通过整合基因组学、代谢组学与生物信息学注释植物基因功能

以下实验的总体目标是通过代谢物谱型分析与共表达分析相结合的方法进行基因注释，从而发现并表征新的基因功能。该目标通过实验设计的综合考量来实现，重点关注特定的代谢通路和植物物种。第二步，采用分析方法，依据所检测到的化合物的化学结构，构建完整的代谢通路。

接下来，将预测通路的结构与共表达分析相结合，以缩小候选基因的范围，这些基因可能指示代谢过程中的关键基因。最终，通过高效利用多种生物资源并进行最少数量的实验，获得结果，从而实现对基因功能的鉴定。我们最初产生这一方法的想法，是在共表达数据库“ate”中发现Abosi OID生物囊性基因具有极高相关性时。

我们认为，该策略是利用公开可用的数据库和高效利用生物资源来快速发现新基因功能的方法之一。开始提取时，先收获植物材料并立即用液氮速冻。待材料完全冻结后，使用混合研磨仪将植物材料研磨成冻粉，分装至2毫升EOR管中，每管加入一个金属研磨珠。

每50毫克样品加入250微升提取缓冲液。提取缓冲液中含有用于归一化的内标。随后，使用混合研磨仪将冷冻粉末均质化处理两分钟。

在25的频率下，以12,000 RPM离心样品10分钟。然后将上清液转移至离心滤膜管中。完成第二轮离心后，将上清液转移至新的einor管中。

接下来，首先检查高效液相色谱仪（HPLC）的色谱柱温箱温度是否为 35 摄氏度，样品托盘温度是否为 10 摄氏度，并进行相应设置。设定质谱条件，并检查真空状态和加热毛细管情况。通过进样注入校准溶液混合物，对质谱检测器进行质荷比校准。

使用软件中的自动校准应用程序。然后将50微升提取物转移至玻璃小瓶中。进行高效液相色谱（HPLC）分析时，按照书面实验步骤所述，在分析第一个样品前，至少需先对提取缓冲液进行五次进样。

配置质谱分析工具后，选择待处理的数据。根据书面实验方案中所示的化合物类别，制备目标检测峰的表格。通过与标准化合物共洗脱来鉴定峰，并在此步骤中利用串联质谱分析、文献查阅、综述以及代谢物数据库检索对检测到的峰进行注释。

通路预测应基于化学结构，通过关联代谢通路中的酶功能来实现。因此，这些步骤应基于对检测到的化合物进行精确的峰归属。通用代谢通路数据库，如KEGG数据库和PlantCyc，在目标代谢通路的预测中具有很高的有效性。

为了准备包含拟南芥同源基因的基因列表，首先从基因组数据库下载基因ID列表。如果目标植物不是拟南芥，则需添加对应同源基因的拟南芥基因ID。然后准备目标通路中的基因列表。

拟南芥通路数据和基因家族数据的注释可在TAAR网站获取。随后可整合拟南芥直系同源基因列表。利用准备好的基因ID列表进行共表达网络分析，以搜索预测通路的最佳数据库。

检测目标通路中已知基因对的相关性。如果无法获得共表达数据库或基因表达数据库，在目标计划中应使用拟南芥共表达数据库，并结合一份拟南芥同源基因列表。

接下来，构建目标共表达网络的框架。根据目标通路中已知基因的相互关系，添加相关的候选基因，并在预测的基因家族中检查这些候选基因的功能注释，将其连接关系纳入该网络，以筛选出最佳候选基因。

应根据网络结构和相关基因的密度来协调基因的系数值阈值。现在列出可被进一步缩小范围、且可能特化于目标通路的基因。利用此基因列表，分析候选基因在不同器官中的特异性表达及其对胁迫的响应情况。

通过将已充分表征且已被用于共表达分析查询的基因添加到预测的代谢通路中，开始整合信息。通过文献检索，确认该通路中未表征的部分是否为新颖发现，包括尚未明确功能的酶促反应步骤、转运蛋白和转录因子。在此基础上，预测这些缺失的未表征步骤中最合适的基因注释。

结合代谢物谱分析结果与基于预测通路的候选基因的计算机基因表达分析结果。随后，根据基因功能将候选基因排列在预测的通路上。例如，乙酰转移酶对应乙酰化代谢物，糖基转移酶对应糖苷类物质，P450 酶对应氧化化合物。

在候选基因的代谢物积累与基因表达水平之间，检查其组织特异性或应激响应的一致性。同时检查其与其他代谢途径的关联，以确认底物供应及应激响应相关基因的联系。最后一步，利用生物资源（如基因敲除突变体文库和全长cDNA文库）开展实验，鉴定基因功能。如图所示。

以下是花青素通路共调控网络分析的一个示例。基于第三增强版本数据集，使用PRAM共表达指数进行共表达分析，通过PX程序将12个花青素合成相关的酶基因和2个调控花青素生成的转录因子作为查询基因（以红色节点表示），用于搜索候选基因。利用Prime数据库通过集合关联搜索重建了一个包含68个相关候选基因和14个查询基因的共表达网络，最终生成T-net输出文件，并使用PX软件绘制网络图。

蓝色节点表示与花青素基因在发育后相关的候选基因。该策略将为我们预测植物代谢中基因的新功能提供重要线索。