使用网关兼容双分子荧光互补（附设）系统在植物蛋白相互作用检测
2011年9月16日
我们已经开发出一种技术，以测试植物蛋白质相互作用。一个黄色荧光蛋白（YFP）被分成两个非重叠的片段。每个帧通过网关系统的兴趣基因片段克隆，使融合蛋白的表达。重组YFP的信号只发生在研讯的蛋白质相互作用。
为了测试两种蛋白质之间的相互作用，需要使用 Gateway 渴望技术将两个感兴趣的基因克隆到我们的 BF 和载体中。这种结构被转化为 aerium GV 3 1 0 1。含有构建物的 GV 3 1 0 1 细菌培养物将被混合并共渗入叶子中。
如果两种候选蛋白相互作用，则可以使用结果局灶性墨西哥观察 YFP 信号。BFC 技术的主要目的是测试两种蛋白质之间的相互作用。在 vavo 中，我们创建了一系列兼容网关的 BFC 和 IS 两种杂交载体，为研究人员提供了易于使用的工具来执行 BFC 和 ISTO 两种杂交分析。
在本视频中，我们将演示 BFC 系统的易用性。为了测试蛋白质，蛋白质相互作用以 unbe 方式超越了表达系统。首先，您需要准备 GV 3 1 0 1 细菌培养物。
您需要从平板中挑选一个菌落，并在 5 只雄性 YEB 培养基中接种适当的抗生素。然后你需要在 28 度下摇晃 This 培养物过夜。速度为每分钟 200 次运行。
细菌培养物应在第二天早上准备好。确保细菌 D 过度生长。从培养箱中取出培养物，将每种培养物的 1 只雄性转移到无菌的 1.5 雄性离心管中。
将离心管放入台式离心机中。在室温下以 1000 G 离心细菌 10 分钟，丢弃 snet。然后通过添加一餐渗透培养基和每 Petting 几次重新评估来观察 penate。
重复洗涤步骤再两次。这很重要，因为它有助于去除细菌培养基中的微量抗生素，这些抗生素会使您在渗透后形成植物密封。最后一次洗涤后，使用分光光度计将托盘悬浮在 0.5 雄性浸润培养基中，该剂量应为 600 种细菌悬浮液，使用渗透介质作为银行控制。
OD 测量后，您需要使用渗透介质调整 OD。最终 OD 应介于 1 和 1.2 之间。在进行下一步之前，您应该准备好所有细菌悬浮液。
转移对应于两种候选蛋白的等量细菌悬浮液，并将它们混合在新的 1.5 male 试管中阴性细菌混合物现在与浸润有关。准备所有组合，不要忘记 包括阴性对照.您应该使用 5 到 6 周的代码和最佳方式植物进行渗透。
你可以把植物从生长室里拿出来，放在 We night 上一小时，然后渗透开风暴攻击。这将有助于渗透过程。抽取约 100 微升 Resus 悬浮细菌。
在一个没有针头的公滑头注射器附近混合。将注射器的尖端靠在叶子的下侧。用手指支撑膝盖的上侧。
通常按下柱塞。您应该能够看到液体通过叶子扩散，但感觉到渗透后的 Meso 更薄的空气空间使渗透的空气动力学与记号笔。否则，两天后，您将无法识别浸润的 A.如果您需要浸润 使用不同的细菌混合物，请确保用 50% 乙醇喷洒手套或在两次浸润之间更换 G 手套。
尽量在渗透之间留出 1 米的肋骨空间，以防止交叉污染。PFA 信号应从浸润开始每 24 小时监测一次，最长 5 天。您可以使用两个不同尺寸的盖套来容纳样品。
首先，将一滴迷你水滴在缺口盖套上。然后在浸润区内切下一小块刀组织。尽量避免样本中的恶心静脉。
将切好的刀组织放入载玻片上的水中 放下，用较小的电流套管盖住并轻轻按压。现在，可以在 Mexico 范围内观察样本。在这里，我们使用这个 NACA T CSS P 两个共聚焦墨西哥来可视化 BIFC 信号。
即使是普通的香味墨西哥也可以使用。共聚焦可提供更好的图像并检测微弱信号。您可以使用 YFP 参数来检测此 NCAs P two 系统中的 VFC 信号。
您只需在此处双击此 YFP 预设，它将自动打开激发并设置发射检测范围。如果您使用的是其他系统，请参阅手册以正确设置参数。我们希望在观看此视频后，您应该能够进行 BFCE 以使用 unbe MI Transcend 表达系统测试蛋白质蛋白质相互作用。
您也可以将此程序应用于烟草和 AY 植物。我们的 BFC 载体还分别包含 HA 和 flag 标签，因此如有必要，您还可以执行 co IP 来验证相互作用。
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概述
这项研究提出了一种用于测试植物中蛋白-蛋白相互作用的新技术，使用分裂的黄色荧光蛋白（YFP）方法。通过在目标基因的开放阅读框中克隆YFP片段，研究人员可以观察YFP的重组，表明蛋白质相互作用。
关键研究组成部分
科学领域
- 植物生物学
- 蛋白质相互作用
- 荧光蛋白技术
背景
- 理解蛋白质相互作用对于阐明生物过程至关重要。
- 传统方法可能不适用于植物系统。
- 分裂YFP技术允许对相互作用进行实时可视化。
- Gateway克隆促进融合蛋白的构建。
研究目的
- 开发一种用于研究植物中蛋白质相互作用的高效方法。
- 为研究人员提供进行BFC和ISTO双杂交分析的工具。
- 增强对植物生物学中蛋白质功能的理解。
使用的方法
- 将YFP片段克隆到与Gateway兼容的载体中。
- 将构建体转化到农杆菌GV3101中。
- 将细菌培养物共同渗入植物叶片中。
- 使用显微镜观察YFP信号以确认相互作用。
主要结果
- YFP信号的成功重组表明蛋白质相互作用。
- 展示了BFC技术在植物系统中的有效性。
- 为研究人员提供了用户友好的工具。
- 通过各种蛋白质对验证了该方法。
结论
- 分裂YFP技术是研究植物中蛋白质相互作用的有价值工具。
- 该方法可以促进对植物生物学的进一步研究。
- 未来的应用可能包括探索复杂的蛋白质网络。
常见问题
Executive Industry Relevance
Protein-protein interaction analysis in plant systems supports target validation and mechanistic de-risking in agrochemical and biologics discovery. The Gateway-compatible BiFC system enables reproducible, in vivo interaction screening with quantitative fluorescence readouts, improving predictive confidence in early-stage target assessment. This approach reduces reliance on indirect assays and supports cross-functional collaboration between plant biology and translational research teams.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables direct interrogation of therapeutic hypotheses through visualization of protein interactions in planta.
- Operational Value: Provides a Gateway-compatible platform for rapid cloning and testing of target pairs without re-sequencing.
- Predictive Value: Supports biological de-risking by confirming interactions in a native-like cellular context.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates standardized biological systems suitable for downstream compound or modulator screening.
- Quantitative Output: YFP fluorescence intensity provides a measurable readout for interaction strength and dose-response modeling.
- Scalability: Compatible with high-throughput agroinfiltration workflows in Nicotiana benthamiana.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Facilitates study of plant-derived target pathways with potential translational biomarkers.
- Mechanistic Continuity: Bridges discovery findings with preclinical validation through consistent interaction data.
- Risk-Adjusted Decisions: Enables prioritization of targets based on confirmed interaction networks.
Pipeline & Workflow Integration
The BiFC system fits within the early discovery continuum, supporting hypothesis testing and assay development prior to lead identification efforts in plant-based therapeutic discovery.
- Discovery Biology: Supports target validation and pathway clarification through direct interaction detection.
- Screening: Enables preparation of reproducible, quantitative interaction assays for compound screening campaigns.
- Analytics: YFP signal measurement provides quantifiable data for comparing interaction conditions and genetic perturbations.
- Translational Research: Aligns with biomarker discovery by confirming interactions in disease-relevant plant models.
- Enterprise Reuse: Gateway compatibility allows vector reuse across multiple projects and expression systems.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by providing direct, visual evidence of protein interactions in living cells.
- Operational Value: Standardizes interaction testing through Gateway cloning and agroinfiltration protocols.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by increasing confidence in target engagement early in discovery.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted target prioritization based on validated interaction data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in molecular cloning, agroinfiltration, and fluorescence microscopy.
- Depends on Agrobacterium-mediated transformation infrastructure and confocal or widefield microscopy capabilities.
- Necessitates standardization across teams for consistent OD adjustment, infiltration timing, and signal quantification.
- Adaptation to other plant species may require optimization of infiltration conditions and promoter selection.
- Signal quantification may be affected by autofluorescence or subcellular localization, requiring appropriate controls.
