在哺乳动物细胞中细胞周期位置分析
2012年1月21日
确定的人口细胞的细胞周期的位置，或理解信号是如何影响扩散，可以很容易地通过使用此协议的流流式细胞仪测量。我们报告一个简单的实验方法，染色细胞和量化其在细胞周期中的位置。
该程序的目的是能够确定细胞周期不同阶段的细胞比例。这是通过首先将细胞增殖标记试剂 BRDU 添加到活细胞培养物中以掺入新合成的 DNA 中来实现的，接下来染色，在掺入试剂的细胞中加入 BRDU，然后用碘化丙啶对 DNA 进行染色。最后一步是通过流式细胞术评估细胞周期不同阶段的细胞比例。
最终，可以通过对 BRDU 标记细胞进行流式细胞术分析来可视化实验细胞群的细胞周期分布。与现有方法（如 tri 到百里香掺入和闪烁计数）相比，该技术的主要优点是，通过 BRD 标记，可以确定每个细胞周期阶段的细胞比例。该信息的视觉演示至关重要，因为如果没有需要调整的不同参数的伴随图像，则很难解释其他细胞计数分析集。
演示该程序的是我实验室的两名研究生 Matt Chii 和 me Miri。将 BRDU 以 1 比 1000 的稀释度添加到实验细胞培养物中，孵育 1 小时以收获细胞，吸出培养基，然后用 PBS 彻底洗涤细胞两次，以去除所有痕量培养基。这次使用补充有 3 毫摩尔 EDTA 的 PBS，再次快速冲洗培养物，然后彻底吸出 P-B-S-E-D-T-A 溶液以分离细胞。
向每个 6 厘米的培养皿中加入约 0.5 毫升的 P-B-S-E-D-T-A，并在 22 摄氏度下孵育培养皿约 5 分钟。然后将细胞培养物从每个板转移到单独的 15 ml 锥形管中。现在，在室温下以 500 倍重力离心细胞 5 分钟，然后去除腌芽物，然后将细胞重悬于 100 μL PBS 中。
最后，滴加 5 毫升 95% 乙醇，同时涡旋，以 500 倍重力离心细胞，室温下放置 5 分钟，以此来固定细胞。再次去除乙醇，在涡旋时以滴加方式将溶液加入细胞中，将沉淀重新悬浮在一毫升含有 0.5%Triton X 100 的两种正常 HCL 中，然后在室温下孵育细胞 30 分钟。沉淀后，细胞再次吸出 S 上清液，要特别小心，因为细胞在此步骤中会形成非常松散的沉淀。
然后以 1 毫升 0.1 摩尔四钠孔径速率轻轻重新悬浮沉淀，并再次孵育细胞。现在再次沉淀细胞，这次将它们在 0.5 毫升含有小鼠抗 BRDU 抗体的抗体溶液中孵育，在再次沉淀细胞后稀释 1 至 50 粒。将此沉淀悬浮在 50 μL 抗体溶液中，该溶液含有兔抗 US ZI 偶联的二抗，稀释 1 至 25。
然后将细胞在室温下避光孵育 30 分钟。最后一次离心细胞后，将它们放入 0.5 毫升碘化丙啶和 RNA 溶液中，在 37 摄氏度的黑暗中孵育 30 分钟。最后，将消化的细胞溶液通过细胞过滤器以去除聚集体。
然后将单细胞转移到合适的试管中，以便在流式细胞仪上摄取样品，以异步增殖细胞群，如图所示。在此示例中，在双峰鉴别图中的两个最丰度的峰周围放置一个门，以选择单个细胞事件进行所有后续分析。然后分析异步增殖的培养样品，作为染色和流式细胞仪参数设置的阳性对照。
调整光电倍增管对碘化丙啶染色的灵敏度，使来自单个细胞的两个 N 和四个 N 峰在 x 轴上以 200 和 400 的任意单位为中心。接下来，调整 FXI 检测光电倍增管的灵敏度，使 FXI 负细胞高于背景水平。BRDU 阳性细胞的亮度应提高约 10 倍，x 轴应显示为对数刻度。
流式细胞仪捕获的单个事件形成马蹄形弧，从左下角的 G 一相一直到 S 期，然后又回到右下角的 G 两期 M 期。如此代表性图所示，收集 5， 000 至 10， 000 个单细胞事件，以达到所需的 DNA 含量范围。在测量碘化丙啶和 BRDU 含量后，将细胞分配到 G 1 s 或 G 2 MPH 期，两个 BRDU 阴性群体周围的门以 G 1 的 200 和 G 2 M 的 400 为中心，将这两个框上方的所有事件包含在一个门中，用于测量 S 期， 每个门中单元的百分比将代表 G 1 s 和 G 2 M 期中的单元的相对数量，如上一个散点图的条形图所示。
在本例中，CD 20 对感兴趣的细胞标志物进行染色后，在 22 摄氏度下以 500 倍重力离心细胞 10 分钟，然后将沉淀重悬于 5 毫升补充有 1% BSA 的 PBS 中。在室温下以 500 倍重力再次沉淀细胞 5 分钟后，使用 0.5 毫升碘化丙啶和 RNA 溶液为细胞再水化。然后像刚才所示对细胞进行染色和消化，对两个 n 和四个末端单细胞峰进行门控，然后调整光电倍增管的灵敏度以进行 FXI 检测，使未染色的细胞高于背景水平。
理想情况下，CD 20 FXI 阳性细胞的染色强度是背景细胞的 10 到 100 倍。同样，x 轴应显示为对数刻度。最后，选择比背景水平亮 10 倍且碘化丙啶染色在 200 到 400 之间的 CD 20 阳性细胞，以碘化丙啶与细胞计数直方图显示，如本样品图所示，每个样品至少收集 1000 个 CD 20 阳性事件，以限制该图中的可变性。
显示了碘化丙啶和 BRDU 染色细胞的三维流式细胞术分析。请注意，具有 2 个 n 和 4 个 NDNA 内容的单元格在 X 轴刻度上的 200 和 400 标记上居中。对于碘化丙啶染色强度，BRDU 染色强度以对数刻度测量。
在 Y 轴上，注意用于定量细胞周期的 G 1 s 和 G 2 M 期细胞的门的位置。此处显示了上图中每个 G 1 s 和 G 2 M 门中单元的相对比例。这里是丙啶、碘化物和 CD 20。
显示了细胞混合物的染色，其中一些细胞异位表达 CD 20 和 PRB。请注意，具有 2 个 n 和 4 个 NDNA 的细胞是最丰富的群体，以 x 轴上的 200 和 400 标记为中心。CD 20 阳性步态的位置选择染色亮度至少是背景 10 倍的细胞。
该直方图表示先前散点图中异步增殖的 CD 20 阴性细胞的细胞计数与碘化丙啶染色，在此直方图中显示了来自早期 CD 20 散点图的 CD 20 阳性细胞，这些细胞已被诱导以 p rrb 表达阻滞，并且包含主要具有两种 NDNA 含量的细胞。这些数据表明，使用这种染色技术可以将停滞的亚群与培养物中的其他细胞区分开来。在接下来的三个图中，细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂 P 27 KIP one 在小鼠胚胎成纤维细胞中逆转录病毒表达的流式细胞术分析数据如下所示。
碘化丙啶 BRDU 分析用于测量用空 P babe 逆转录病毒载体转导的异步增殖细胞群中的细胞周期阶段，如图所示。响应 P 27 的 S 期门中很少有明显的 BRDU 阳性事件。还要注意 G 1 和 G 两个 M 门中事件的强度更大。
同样，表达 P 27 的细胞的 S 期细胞百分比相当低，如图所示。这种类型的分析在表征来自各种基因靶向小鼠品系的细胞中的细胞周期控制缺陷方面非常有效。在接下来的两个图中，未形成的记忆上皮细胞用生长抑制细胞因子 TGF β 1 处理 24 小时。
如第一张图所示，S 期细胞中的 BRDU 标记被 TGF β 1 信号转导大大削弱。请注意细胞的积累主要在细胞周期的 G 一期，如中间面板所示。细胞周期不同阶段的定量证实，TGF β 1 主要抑制细胞周期 G 1 阶段的增殖，导致该阶段的积累。
在最后这一系列实验分析中，PRB 缺陷的 SAS 两个细胞转染了 CMV CD 20 表达载体和 CMV RB 或 CMV β GAL 作为对照。第一个图展示了阴性对照转染细胞的细胞周期分布与其在 PRB 表达 72 小时后的分布的比较。请注意，在通过多周期软件拟合的最终图形曲线拟合中，右侧面板几乎完全存在两个 N 峰，这表明细胞在 PRB 表达后主要在 G 一期积累。
而 s 和 G 两个 M 期的种群相对枯竭。一旦掌握，该技术就可以用于研究其他细胞周期标志物，例如以 mph 为单位的磷酸化组蛋白。观看此视频后，您应该对如何确定细胞群的细胞周期分布有很好的了解。
不要忘记两种正常的盐酸是苛性碱和丙啶。碘化物是一种潜在的致癌物。他们可能是危险的。
使用这些化学品时应始终采取预防措施。
概述
该协议概述了一种使用流式细胞术确定细胞群体细胞周期位置的方法。它涉及用BRDU和碘化丙啶对细胞进行染色，以量化它们在不同细胞周期阶段的分布。
关键研究组成部分
科学领域
- 细胞生物学
- 流式细胞术
- 细胞周期分析
背景
- 理解细胞周期阶段对于研究细胞增殖至关重要。
- 流式细胞术提供了一种分析细胞周期分布的定量方法。
- BRDU掺入允许识别S期的细胞。
- 碘化丙啶染色使得能够评估细胞中的DNA含量。
研究目的
- 开发一个分析细胞周期阶段的简单协议。
- 提高细胞周期分布测量的准确性。
- 通过流式细胞术提供细胞周期分析的视觉表示。
使用的方法
- 用BRDU标记细胞，以检测DNA合成。
- 使用碘化丙啶染色DNA，进行流式细胞术分析。
- 处理和分析细胞以确定其细胞周期阶段。
- 调整流式细胞术参数以最佳检测细胞群体。
主要结果
- 该协议允许可视化细胞周期分布。
- 精确量化G1、S和G2/M期的细胞。
- BRDU标记增强了增殖细胞的检测。
- 流式细胞术分析提供了可靠的细胞周期动态数据。
结论
- 该方法对于确定各种细胞群体的细胞周期位置是有效的。
- 流式细胞术是细胞周期分析的强大工具。
- 该协议可以适应不同的细胞类型和实验条件。
常见问题
Executive Industry Relevance
Accurate cell cycle analysis is essential for evaluating the impact of growth factors, cytokines, and kinase inhibitors on proliferation in mammalian cell systems. This method enables precise quantification of G1, S, and G2/M phases by combining BrdU incorporation with propidium iodide staining, supporting mechanistic de-risking in target validation and lead identification workflows. The approach provides predictive confidence in assessing compound effects on cell cycle progression, informing go/no-go decisions in preclinical research.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by determining whether growth inhibitory signals act in G1 or S phase.
- Operational Value: Enables functional target validation through clear separation of cells in G1 from early S phase or late S phase from G2/M.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by quantifying the proportion of cells arrested in specific phases upon compound treatment.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream screening by establishing baseline cell cycle distribution.
- Operational Value: Delivers assay standardization and reproducibility through quantitative flow cytometric readouts of DNA content and synthesis.
- Scalability: Enables reliable compound evaluation across large cell populations with gated single-cell analysis.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Connects discovery findings to preclinical validation by detecting cell cycle arrest in sub-populations, such as Rb-transfected cells, even when outnumbered by untransfected cells.
- Disease-Relevant System: Models pathophysiological conditions like TGF-β1-mediated G1 arrest or p27KIP1-induced S-phase reduction.
- Risk-Adjusted Advancement: Informs decisions on compound progression by linking target engagement to measurable cell cycle outcomes.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from target hypothesis testing through lead identification to preclinical validation, enabling stage-appropriate assessment of proliferation effects.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by revealing whether compounds delay G1/S transition or block S-phase progression.
- Screening: Delivers assay readiness and quantitative outputs for comparing compound effects across cell cycle phases.
- Analytics: Provides multiplexed measurements of DNA content and synthesis, enabling statistical comparison of experimental conditions.
- Translational Research: Maintains continuity from discovery to preclinical work by detecting arrest in defined sub-populations using dual-staining flow cytometry.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable platform for evaluating diverse stimuli, including cytokines, kinase inhibitors, and genetic perturbations.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by distinguishing G1 arrest from S-phase block or G2/M accumulation.
- Operational Value: Ensures standardization and reproducibility through fixed gating strategies and internal controls.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing early, quantitative biomarkers of biological activity.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization based on phase-specific antiproliferative effects.
Implementation Considerations
- Requires expertise in flow cytometry compensation, staining optimization, and cell cycle model interpretation.
- Dependent on access to flow cytometers with logarithmic and linear detection capabilities for BrdU and propidium iodide.
- Necessitates standardization of fixation, permeabilization, and antibody staining steps across laboratories.
- Must account for cell line-specific variations in BrdU uptake and epitope accessibility.
- Limited by the need for careful vortexing and incubation times to avoid DNA damage during acid treatment.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:19
Labeling and Fixing of Cells
2:30
Denaturing and Staining of Brdu and DNA
4:11
Flow Cytometry and Data Analysis
6:10
Alternate Protocol for Cell Cycle Analysis in a Mixed Population of Cells
7:35
Cell Cycle Distribution Staining Can Be Used for a Variety of Experimental Purposes
11:47
Conclusion
