盖子。
计算每次稀释的空斑数量，以尽量减少误差。排除任何斑块少于 10 个或多于 100 个斑块的孔。使用以下公式更紧密地计算病毒，其中每毫升噬菌斑加热单位的滴度是通过将每孔的噬菌斑数量除以每孔接种物的体积，然后乘以稀释因子来确定潜在的病毒载量。
在鼻内感染后 12 至 14 天进行感染中心检测。首先将从牺牲小鼠收获的脾脏汇集在一毫升冷藏 DMEM 中，加入 10 毫升含 2% FBS 的 DMEM 中，放入 10 厘米板中，然后将脾脏转移到板中。接下来，使用冰冷的介质润湿。
两张磨砂端玻璃显微镜载玻片。将脾脏放在一张载玻片的磨砂面上 通过将两张载玻片按压和摩擦在一起，直到所有红色团块被压碎，机械地分离脾脏。如果存在脂肪颗粒，这也将去除脂肪颗粒，将载玻片固定在 10 厘米的板上。
吸取 DMEM 在其上，将内容物冲洗到板中，翻转并清洗另一侧。然后对另一张幻灯片重复此过程。通过细胞过滤器将整个组织悬液轻轻倒入 50 mL 锥形螺旋盖管中。
然后用 10 毫升 PBS 清洗含有脾匀浆的 10 厘米培养皿，并将其倒入细胞过滤器，以 1， 300 RPM 的速度离心单细胞悬液 10 分钟，离心后丢弃 snat。丢弃 snat 并加入 5 毫升 CK 缓冲液。延迟红细胞。
轻弹细胞沉淀以打碎任何团块。在室温下孵育 5 分钟，然后在离心后以 1， 300 RPM 离心获得物。弃去番泻叶，通过轻弹和轻轻移液，用两个 FBS 将沉淀重新悬浮在 PBS 中。
然后将细胞放回冰上，使用自动细胞计数器对活细胞进行计数。确定细胞数量后，将 PBS 重悬的 SP 细胞以 375 倍 G 的速度离心 4 分钟。丢弃脊髓突起物，将细胞重悬于 4 毫升完整 DMEM 标记中。
5 个 15 mL 锥形管，含 2.4 mL DMEM，用于 5 倍连续稀释、1 至 5、1 至 25、1 至 125、1 至 250 倍，并冻融。然后将 600 μL PLE 细胞悬液稀释到第一管中并充分混合。不要涡旋。
继续对每个试管进行连续稀释。接下来，从制备好的六孔单层中吸出前一天制备的各种细胞的培养基，将 1 毫升连续稀释的细胞接种到一式两份的 10 孔中的各种细胞上。将板孵育 8 至 12 小时，吸出接种的细胞悬液，并向每个孔中加入 4 毫升覆盖培养基，在 6 天后再孵育 6 天。
像以前一样通过噬菌斑测定确定脾脏感染中心的水平，以评估病毒抗凋亡蛋白 BCL 2 在 γ 疱疹病毒 68 中的作用 LITIC 和潜伏感染肠 C 小鼠感染了 γ HV 68 或含有非功能性病毒 BCL 2 的 γ HV 68 突变株，并评估了急性和潜伏感染率，如本视频所示，如下所示。病毒 BCL 2 在 BC 小鼠鼻内感染 7 天后，以与野生型 γ HV 68 在肺部相当的水平复制。两组之间病毒肺 Titus 差异无统计学意义。
这些数据表明，病毒 BCL 2 不是小鼠 Gamma H HV 68 急性感染的关键因素。然而，到感染后 28 天，与感染中心测定法测量的野生型相比，脾脏中病毒 BCL 2 突变病毒的滴度下降了 6 至 10 倍。这表明病毒 BCL 两个突变体 γ H 68 病毒在感染后维持脾潜伏期方面存在缺陷，以验证通过感染测定获得的结果或确定感染率是否由于病毒潜载量减少而降低，而潜伏病毒无法重新激活 X 体内病毒基因组水平通过 QPCR 评估，如下所示。
在重复实验中，与野生型病毒相比，病毒 BCL 两种突变病毒的病毒基因组载量在第 28 天严重降低。病毒基因组载量与潜伏性 γ HV 68 病毒 BCL 两种突变病毒再激活频率之间的密切相关性，在感染潜伏期的离体突出了这种突变病毒感染的潜伏期缺陷。在此程序之后，可以执行其他方法，如限制稀释 PCR，以回答其他问题，例如评估携带病毒基因组的细胞的频率。
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概述
本文介绍了一种用于研究小鼠中纬-疱疹病毒（纬-HV）感染的协议，重点关注急性和潜伏阶段。该方法包括用于定量病毒载量的斑块形成、感染中心和qPCR检测。
关键研究组成部分
科学领域
- 病毒学
- 传染病学
- 动物模型
背景
- 纬-疱疹病毒能在宿主体内建立终身感染。
- 纬-HV68作为研究纬-HV生命周期和发病机制的模型。
- 了解急性和潜伏感染对治疗策略至关重要。
- 体内模型允许对病毒行为进行详细分析。
研究目的
- 在小鼠模型中表征纬-HV68的生命周期。
- 评估感染的急性和潜伏阶段。
- 提供使用各种检测方法定量病毒载量的协议。
使用的方法
- 通过鼻腔感染小鼠纬-HV68。
- 收集和质地化肺组织以评估急性病毒载量。
- 收集脾脏用于潜伏病毒载量分析。
- 进行斑块和感染中心检测以评估病毒复制。
主要结果
- 通过斑块检测确定急性病毒载量。
- 通过感染中心检测评估潜伏病毒载量。
- 结果说明了病毒复制的时空分布。
- 发现有助于了解纬-HV在体内的发病机制。
结论
- 该研究提供了一种评估纬-HV68感染阶段的可靠方法。
- 获得的见解可以为未来的疱疹病毒感染研究提供信息。
- 建立的协议可以适用于其他纬-HV。
常见问题
Executive Industry Relevance
This protocol enables biopharma R&D teams to model γ-herpesvirus lifecycle and pathogenesis in vivo using a murine system that closely mirrors human EBV and KSHV biology. By quantifying acute and latent viral loads through plaque, infectious center, and qPCR assays, the approach supports target validation and mechanistic de-risking in antiviral discovery programs. The spatiotemporal profiling of viral replication informs predictive confidence in lead compound efficacy across infection stages.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by measuring viral replication in lung and spleen tissues to validate antiviral targets.
- Operational Value: Provides reproducible quantification of acute viral titer via plaque assay on Vero cell monolayers.
- Predictive Value: Enables assessment of compound effects on latent reservoir maintenance using infectious center assay readouts.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Prepares lung homogenates for standardized plaque-forming unit quantification at 5–7 days post-infection.
- Quantitative Output: Generates linear dilution series data for accurate virus titer calculation in plaque-forming units per milliliter.
- Scalability: Supports duplicate well plating and exclusion criteria (10–100 plaques/well) to minimize technical variability.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Models latent infection establishment in splenocytes around 14 dpi, reflecting clinical γ-herpesvirus persistence.
- Translational Continuity: Links acute lung viral load to latent spleen reservoir dynamics for stage-specific biomarker alignment.
- Risk-Adjusted Decisions: Informs go/no-go criteria based on reactivation-competent latent load measured by infectious center assay.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into antiviral discovery workflows from early target validation through preclinical efficacy testing, enabling stage-specific assessment of viral replication and latency.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of viral lifecycle genes (e.g., BCL2 homologs) by comparing acute lung titers and latent spleen loads.
- Screening: Delivers standardized, quantitative viral load outputs from lung homogenates for compound screening campaigns.
- Analytics: Provides plaque assay and infectious center assay readouts that enable statistical comparison of viral infectivity across conditions.
- Translational Research: Connects in vivo viral genome levels (via qPCR) to phenotypic latency/reactivation data for mechanistic insight.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for evaluating antiviral candidates against γ-herpesvirus latency and reactivation.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by distinguishing acute replication from latent maintenance phenotypes.
- Operational Value: Standardizes tissue processing, homogenization, and serial dilution protocols for inter-laboratory reproducibility.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling early de-risking of latency-targeting compounds before costly late-stage studies.
- Portfolio Impact: Facilitates risk-adjusted prioritization of compounds based on effects on viral genome load and reactivation frequency.
Implementation Considerations
- Requires expertise in murine infection techniques, tissue harvest, and aseptic homogenization to avoid cross-contamination.
- Depends on Vero cell monolayer quality and overlay medium preparation for accurate plaque visualization.
- Necessitates standardized cell counting and viability assessment for infectious center assay input consistency.
- Involves biosafety level 2 precautions for handling murine-adapted γHV68 and tissue processing.
- Limited by the need for precise timing of tissue collection (5–7 dpi for acute, 12–14 dpi for latent) to align with infection biology.
