Name: 在哺乳动物细胞中细胞周期位置分析 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-01-21T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 19 s
Description: 学习使用流式细胞术和BRDU标记分析哺乳动物细胞周期分布的方法。本方案通过碘化丙啶染色定量检测G1、S和G2/M期细胞比例，为研究细胞增殖调控提供可靠数据。

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作者感谢加拿大卫生研究院（CIHR）和加拿大癌症协会对其实验室细胞周期研究的资助。MJC 获得了 CIHR 的医学博士/哲学博士奖学金。MJC 和 MA 是 CaRTT 培训项目的成员。

1. 细胞的标记与固定
<ol>
	<li>在收获细胞前1小时，每毫升细胞培养基中加入1 μL细胞增殖标记试剂（BrdU）（1至1000倍稀释）。对于生长较慢的细胞，可能需要延长标记时间。</li>
	<li>收获细胞时，吸除培养基，并用磷酸盐缓冲液（PBS）彻底清洗。重复清洗以完全去除残留的培养基。</li>
	<li>用含3 mM EDTA的PBS快速再清洗一次，并彻底吸除液体。</li>
	<li>向每个培养皿中加入少量含3 mM EDTA的PBS，6 cm培养皿建议加入0.5 mL。在22°C下孵育约5分钟以使细胞脱落，然后转移至15 mL圆锥形离心管中。</li>
	<li>以500 × g离心5分钟收集细胞，弃去上清液，并将细胞充分重悬于100 μL PBS中。</li>
	<li>边涡旋震荡边逐滴加入5 mL 95%乙醇（EtOH）固定细胞。此步骤后，细胞可在4°C下保存至少一个月。</li>
</ol>
2. BrdU 和 DNA 的变性与染色
<ol>
	<li>将细胞在 500 × g 条件下离心 5 分钟，以沉淀细胞并去除 95% 乙醇。通过逐滴加入并同时涡旋振荡，将细胞重悬于 1 mL 的 2N HCl 和 0.5% Tx-100 溶液中。室温孵育 30 分钟。</li>
	<li>按照第 2.1 节所述再次离心，并小心吸除上清液，因为此步骤中细胞形成的沉淀非常疏松。轻柔地将细胞重悬于 1 mL 的 0.1M NaB4O7（pH 8.5）溶液中，并在室温下孵育至少 30 分钟。</li>
	<li>如第 2.1 节所述再次沉淀细胞，并将细胞重悬于 0.5 mL 抗体溶液（含 1% BSA 和 0.2% Tween-20 的 PBS）中，其中加入已按 1:50 比例稀释的小鼠抗 BrdU 抗体。室温孵育 30 分钟。</li>
	<li>再次沉淀细胞，并将细胞重悬于 50 mL 含兔抗小鼠二抗（与 FITC 偶联）的抗体溶液中，二抗按 1:25 比例稀释。室温孵育 30 分钟，并避免光照。</li>
	<li>最后一次离心细胞，并将细胞重悬于 0.5 mL 碘化丙啶和 RNase 溶液（PI-RNase 溶液，含 1% BSA 的 PBS 溶液，10 mg/mL 碘化丙啶，0.25 mg/mL RNase A）中，在 37°C 黑暗条件下孵育 30 分钟。或者，可在 4°C 黑暗条件下过夜消化 RNA。</li>
	<li>将溶液通过细胞滤网以去除聚集体，并将单细胞收集至适合的管中，用于流式细胞仪上样。样品应再次避免直接暴露于光照下。</li>
</ol>
3. 流式细胞术分析
<ol>
	<li>应使用能够区分双联体（即两个细胞作为单个事件通过流动池）的标准流式细胞仪对细胞进行分析，并具备针对碘化丙啶和FITC的适当检测能力。在此流式细胞术应用中，可通过前向散射与侧向散射群体设门，结合碘化丙啶对DNA染色的特性，识别单个细胞。双联体区分点图的表现因流式细胞仪型号而异，依赖于碘化丙啶染色特性；有关如何设置双联体判别器，请咨询本地流式细胞术平台的技术支持。通常情况下，在异步增殖的细胞群体中，单个细胞在双联体区分图中表现为两个最显著的峰（2N和4N DNA含量），应围绕这两个峰设定门控区域。此门控将筛选出用于后续所有分析的单细胞事件。</li>
	<li>首先分析的样品应为异步增殖的细胞培养物，作为染色和流式细胞仪设置的阳性对照。调节光电倍增管对碘化丙啶染色的灵敏度，使单细胞产生的2N和4N峰在X轴上分别居于200和400（任意单位）处。我们通常会制备充足的此类细胞染色样本，以确保在不消耗正式样品的情况下完成流式细胞仪各项参数的优化。该阳性对照也有助于新用户熟悉流式细胞仪的操作。</li>
	<li>调节FITC检测通道的光电倍增管灵敏度，使G1期和G2/M期细胞群明显高于背景信号。BrdU阳性细胞的荧光强度应约为背景的10倍，Y轴应采用对数刻度显示。有时可设置BrdU染色的阴性对照（在上述步骤2.3中用非特异性IgG替代抗BrdU抗体），以更清晰地区分阳性染色细胞。</li>
	<li>调整碘化丙啶与FITC之间的补偿，使流式细胞仪捕获的单个事件在图中形成从左下角G1期经S期向上再转向右下角G2/M期的马蹄形弧线。有关流式细胞术原理及其应用的深入讨论，请参见以下参考文献2及其中引用的具体应用案例。</li>
</ol>
4. 数据分析
<ol>
	<li>为确保充分取样培养物中的细胞群体，每个样本应收集 5 000 至 10 000 个具有目标DNA含量范围的单细胞事件。</li>
	<li>在测定细胞的碘化丙啶和BrdU含量后，需将细胞分配至G1期、S期或G2/M期。可通过在BrdU阴性群体中绘制门控实现，分别以200和400为中心（对应G1期和G2/M期）。位于这两个门控上方的所有细胞应归入一个单独的门控，用于测定S期细胞（图1A）。各门控中的细胞百分比代表处于G1期、S期和G2/M期的细胞相对数量（图1B）。</li>
</ol>
5. 混合细胞群体中细胞周期分析的替代方案
<ol>
	<li>当表达载体的转染通常导致表达目标基因产物的细胞比例较低，或药物筛选纯细胞群体不可行时，本替代方案尤为有用。这种情况下，目标细胞仅占较小比例，且被大量未转导的细胞所污染。此时，可将表达目标基因或shRNA的质粒与另一种表达可用于流式细胞术检测转染细胞的标记物的质粒共转染，例如膜锚定型GFP3，或外源性细胞表面标记物如CD194或CD205。</li>
	<li>在本方案中，以CD20染色为例进行说明，但CD19染色的操作基本相同。若使用CD20进行转染，则无需进行BrdU标记，只需按照上述步骤1.2至1.5所述收集细胞，并在冰上避光条件下加入20 μL FITC标记的抗CD20抗体，孵育20分钟。随后按步骤1.6所述固定细胞。细胞可在4°C避光条件下保存至少一个月。若检测GFP，则省略本步骤中的抗体染色，直接按所述方法固定并保存细胞。</li>
	<li>将细胞在500 × g离心5分钟，沉淀后重悬于含1% BSA的5 mL PBS中，以重新水化细胞。</li>
	<li>再次在500 × g离心5分钟，收集细胞沉淀，并按上述第2.5节所述，重悬于0.5 mL碘化丙啶和RNase溶液中。</li>
	<li>继续按照第2.6节的细胞制备说明以及第3.1和3.2节的分析说明进行操作。</li>
	<li>调整光电倍增管对FITC检测的灵敏度，使未染色细胞信号高于背景。理想情况下，CD20-FITC阳性细胞的荧光强度应比背景高10至100倍，该图的Y轴应设为对数刻度（图2A）。应选择荧光强度比背景高10倍以上（且碘化丙啶染色信号介于200至400之间）的CD20阳性细胞，用于绘制碘化丙啶信号与细胞计数的直方图（如图2C所示）。对于表达易于强染色标记物的细胞系（即染色信号比背景高10至100倍），CD20阳性阈值应设为背景信号的10倍。纳入弱染色细胞会增加实验变异性，推测原因是这些细胞中目标基因的表达也较弱。对于仅产生弱CD20阳性信号的细胞系（即信号低于背景10倍），应使用未转染的CD20染色阴性对照细胞来确定阈值。</li>
	<li>每个样本应至少收集1000个CD20阳性事件。若事件数少于1000，将导致较高的变异性。ModFit LT（Verity Software）、Multi Cycle AV（Phoenix Flow Systems）和Flow Jo（Tree Star）等软件可通过数学模型估算G1、S和G2/M期细胞群体，从而拟合如图2B和2C所示的直方图曲线形态。</li>
</ol>
6. 代表性结果：
我们提供了使用本方法进行实验性细胞周期分析的三个示例。第一个示例是在小鼠胚胎成纤维细胞中通过逆转录病毒表达细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子 p27KIP1。在完成病毒感染的药物筛选后24小时，用 BrdU 对细胞进行一小时的脉冲标记。本实验中，通过异位表达该抑制因子使细胞增殖发生阻滞（图3A和3B）。如图3B所示，响应 p27 表达后，S期门控中几乎看不到 BrdU 阳性事件。同样，表达 p27 的细胞中处于S期的细胞比例也极低，如图3C所示。此类分析在表征来自不同基因靶向小鼠品系的细胞中细胞周期调控缺陷方面已非常有效6, 7, 8。
在第二次实验中，未转化的乳腺上皮细胞（MCF10A）用生长抑制性细胞因子转化生长因子β1（TGF-β1）处理24小时。在收获细胞前，立即用BrdU标记4小时。如图4所示，TGF-β1信号显著降低了S期细胞的BrdU标记，我们染色的特异性也通过IgG阴性对照得到验证（图4C）。对细胞周期不同阶段的定量分析证实，TGF-β1主要抑制细胞周期G1期的增殖，导致该阶段细胞的积累。
在我们的最后一个示例中，pRB缺陷的SaOS-2细胞被转染了CMV-CD20表达载体，并同时转染CMV-RB或作为对照的CMV-β-Gal。转染三天后收集细胞，进行染色和固定。这些细胞的流式细胞术分析结果如图5所示。该图展示了转染阴性对照细胞的细胞周期分布（图5A），并与转染后72小时表达pRB后的分布情况进行比较（图5B）。通过Multi Cycle软件进行曲线拟合后，细胞周期各时相比例的直接比较结果如图5C所示。结果显示，在pRB表达后，细胞在G1期发生积聚，同时S期和G2/M期的细胞相对减少。我们已广泛使用该检测方法的不同变体来深入研究G1期阻滞机制9, 10, 11, 13。
这些示例展示了如何在多种刺激或细胞操作条件下测量细胞周期调控。因此，该方法可适用于多种需要在培养类实验中测定细胞周期时相的应用场景。
<img alt="细胞周期分析：BrdU-FITC 与碘化丙啶的散点图，细胞周期各时相百分比的柱状图。" src="/files/ftp_upload/3491/3491fig1.jpg" data-altupdatedat="1761809329000" data-alt="Figure 1"> 
图1. 通过碘化丙啶与BrdU联合染色（PI-BrdU）对细胞周期各时相进行定量分析。（A）该图显示经碘化丙啶和BrdU染色细胞的三维流式细胞术图谱。注意，具有2N和4N DNA含量的细胞在X轴碘化丙啶染色强度标度上的200和400标记处居中。BrdU染色强度在Y轴上以对数尺度测量。注意用于定量细胞周期G1、S和G2/M时相细胞的门控位置。（B）本图显示来自（A）中G1、S和G2/M门控内细胞的相对比例。
<img alt="流式细胞术示意图；CD20、pRB转染分析；细胞计数与碘化丙啶图谱。" src="/files/ftp_upload/3491/3491fig2.jpg" data-altupdatedat="1761809329000" data-alt="图 2"> 
图 2. 利用碘化丙啶和细胞表面标志物CD20对选定细胞的细胞周期各时相进行定量分析。（A）该图显示了混合细胞中碘化丙啶与CD20染色情况，其中部分细胞异位表达CD20和pRB。注意，具有2N和4N DNA含量的细胞（最丰富的群体）在X轴上分别集中在200和400标记处。CD20阳性门控的位置选择的是染色强度至少比背景高10倍的细胞。（B）图中显示了A图中CD20阴性、处于异步增殖状态的细胞的细胞计数与碘化丙啶染色强度的关系图。（C）图中显示了A图中CD20阳性、通过pRB表达被诱导发生周期阻滞的细胞，其主要含有2N DNA含量的细胞。该结果表明，利用此染色技术可将发生周期阻滞的亚群与其他细胞区分开来。
<img alt="流式细胞术图谱；BrdU-FITC 对 碘化丙啶；细胞周期分析；数据比较。" src="/files/ftp_upload/3491/3491fig3.jpg" data-altupdatedat="1761809329000" data-alt="图 3"> 
图 3. p27KIP1 对细胞增殖的抑制作用。（A）采用 PI-BrdU 分析法检测经空载 pBABE 逆转录病毒载体转导的异步增殖细胞群体中的细胞周期时相。（B）经 pBABE-p27 载体转导细胞的类似分析。注意 S 期细胞缺失，且 G1 期和 G2/M 期门控内事件信号强度增加。（C）对异步增殖的对照细胞与表达 p27 的细胞在细胞周期各时相中细胞数量的定量分析。
<img alt="BrdU-FITC、碘化丙啶的流式细胞术图谱；未处理组和TGF-β1处理组的细胞周期分析。" src="/files/ftp_upload/3491/3491fig4.jpg" data-altupdatedat="1761809329000" data-alt="图4"> 
图4. TGF-β1对细胞增殖的抑制作用。（A）异步增殖的MCF10A细胞的PI-BrdU分析。（B）经100 pM TGF-β1处理24小时后的细胞分析。注意细胞主要在细胞周期的G1期发生积累。（C）通过在异步增殖细胞中将抗BrdU一抗替换为非特异性IgG对照，验证BrdU染色的特异性。（D）对（A）和（B）中各细胞周期时相的图形化定量分析。
<img alt="显示CD20+ β-半乳糖苷酶和pRB转染细胞的碘化丙啶染色、细胞计数及细胞周期各时相的细胞周期分析图" src="/files/ftp_upload/3491/3491fig5.jpg" data-altupdatedat="1761809329000" data-alt="图5"> 
图5. pRB对细胞增殖的抑制作用。（A）显示CD20和β-半乳糖苷酶（ß-gal）转染细胞的细胞计数与碘化丙啶染色结果。此对照实验至关重要，因为转染过程可能部分同步化细胞，导致未转染细胞群（CD20阴性细胞）不适合作为转染亚群的对照；转染细胞应与其他同样经过转染的细胞进行比较。（B）CD20和pRB转染细胞的细胞计数与碘化丙啶染色图。注意图中几乎仅出现一个2N峰。（C）利用Multi Cycle软件中的曲线拟合方法，根据A和B图数据得出的细胞周期各时相比例的图示。

<ol><li>Dolbeare, F., Gratzner, H., Pallavicini, M. G., Gray, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometric+measurement+of+total+DNA+content+and+incorporated+bromodeoxyuridine%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Flow cytometric measurement of total DNA content and incorporated bromodeoxyuridine.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 80, 5573-5573 (1983).</li>
<li>Givan, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometry%3A+an+introduction%5BTitle%5D)+AND+%22Methods.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Flow cytometry: an introduction.</a> Methods. Mol. Biol. 699, 1-1 (2011).</li>
<li>Kalejta, R. F., Brideau, A. D., Banfield, B. W., Beavis, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+integral+membrane+green+fluorescent+protein+marker%2C+Us9-GFP%2C+is+quantitatively+retained+in+cells+during+propidium+iodide-based+cell+cycle+analysis+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Cell.+Res%22%5BJournal%5D)">An integral membrane green fluorescent protein marker, Us9-GFP, is quantitatively retained in cells during propidium iodide-based cell cycle analysis by flow cytometry.</a> J. Exp. Cell. Res. 248, 322-322 (1999).</li>
<li>Qin, X. -Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+transcription+factor+E2F-1+is+a+downstream+target+of+RB+action%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">The transcription factor E2F-1 is a downstream target of RB action.</a> Molecular and Cellular Biology. 15, 742-742 (1995).</li>
<li>van den Heuvel, S., Harlow, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+roles+for+cyclin-dependent+kinases+in+cell+cycle+control%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Distinct roles for cyclin-dependent kinases in cell cycle control.</a> Science. 262, 2050-2050 ( ).</li>
<li>Henley, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cancer+derived+mutation+in+the+retinoblastoma+gene+with+a+distinct+defect+for+LXCXE+dependent+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell.+Int%22%5BJournal%5D)">A cancer derived mutation in the retinoblastoma gene with a distinct defect for LXCXE dependent interactions.</a> Cancer Cell. Int. 10, 8-8 (2010).</li>
<li>Francis, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+functional+connection+between+pRB+and+transforming+growth+factor+beta+in+growth+inhibition+and+mammary+gland+development%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">A functional connection between pRB and transforming growth factor beta in growth inhibition and mammary gland development.</a> Mol. Cell. Biol. 29, 4455-4455 (2009).</li>
<li>Isaac, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+retinoblastoma+protein+regulates+pericentric+heterochromatin%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">The retinoblastoma protein regulates pericentric heterochromatin.</a> Mol. Cell. Biol. 26, 3659-3659 (2006).</li>
<li>Julian, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+an+E2F1-specific+binding+domain+in+pRB+and+its+implications+for+apoptotic+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Characterization of an E2F1-specific binding domain in pRB and its implications for apoptotic regulation.</a> Oncogene. 27, 1572-1572 (2008).</li>
<li>Hirschi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+overlapping+kinase+and+phosphatase+docking+site+regulates+activity+of+the+retinoblastoma+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Struct.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">An overlapping kinase and phosphatase docking site regulates activity of the retinoblastoma protein.</a> Nat. Struct. Mol. Biol. 17, 1051-1051 (2010).</li>
<li>Dick, F. A., Dyson, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((pRB+contains+an+E2F1-specific+binding+domain+that+allows+E2F1-induced+apoptosis+to+be+regulated+separately+from+other+E2F+activities%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell%22%5BJournal%5D)">pRB contains an E2F1-specific binding domain that allows E2F1-induced apoptosis to be regulated separately from other E2F activities.</a> Mol. Cell. 12, 639-639 (2003).</li>
<li>Dick, F. A., Sailhamer, E., Dyson, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutagenesis+of+the+pRB+pocket+reveals+that+cell+cycle+arrest+functions+are+separable+from+binding+to+viral+oncoproteins%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Mutagenesis of the pRB pocket reveals that cell cycle arrest functions are separable from binding to viral oncoproteins.</a> Mol. Cell. Biol. 20, 3715-3715 (2000).</li>
<li>Dick, F. A., Dyson, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three+regions+of+the+pRB+pocket+domain+affect+its+inactivation+by+human+papillomavirus+E7+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Three regions of the pRB pocket domain affect its inactivation by human papillomavirus E7 proteins.</a> J. Virol. 76, 6224-6224 (2002).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

根据我们的经验，这些技术的成功应用依赖于几个关键的对照和实验条件。其中之一是建立一个异步增殖的对照样本，用于这些实验。该对照具有三个重要作用：首先，它确保所有实验样本所使用的培养条件在无处理情况下足以支持细胞持续增殖；其次，该样本作为染色方法的阳性对照，以确认当存在 BrdU 或 CD20 阳性细胞时能够被有效检测；最后，该样本用于校准流式细胞仪。通过该对照样本，可调节碘化丙啶（propidium iodide）的染色强度，使 2N 和 4N 细胞的信号分别出现在 200 和 400 处。此外，还可调整 BrdU 或 CD20 的检测灵敏度，使阴性和阳性信号的分布如图 1A 和 2A 所示居中分布。当所有样本在 PI-RNase 溶液中的细胞浓度相近时，在后续样本检测过程中对细胞仪的调整将大大减少。这一点尤为重要，如图 4B 和 5B 所示，强烈的 G1 期积累会形成一个几乎单一的 G1 峰，可能被误判为 G2/M 期。
代表性实验还说明了其他重要问题。首先，它们表明不同细胞类型的 BrdU 摄取和标记效果可能存在差异。因此，必须通过实验确定合适的脉冲时长和染色条件，以充分检测处于 S 期的细胞。一般来说，在培养中增殖时间不超过 24 小时的细胞类型，可在 1 小时内完成 BrdU 标记。生长较慢的细胞类型则可能需要更长的脉冲时间，并调整抗体染色的浓度和时长。MCF10A 细胞便是一个很好的例子：该细胞系使用 BrdU 标记 4 小时，并以两倍标准浓度的抗体染色，且染色时间延长至常规的四倍。即使对于生长极为缓慢的细胞，也应避免 BrdU 标记超过 6 小时，否则可能导致 G2/M 期细胞被错误地归入 S 期群体。其次，在比较 p27KIP1 表达与 TGF-β1 作用效果时可以明显看出，p27 可诱导细胞在 G1 期或 G2/M 期发生周期阻滞，而 TGF-β1 信号通路仅引起 G1 期阻滞。传统的增殖检测方法，如 3H-胸腺嘧啶掺入结合闪烁计数法，无法区分这两种情况。
在我们的替代方案中，我们展示了在较大的未转染细胞群体中检测转染细胞亚群的方法。确定最适合检测转染细胞的报告分子需通过实验经验进行优化。根据我们的经验，某些细胞类型对细胞表面标志物的表达较弱，或者可能&prime;无法将它们正确转运至质膜，导致难以检测转染的细胞。同样，并非所有细胞都能耐受膜结合形式的GFP。应通过评估报告基因的转染效率以及相对于未转染对照组的表达强度来选择最合适的报告分子。理想情况下，这些分子的异源表达应被细胞良好耐受，这表明标记物对细胞周期分布几乎没有或完全没有影响。
这类流式细胞术方法的一个局限性在于，它们仅能确定不同细胞周期时相之间的相对丰度。因此，图3中p27的表达究竟是真正诱导了G1期和G2/M期的阻滞，还是仅仅相对于S期减缓了细胞通过这些时相的进程，目前尚不明确。这些可能性可通过使用有丝分裂抑制剂（如诺考达唑）或G1/S期抑制剂（如阿非迪霉素）处理另一组平行样本细胞进一步探究。由于这些药物分别在M期或早期S期产生主导性阻滞，增殖缓慢的细胞将在药物诱导的阻滞点处累积。例如，因pRB表达而在G1期被阻滞的细胞即使在诺考达唑处理下仍会停留在G1期，而对照组细胞则会在M期累积13。
综上所述，这些实验方法提供了一种灵活的技术体系，可广泛应用于多种哺乳动物细胞周期的研究问题。该方法能够快速检测细胞周期进程中的变化，并在与对照组比较时对差异进行定量分析。

<table><tbody><tr><td>细胞增殖标记试剂</td><td>GE Healthcare</td><td>RPN201</td><td></td></tr><tr><td>抗 BrdU 抗体</td><td>BD Biosciences</td><td>347580</td><td></td></tr><tr><td>抗小鼠 FITC 标记抗体</td><td>Vector Laboratories</td><td>FI-2000</td><td></td></tr><tr><td>细胞滤网</td><td>BD Biosciences</td><td>352235</td><td></td></tr><tr><td>抗 CD20 抗体</td><td>BD Biosciences</td><td>347673</td><td></td></tr><tr><td>Multi Cycle 软件</td><td>Phoenix Flow Systems</td><td>N/A</td><td></td></tr></tbody></table>

哺乳动物细胞周期位置分析

Analysis of Cell Cycle Position in Mammalian Cells

细胞增殖的调控在多细胞生物发育过程中的组织形态发生中起着核心作用。此外，细胞增殖失控是癌症等疾病发生病理机制的基础。因此，迫切需要能够研究细胞增殖，并定量分析细胞周期各时相中细胞所占比例的方法。在较大细胞群体中无差别地识别正在进行DNA复制的细胞也至关重要。由于一个细胞&prime;细胞是否增殖的决定发生在G1期，即在启动DNA合成并进入细胞周期后续阶段之前。因此，在此阶段检测DNA合成情况，可明确判断细胞培养实验中生长调控的状态。
通过碘化丙啶（一种荧光性DNA嵌入染料）染色后进行流式细胞术，可轻松定量细胞中的DNA含量。类似地，通过在放射性胸腺嘧啶存在下培养细胞，收集细胞并测量放射性掺入酸不溶性组分的程度，可定量检测活跃的DNA合成。我们在细胞周期分析方面具有丰富经验，并推荐采用另一种方法。我们使用溴脱氧尿苷/氟脱氧尿苷（简称为BrdU）染色法来研究细胞增殖，该方法可检测这些胸腺嘧啶类似物掺入新合成DNA的过程。利用BrdU对细胞进行标记和染色，结合碘化丙啶进行总DNA染色，并通过流式细胞术分析1，可最准确地测定处于细胞周期各阶段的细胞比例。这是我们首选的方法，因为它将基于抗体的BrdU染色所检测到的活跃DNA合成与碘化丙啶提供的总DNA含量信息相结合。这种方法能够清晰区分G1期与早期S期细胞，以及晚期S期与G2/M期细胞。此外，该方法还可用于研究多种不同细胞刺激因子和药理学试剂对细胞周期各阶段进程调控的影响。
在本报告中，我们描述了对培养细胞进行标记和染色的方法，并介绍了如何通过流式细胞术对其进行分析。我们还提供了实验示例，说明该方法可用于检测细胞因子（如TGF-β1）产生的生长抑制信号以及增殖抑制剂（如细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂p27KIP1）的作用效果。此外，我们还提供了一种替代方案，可用于在较大细胞群体中对特定亚群细胞的细胞周期位置进行分析5。在此情况下，我们展示了即使在转染了视网膜母细胞瘤基因的细胞被大量未转染细胞包围的情况下，如何检测其细胞周期阻滞现象。这些示例阐明了DNA染色与流式细胞术在研究哺乳动物细胞周期调控基本问题时的多种应用方式和适应性。

通过本方案，利用流式细胞术可轻松测定细胞群体的细胞周期位置，或了解信号如何影响细胞增殖。我们报告了一种简单的实验方法，用于对细胞进行染色并定量分析其在细胞周期中的位置。

细胞增殖的调控在多细胞生物发育过程中的组织形态发生中起着核心作用。此外，增殖控制的失调……

本实验的目的是确定细胞在细胞周期不同阶段所占的比例。首先将细胞增殖标记试剂BRDU加入活细胞培养物中，使其掺入新合成的DNA；随后对已掺入该试剂的细胞中的BRDU进行染色，再用碘化丙啶对DNA进行染色。最后通过流式细胞术分析细胞在细胞周期各阶段的比例。最终，通过流式细胞术分析BrdU标记的细胞，可以直观地观察实验细胞群体的细胞周期分布。与现有的胸腺嘧啶掺入法和闪烁计数法相比，该技术的主要优势在于，利用BrdU标记可确定处于各细胞周期时相的细胞比例。直观展示这一过程至关重要，因为流式细胞术分析步骤若无相应图像辅助说明所需调节的不同参数，则难以清晰解释。演示该实验步骤的是我实验室的两名研究生，Matt Chii 和我本人 Miri。向实验组细胞培养物中加入 BrdU，按 1:1000 稀释，孵育一小时后收集细胞，吸除培养基，然后用 PBS 彻底洗涤细胞两次，以去除所有残留的培养基。此时使用含有 3 mmol/L EDTA 的 PBS，快速冲洗一次，随后彻底吸除 PBS-EDTA 溶液，以使细胞脱落。向每个六厘米的培养皿中加入约 0.5 毫升 PBS-EDTA，并在 22 摄氏度下孵育约五分钟。然后将每块培养板中的细胞培养物转移至各自的 15 毫升锥形管中。现在于室温下以 500 × g 离心五分钟，随后弃去上清液，再将细胞重悬于 100 微升 PBS 中。最后，通过在涡旋振荡的同时逐滴加入5 mL 95%乙醇固定细胞，然后在室温下以500 × g离心5分钟。再次去除乙醇，并将沉淀重悬于1 mL含0.5% Triton X-100的2 N HCl中，逐滴加入溶液并同时涡旋振荡，随后在室温下孵育30分钟。再次离心收集细胞沉淀后，小心吸除上清液，此步骤中细胞形成的沉淀非常疏松，需特别注意操作。然后将沉淀物轻轻重悬于1毫升0.1摩尔的四硼酸钠溶液中，并再次孵育细胞。现在再次离心收集细胞沉淀，此次将细胞沉淀置于含有鼠抗BRDU抗体（按1:50稀释）的0.5毫升抗体溶液中孵育。再次离心收集细胞后，将该沉淀物重悬于50微升含有兔抗US ZI标记的二抗抗体溶液（按1:25稀释）中。然后将细胞在室温下避光孵育30分钟。最后一次离心细胞后，在37摄氏度避光条件下，用0.5毫升碘化丙啶和RNA溶液孵育细胞30分钟。最后，将消化后的细胞溶液通过细胞筛网过滤，以去除细胞团块。然后将单细胞转移至合适的试管中，用于流式细胞仪对异步增殖细胞群体（如图所示）进行样本上样。在此示例中，在双峰鉴别图中对两个丰度最高的峰设置门控，以选择所有后续分析中的单细胞事件。随后分析一个异步增殖的培养样本，作为染色及流式细胞仪参数设置的阳性对照。调整光电倍增管对碘化丙啶染色的灵敏度，使单细胞的二倍体（2N）和四倍体（4N）峰在x轴上分别位于任意单位200和400处。接着，调整FXI检测用光电倍增管的灵敏度，使FXI阴性细胞的信号高于背景水平。BrdU阳性细胞的荧光强度应约为背景的10倍，且x轴应以对数刻度显示。流式细胞仪捕获的单个事件从左下角的G1期开始，经S期，再回到右下角的G2/M期，形成马蹄形弧线。如本代表性图示所示，采集5,000至10,000个单细胞事件，以获得理想的DNA含量范围。在测定碘化丙啶和BrdU含量后，通过在两个BrdU阴性群体周围设置门控，将细胞分配至G1、S或G2/M期，其中G1期中心位于200，G2/M期中心位于400。将这两个门控上方的所有事件纳入一个单独的门控中用于测定S期，各门控中的细胞百分比将代表处于G1、S和G2/M期的细胞相对数量，如本柱状图所示，对应于前述散点图的结果。在此示例中，对感兴趣的细胞标志物（如 CD20）染色后，于 22°C 下以 500 × g 离心 10 分钟，然后将细胞沉淀重悬于 5 毫升含 1% BSA 的 PBS 中。再次于室温下以 500 × g 离心 5 分钟收集细胞沉淀后，使用 0.5 毫升碘化丙啶和 RNA 溶液重悬细胞。随后按照前述方法进行染色和消化，设门圈选二倍体和四倍体的单细胞峰，并调整光电倍增管的灵敏度以检测 FXI，使未染色细胞的信号高于背景水平。理想情况下，CD 20 FXI 阳性细胞的染色强度应比背景高 10 至 100 倍。同样，x 轴应以对数刻度显示。最后，选择比背景水平亮 10 倍且碘化丙啶染色强度在 200 至 400 之间的 CD 20 阳性细胞，将其呈现在碘化丙啶 versus 细胞计数的直方图中（如本示例图所示），每个样本至少收集 1000 个 CD 20 阳性事件，以减少该图中的变异性。显示了碘化丙啶和BrdU染色细胞的三维流式细胞术分析结果。请注意，具有2n和4n DNA含量的细胞在X轴上分别位于200和400标记处。碘化丙啶染色强度和BrdU染色强度均按对数尺度测量。在 Y 轴上，注意用于定量细胞周期 G1 期和 G2/M 期细胞的门控位置。此处显示了上图中 G1 期和 G2/M 期门控内细胞的相对比例。此处为碘化丙啶、碘化物和 CD20。显示了混合细胞的染色结果，其中部分细胞异位表达了CD 20和PRB。请注意，含有两个n和四个NDNA的最丰富的细胞群体在x轴上200和400标记处居中。CD 20阳性门控选择的细胞其染色强度至少比背景高10倍。该直方图显示了细胞计数与碘化丙啶染色的关系，其中 CD20 阴性细胞来自此前的散点图，这些细胞在此直方图中呈异步增殖状态；而 CD20 阳性细胞则来自先前的 CD20 散点图，在表达 pRb 后被诱导发生细胞周期阻滞，主要含有二倍体 DNA 含量的细胞。这些数据表明，利用该染色技术可将发生阻滞的亚群与其他培养细胞区分开来。在接下来的三幅图中，展示了利用流式细胞术分析小鼠胚胎成纤维细胞中逆转录病毒介导的细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子 P27KIP1 表达的数据。使用碘化丙啶和BrdU分析来检测经空载P babe逆转录病毒载体转导的异步增殖细胞群体的细胞周期时相，结果如图所示。在P27作用下，S期门控中可见的BrdU阳性事件较少。同时注意G1期以及G2/M期门控中事件信号强度更高。同样，如本图所示，表达 P27 的细胞中处于 S 期的细胞比例相当低。此类分析在表征来自不同基因靶向小鼠品系的细胞周期调控缺陷方面非常有效。在接下来的两幅图中，未成熟的记忆上皮细胞用生长抑制性细胞因子 TGF-β1 处理 24 小时。如第一幅图所示，S期细胞中的BrdU标记因TGF-β1信号而显著减少。注意细胞主要在细胞周期的G1期积聚，如中间图所示。对细胞周期各时相的定量分析证实，TGF-β1主要抑制细胞周期G1期的增殖，从而导致细胞在该时相积聚。在本系列实验分析中，将CMV CD20表达载体以及CMV RB或作为对照的CMV β-GAL分别转染至PRB缺陷的SAS两种细胞中。本图首先展示了转染阴性对照细胞的细胞周期分布情况，并与转染后72小时PRB表达情况下的分布进行比较。请注意，在最终图的右侧图谱中几乎仅出现一个2N峰，通过多周期软件进行曲线拟合分析表明，细胞在PRB表达后主要积聚于G1期。尽管处于S期和G2/M期的细胞群体相对较少。一旦掌握，该技术可被调整用于研究其他细胞周期标志物，例如mph时期的磷酸化组蛋白。观看本视频后，您应能充分理解如何确定细胞群体的细胞周期分布。请注意，两种正常盐酸具有腐蚀性，碘化丙啶为潜在致癌物，可能造成危害。使用这些化学品时应始终采取预防措施。

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科研

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Biology

生物学

在哺乳动物细胞中细胞周期位置分析

通过联合使用BrdU对核酸进行代谢标记以及碘化丙啶对总基因组DNA染色，可实现对细胞周期各阶段进展及动力学的细微变化进行追踪。该方法无需对增殖细胞进行化学同步化处理，从而避免了非特异性DNA损伤的引入，进而防止对细胞周期进程造成影响。...

利用代谢标记与流式细胞术测量细胞周期进程动力学

从中期到后期的转变是通过后期促进复合物（APC/C）依赖性的泛素化作用以及随之发生的细胞周期蛋白B的降解所触发的。在此，我们建立了一个系统，该系统在脉冲-追踪标记后，可监测整个细胞群体中细胞周期蛋白B的蛋白水解过程，并有助于检测有丝分裂检查点的干扰作用。...

在全细胞群体中于单细胞水平研究细胞周期蛋白B的蛋白水解

细胞周期分析：研究miRNA转染肺癌细胞中细胞周期调控的方法

本方案描述了利用溴脱氧尿苷（BrdU）掺入来追踪在特定时间点处于S期的细胞的时序动态。通过添加DNA染料和抗体标记，可对S期细胞在后续时间点的命运进行详细分析。...

利用流式细胞术对细胞周期进程进行时间追踪而无需同步化处理

我们报告了两种细胞同步化方案，可为研究细胞周期特定阶段的相关事件提供背景。我们证明，该方法可用于分析在未受干扰的细胞周期中或在暴露于影响细胞周期的试剂时，特定基因的调控情况。...

通过两种互补的细胞同步化方案研究细胞周期调控的基因表达

我们介绍一种用于HeLa细胞的双胸苷同步化方案，随后利用高分辨率共聚焦显微镜进行分析。该方法对于获得大量同步从S期进入有丝分裂期的细胞至关重要，从而能够研究兼具间期功能的多功能蛋白在有丝分裂中的作用。...

结合有丝分裂细胞同步化与高分辨率共聚焦显微镜技术研究多功能细胞周期蛋白在有丝分裂过程中的作用

本文描述了一种基于成像的方法，可用于利用胸苷类似物EdU鉴定秀丽隐杆线虫（C.

细胞周期分析在 秀丽隐杆线虫 使用胸苷类似物EdU标记生殖系

本方案描述了如何从小鼠模型中分离皮肤角质形成细胞，使用金属标记抗体进行染色，并通过质谱流式细胞术分析染色后的细胞，以表征目标蛋白在不同细胞周期阶段中的表达模式。...

用于质谱流式细胞术进行细胞周期特异性细胞蛋白表达分析的小鼠皮肤角质形成细胞的分离与染色

本方案详细介绍了两种酵母细胞周期阻滞及可选释放的方法，并阐述了如何利用荧光显微镜研究酿酒酵母（S.

芽殖酵母中细胞周期依赖性过程的操作与分析

使用宽场显微镜对哺乳动物细胞进行长期成像

学习使用流式细胞术和BRDU标记分析哺乳动物细胞周期分布的方法。本方案通过碘化丙啶染色定量检测G1、S和G2/M期细胞比例，为研究细胞增殖调控提供可靠数据。

哺乳动物细胞周期位置分析

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