Name: 使用网关兼容双分子荧光互补（附设）系统在植物蛋白相互作用检测 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-09-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 21 s
Description: 学习使用Gateway兼容双分子荧光互补系统在植物中检测蛋白质相互作用的方法。该技术通过YFP片段重组实现活细胞实时可视化，为植物生物学研究提供高效工具。

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我们感谢 Vi Nguyen 对稿件的审阅以及在实验室工作中的协助。

1. 准备 农杆菌 培养
<ol>
 <li>农杆菌 菌株GV3101，此前已转化含有Gateway兼容的双分子荧光互补载体pEarleyGate201-YC和pEarleyGate202-YN，两者均包含目的基因的融合构建体。</li>
 <li>接种5 ml YEB（5 g/L-1 牛肉浸膏，1g L-1 酵母提取物，5 g/L-1 蛋白胨，5g L-1 蔗糖，2 mM MgSO₄4，pH 7.2）培养转化了BiFC融合蛋白构建体的细胞 农杆菌 使用适当的抗生素进行筛选。在37°C下过夜培养。 28°C 以 200 rpm 振荡。</li>
 <li>将1 ml培养物转移至无菌的1.5 ml离心管中。</li>
 <li>在室温下以1,000g离心10分钟收集细胞，弃上清液。</li>
 <li>加入1 ml浸润培养基（5 g L⁻¹）洗涤沉淀-1 D-葡萄糖，50 mM MES（Sigma），2 mM Na3PO4，0.1 mM 乙酰丁香酮 11用移液器重悬沉淀，然后在1,000g离心10分钟，再次收集细胞沉淀。</li>
 <li>重复洗涤步骤两次。</li>
 <li>将沉淀重悬于0.5 ml浸润培养基中。</li>
 <li>在600 nm处测定吸光度，并调整终末OD值600 1.0 至 1.2</li>
 <li>分装等量的 农杆菌 将每种构建体的悬浮液分别转入新的1.5 ml离心管中，涡旋振荡10秒。用于单次侵染时， 100 μL 每种构建体的量都绰绰有余。</li>
 <li>的 农杆菌 混合液现已可进行浸润。</li>
</ol>
2. 渗入
<ol start="11">
 <li>在21°C、16小时光照和8小时黑暗的条件下培养N. benthamiana植株。应使用5至6周龄的植株进行农杆菌浸润。</li>
 <li>将植株从生长室中取出，在白色光源下放置1小时，使气孔充分打开，然后再进行浸润操作。</li>
 <li>用1 ml无针头的滑动式结核菌素注射器吸取重悬的agrobacterium混合液。</li>
 <li>将注射器尖端抵住叶片背面，同时用一根手指轻轻托住叶片上表面，缓慢推动活塞。液体将随着填充叶肉组织的细胞间隙而在叶片内扩散。</li>
 <li>用记号笔标记浸润区域，以便后续识别。</li>
 <li>当使用不同构建体进行浸润时，每次浸润之间务必更换手套或用70%乙醇清洁手套。如有可能，不同样品之间应至少保留一条中脉间隔，以防止交叉污染。</li>
 <li>将植株放回生长培养箱中，在正常生长条件下继续培养。</li>
</ol>
3. 重建的YFP信号的观察
<ol start="18">
 <li>在侵染区域内切取一块5mm × 5mm的叶片组织</li>
 <li>将样品置于水中的玻璃载玻片上，加盖盖玻片，使用共聚焦或荧光显微镜观察相互作用情况。</li>
 <li>从侵染开始起，应每隔24小时监测一次表达情况，持续至5天后，因为过表达或蛋白转运可能随时间推移导致荧光融合蛋白出现在多个不同位置。</li>
</ol>
4. 代表性结果：
双分子荧光互补（BiFC）实验检测蛋白质-蛋白质相互作用的示例如图1所示。AtTHP1和AtSAC3A被认为属于 拟南芥 酵母TREX-2复合体的同源物。它们可与核孔蛋白AtNUP1相互作用，并促进mRNA的输出10将AtTHP1和AtSAC3A克隆至pEarlyGate201-YC载体，AtNUP1克隆至pEarlyGate202-YN载体。随后将这些质粒转化至农杆菌GV3101中。三种构建体以三种可能组合（AtTHP1+AtNUP1；AtTHP1+AtSAC3A；AtNUP1+AtSAC3A）进行共浸润实验。浸润48小时后，利用激光共聚焦显微镜（LCSM）检测重组YFP信号。信号出现在表皮细胞中，并定位于核周区域或核质，与这些蛋白的亚细胞定位一致。阴性对照未检测到YFP信号。 
<img src="/files/ftp_upload/3473/3473fig1.jpg" alt="植物细胞显微镜观察；荧光标记显示蛋白质定位；比较分析。" data-altupdatedat="1788840098000" data-alt="图1"> 
图1. Arabidopsis TREX-2 mRNA 输出复合体组分之间相互作用。N. benthamiana 叶片共转化了目的基因（GOI）与 pEarleyGate201-YC 和 pEarleyGate202-YN 载体（如图所示），在侵染后48–72小时使用Leica TCS SP2共聚焦显微镜进行成像。图像显示为表皮N. benthamiana叶细胞的YFP共聚焦图像与明场图像的叠加结果

<ol><li>Ohad, N., Yalovsky, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Utilizing+bimolecular+fluorescence+complementation+%28BiFC%29+to+assay+protein-protein+interaction+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+molecular+biology%22%5BJournal%5D)">Utilizing bimolecular fluorescence complementation (BiFC) to assay protein-protein interaction in plants.</a> Methods in molecular biology. 655, 347-358 (2010).</li>
<li>Fang, Y., Spector, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BiFC+imaging+assay+for+plant+protein-protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+protocols%22%5BJournal%5D)">BiFC imaging assay for plant protein-protein interactions.</a> Cold Spring Harbor protocols. 2, (2010).</li>
<li>Schutze, K., Harter, K., Chaban, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bimolecular+fluorescence+complementation+%28BiFC%29+to+study+protein-protein+interactions+in+living+plant+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+molecular+biology%22%5BJournal%5D)">Bimolecular fluorescence complementation (BiFC) to study protein-protein interactions in living plant cells.</a> Methods in molecular biology. 479, 189-202 (2009).</li>
<li>Hiatt, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bimolecular+fluorescence+complementation+%28BiFC%29+analysis+of+protein+interactions+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Bimolecular fluorescence complementation (BiFC) analysis of protein interactions in Caenorhabditis elegans.</a> Methods. 45, 185-191 (2008).</li>
<li>Barnard, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+implementation+of+split-GFP-based+bimolecular+fluorescence+complementation+%28BiFC%29+assays+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Society+Transactions%22%5BJournal%5D)">Development and implementation of split-GFP-based bimolecular fluorescence complementation (BiFC) assays in yeast.</a> Biochemical Society Transactions. 36, 479-482 (2008).</li>
<li>Kerppola, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+and+implementation+of+bimolecular+fluorescence+complementation+%28BiFC%29+assays+for+the+visualization+of+protein+interactions+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Design and implementation of bimolecular fluorescence complementation (BiFC) assays for the visualization of protein interactions in living cells.</a> Nature. 1, 1278-1286 (2006).</li>
<li>Hu, C. D., Grinberg, A. V., Kerppola, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+protein+interactions+in+living+cells+using+bimolecular+fluorescence+complementation+%28BiFC%29+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Current+protocols+in+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Visualization of protein interactions in living cells using bimolecular fluorescence complementation (BiFC) analysis.</a> Current protocols in cell biology. 21, 3-3 (2006).</li>
<li>Earley, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gateway-compatible+vectors+for+plant+functional+genomics+and+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+journal+%3A+for+cell+and+molecular+biology%22%5BJournal%5D)">Gateway-compatible vectors for plant functional genomics and proteomics.</a> The Plant journal : for cell and molecular biology. 45, 616-629 (2006).</li>
<li>Karimi, M., Inze, D., Depicker, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GATEWAY+vectors+for+Agrobacterium-mediated+plant+transformation%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">GATEWAY vectors for Agrobacterium-mediated plant transformation.</a> Trends in Plant Science. 7, 193-195 (2002).</li>
<li>Lu, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arabidopsis+homolog+of+the+yeast+TREX-2+mRNA+export+complex%3A+components+and+anchoring+nucleoporin%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+journal+%3A+for+cell+and+molecular+biology%22%5BJournal%5D)">Arabidopsis homolog of the yeast TREX-2 mRNA export complex: components and anchoring nucleoporin.</a> The Plant journal : for cell and molecular biology. 61, 259-270 (2010).</li>
<li>Sparkes, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((transient+expression+of+fluorescent+fusion+proteins+in+tobacco+plants+and+generation+of+stably+transformed+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+protocols%22%5BJournal%5D)">transient expression of fluorescent fusion proteins in tobacco plants and generation of stably transformed plants.</a> Nature protocols. 1, 2019-2025 (2006).</li>
<li>Rackham, O., Brown, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+RNA-protein+interactions+in+living+cells%3A+FMRP+and+IMP1+interact+on+mRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+journal%22%5BJournal%5D)">Visualization of RNA-protein interactions in living cells: FMRP and IMP1 interact on mRNAs.</a> The EMBO journal. 23, 3346-3355 (2004).</li>
<li>Demidov, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+complementation+of+split+fluorescent+protein+triggered+by+DNA+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Fast complementation of split fluorescent protein triggered by DNA hybridization.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103, 2052-2056 (2006).</li>
<li>Shyu, Y. J., Suarez, C. D., Hu, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+ternary+complexes+in+living+cells+by+using+a+BiFC-based+FRET+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Visualization of ternary complexes in living cells by using a BiFC-based FRET assay.</a> Nature. 3, 1693-1702 (2008).</li>
</ol>

无利益冲突声明。

双分子荧光互补（BiFC）检测是一种研究蛋白质相互作用的有力工具。与传统的酵母双杂交（Y2H）检测不同，BiFC不仅能够实现蛋白质-蛋白质相互作用的可视化，还能提供有关蛋白复合物的更多信息，例如亚细胞定位。此外，只要两个候选蛋白能通过第三个伴侣分子被拉近到足够距离，就有可能检测到间接相互作用。与所有技术一样，BiFC也存在局限性。由于荧光团的形成需要分子氧，因此该技术不能用于专性厌氧生物——这类生物无法在氧气存在下存活，从而限制了BiFC仅能应用于需氧生物6。荧光团复合物的形成是不可逆的，这会阻止蛋白质与其他蛋白进一步相互作用，并可能干扰处于动态平衡中的蛋白复合物的结合与解离过程6。然而，这种不可逆性也使我们能够观察到较弱或短暂的相互作用。荧光蛋白片段在不依赖其融合蛋白的情况下也具有一定的自发结合能力，因此必须设置充分且多样化的对照，以区分真实的相互作用与假阳性结果6。此外，由于荧光团的重建可在7 nm甚至更远的距离发生，荧光互补信号可能反映的是直接或间接的相互作用。因此，需要结合其他方法（如Y2H或共免疫沉淀）来验证具体的相互作用关系7。
...

<table><tbody><tr><td>乙酰丁香酮</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D134406</td><td></td></tr><tr><td>MES 水合物</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2933</td><td></td></tr><tr><td>1 mL 带滑动接头的结核菌素注射器</td><td>BD Biosciences</td><td>309602</td><td></td></tr></tbody></table>

利用适用于gateway系统的双分子荧光互补（bifc）技术检测植物中的蛋白质相互作用

Detection of Protein Interactions in Plant using a Gateway Compatible Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) System

我们开发了一种双分子荧光互补（BiFC）技术，用于检测两种蛋白质之间的相互作用 体内通过将黄色荧光蛋白（YFP）分割成两个不重叠的片段来实现。每个片段分别与目标基因按读码框融合克隆。随后可将这些重组质粒共转化至 Nicotiana benthamiana 通过 农杆菌 介导的转化，实现融合蛋白的瞬时表达。只有当目标蛋白相互作用时，YFP 信号才会重建。 1-7为了检测和验证蛋白质-蛋白质相互作用，可将双分子荧光互补（BiFC）与酵母双杂交（Y2H）实验联合使用。该联合方法能够检测到在Y2H中可能被忽略的间接相互作用。Gateway技术是一种通用平台，可使研究人员将目的基因（GOI）快速转移至尽可能多的表达和功能分析系统中。8,9方向和读码框均可在无需使用限制性酶或连接步骤的情况下得以保持，从而直接构建可用于表达的克隆。因此，可省去所有重新测序步骤，确保实验过程中结果的一致性。我们已构建了一系列与Gateway兼容的BiFC和Y2H载体，为研究人员提供便于使用的工具，以开展BiFC和Y2H实验。10在此，我们展示了利用我们的BiFC系统检测蛋白质-蛋白质相互作用的简便性 N. benthamiana 植物

我们开发了一种在植物中检测蛋白质-蛋白质相互作用的技术。将黄色荧光蛋白（YFP）分割成两个不重叠的片段，每个片段通过Gateway系统与目标基因进行同框克隆，从而表达融合蛋白。只有当目标蛋白质发生相互作用时，YFP荧光信号才会重建。

利用适用于Gateway系统的双分子荧光互补（BiFC）技术检测植物中的蛋白质相互作用

我们开发了一种双分子荧光互补（BiFC）技术，用于在体内检测两种蛋白质之间的相互作用。该方法通过将一个黄色荧光蛋白（YFP）进行拆分来实现……

为了检测两种蛋白质之间的相互作用，需要使用Gateway长片段克隆技术将两个目的基因分别克隆到我们的BF和载体中。将构建好的质粒转化至农杆菌GV3101中。含有相应构建质粒的GV3101菌液将被混合，并共同浸润到叶片中。如果两个候选蛋白相互作用，则可以利用结果聚焦墨西哥观察到YFP信号。双分子荧光互补（BFC）技术的主要目的是检测两种蛋白之间的相互作用。在vavo中，我们构建了一系列与gateway兼容的BFC和IS双杂交载体，为研究人员提供了易于使用的工具，以开展BFC和ISTO双杂交实验。在本视频中，我们将展示使用我们的BFC系统的便捷性。为了以不受表达系统限制的方式检测蛋白质及其相互作用，首先需要制备GV3101菌株的细菌培养物。需要从平板上挑取单个菌落，接种到含有适当抗生素的5 mL YEB培养基中。然后在28°C、200转/分钟的条件下振荡培养过夜。细菌培养物应在第二天早上准备好。确保细菌已过夜培养。从培养箱中取出培养物，将每种培养物中的一个1.5 mL离心管转移至无菌的1.5 mL离心管中。将离心管放入台式离心机中。在室温下以1000 ×g离心10分钟，沉淀细菌，弃去上清液。然后通过加入1毫升浸润培养基并轻轻吹打数次重悬菌体沉淀。重复洗涤步骤再进行两次。此步骤非常重要，因为它有助于去除细菌培养基中残留的抗生素，这些抗生素会在浸润后对植物造成伤害。最后一次洗涤后，用0.5 mL的浸润培养基重悬菌体沉淀，并以浸润培养基作为空白对照，在分光光度计中测定该菌液悬浮液的OD600值。在测定OD后，你需要使用侵染介质调整OD值，最终OD值应介于1至1.2之间。在进行下一步操作前，应准备好所有细菌悬浮液。取等量的两种候选蛋白对应的细菌悬液，转移至一个新的1.5 mL离心管中，混合均匀，得到用于侵染的阴性细菌混合物。请准备所有需要的组合，并务必设置阴性对照。侵染时应使用五到六株健康且生长状态良好的植物。可将植物从培养室中取出，在侵染前将其置于弱光下放置一小时，以打开气孔。这将有助于侵染过程。吸取约100 µL重悬的Resus细菌溶液。取一支接近一毫升的无针头移液枪，将枪头抵住叶片的下表面。用手指支撑叶片的上表面。通常情况下，按压活塞。你应该能够看到液体扩散到叶片中，此时中脉感觉更薄。在渗透后，使用记号笔在叶片上标记已渗透区域，否则两天后你将无法辨认出已渗透的区域A。如果你需要用不同的细菌混合液进行渗透，请确保在每次渗透之间用50%乙醇喷洒手套，或更换手套。尽量在每次浸润之间留出1米的肋间距离，以防止交叉污染。从浸润开始起，应每24小时监测一次PFA信号，持续五天。可使用两个不同尺寸的保护套管来固定样品。首先，在凹槽盖片上滴加一滴微型水。然后在浸润区域内裁剪一小块刀片纸巾。尽量避免损伤样本中的恶心静脉。将切割好的刀片组织置于载玻片上的水中，放好后用较小的套管覆盖，并轻轻按压。现在即可在显微镜下观察样品。此处我们使用 NACA T CSS P 两光子共聚焦显微镜来观察 BIFC 信号。即使是常规的香精墨西哥也可使用。共聚焦显微镜可提供更清晰的图像并检测弱信号。您可以使用YFP参数在此NCAs P二系统中检测VFC信号。您可以直接双击此处的YFP预设，系统将自动开启激发光并设置发射光检测范围。如果您使用的是其他系统，请参考说明书以正确设置参数。我们希望在观看本视频后，您能够掌握如何利用unbe MI Transcend表达系统进行BFCE实验，以检测蛋白质与蛋白质之间的相互作用。您也可以将该程序应用于烟草和 AY 植物。我们的 BFC 载体分别包含 HA 标签和 Flag 标签，因此如有必要，您还可以进行免疫共沉淀（co-IP）以验证相互作用。

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