含量测定的LRRK2的激酶活性在体外
January 18th, 2012
富亮氨酸重复激酶2是一个大型的多域激酶，基因突变，其中最常见的帕金森氏病的遗传原因。这种蛋白激酶活性分析已被证明是在了解这种蛋白质的生物学和功能障碍的重要工具。在本文中，在体外化验的LRRK2激酶活性和描述及其突变体的选择，提供了一个实验系统研究假定基板和潜在的功能障碍疾病的LRRK2磷酸化。
该程序的总体目标是测定富含亮氨酸的重复激酶 2 的激酶活性。这是通过首先制备含有重组 LA 2 和髓鞘碱性蛋白底物的激酶测定混合物来实现的。接下来加入标记为 TP 的无线电，并将混合物孵育 1 小时。
然后将蛋白质变性，在聚丙烯酰胺凝胶上分离并进行蛋白质印迹。最后，将膜暴露于磷酸化筛网中并测量活性。最终，可以获得结果表明 LA 2 具有活性以及突变如何通过自磷酸化和 MBP 磷酸化改变其活性。
这种方法的目视演示至关重要，因为由于需要采取安全预防措施，放射性步骤很难学习。在开始此过程之前，请参阅有关正确使用和处置放射性同位素以防止放射性扩散的书面方案。在 1.5 mL 样品管中制备所有反应混合物，并带有含有 O 形圈的螺旋盖。
首先在冰上解冻野生型 LA 两种蛋白质以及变体，开始测定。然后将以下成分在冰上混合。10 纳摩尔激酶，每毫升 0.5 微克，髓鞘碱性蛋白 0.5 微升 10 倍激酶缓冲液，以及足够的水，使体积达到 50 微升。
在准备好与放射性相关的工作区域和/或人员后，将加热块分别设置为 30 摄氏度和 100 摄氏度。从零下 32 摄氏度的冰箱中取出 20 个 PATP。使用前扫描容器的外部，并将其置于有机玻璃筛网后面。
使用盖革计数器，评估 32 PATP 对冰上每个反应的放射性。加入 1 微升 32 PATP 和 10 微摩尔冷。A TP 使用每只宠物混合均匀。
然后脉冲离心反应，使液体到达试管底部，从而最大限度地降低污染风险。接下来，去除 15 μL 等分试样作为零时间点，并通过添加 5 μL 的 4 倍 SDS 样品缓冲液终止反应。然后将等分试样在 100 摄氏度下变性 10 分钟。
将剩余的样品在 30 摄氏度下孵育 60 分钟。然后取出第二个 50 微升等分试样。加入 4 倍样品缓冲液，在 100 摄氏度下培养 10 分钟。
要解决 SDS 页面上的反应，请将每个样品的 20 μL 加载到 10 上。嗯，4 到 12%Biss 聚丙烯酰胺凝胶以及一条蛋白质标准泳道。使用 160 伏特拖把电泳缓冲液对凝胶进行 90 分钟的电泳，或直到 DIA 前沿到达凝胶末端。
根据书面方案中概述的步骤，将蛋白质以 25 伏电压转移到 PVDF 膜上 16 小时。膜干燥后，将其放在两张醋酸纤维素片之间，并将其暴露在磷筛网或 X 射线胶片下，以检测放射性标记的蛋白质暴露。时间可以从几个小时到一周以上不等，具体取决于所用放射性同位素的比活性和反应的酶动力学。
如果使用磷酸化网屏，请将图像保存为用于胶片的高分辨率 TIFF 或位图文件。首先使用桌面扫描仪扫描胶片。在此处使用图像 J 进行图像分析。
使用野生型 lark two 以及 G 2 0 1 9 S 过度活跃激酶和 D 1 99 4 A 激酶死亡方差进行的测定结果，髓鞘碱性蛋白作为磷酸基杖，如图所示，Lark two 的自磷酸化在大约 200 道尔顿处可见，多个条带代表磷酸化 MBP，在 20 至 40 道尔顿处可见。注意 D 1 90 94 a 泳道中没有自磷酸化，并且由于 G 2 0 1 9 s 突变导致磷酸化增加。激酶死道中 MVP 的残余磷酸化可能是由于 D 1 99 4 A 突变体未完全消融 Lark 二的激酶活性，也可能反映了反应中存在痕量污染激酶。
不要忘记，与辐射一起工作可能非常危险，在进行此类程序时应始终使用防护措施，例如屏蔽。
概述
本研究详细介绍了一种用于测定富亮氨酸重复激酶2（LRRK2）激酶活性的方法，该酶是帕金森病的关键因素。该协议包括制备测定混合物、孵育和通过蛋白质印迹分析结果的步骤。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 生物化学
- 细胞生物学
背景
- LRRK2突变是帕金森病最常见的遗传原因。
- 了解LRRK2的激酶活性对于洞察其生物学作用至关重要。
- 体外测定可以帮助阐明突变对LRRK2功能的影响。
- 放射性测定需要谨慎处理和安全预防措施。
研究目的
- 提供评估LRRK2激酶活性的详细协议。
- 研究突变如何影响LRRK2的磷酸化能力。
- 为未来研究LRRK2在疾病中的功能障碍建立可靠的实验系统。
使用的方法
- 制备含重组LRRK2和髓鞘基本蛋白的激酶测定混合物。
- 加入放射性标记的ATP并孵育混合物。
- 通过SDS-PAGE变性和分离蛋白质。
- 通过蛋白质印迹检测磷酸化底物。
主要结果
- 观察到LRRK2的自身磷酸化，表明其活性。
- G2019S等突变显示增加的磷酸化活性。
- 在激酶失活的D1994A变体中未发现自身磷酸化。
- D1994A通道中的残余磷酸化表明激酶活性未完全消除。
结论
- 该测定有效地展示了LRRK2活性和突变的影响。
- 结果有助于理解LRRK2在帕金森病中的作用。
- 在使用放射性材料时，安全措施至关重要。
常见问题
Executive Industry Relevance
Assaying LRRK2 kinase activity provides a direct readout of target engagement and functional impact of disease-associated mutations, supporting early-stage target validation in neurodegenerative disease programs. Quantitative measurement of autophosphorylation and substrate phosphorylation enables mechanistic de-risking by linking genetic variants to enzymatic output, informing go/no-go decisions in LRRK2-focused discovery pipelines. This assay format supports preclinical continuity by establishing a reproducible biochemical framework for evaluating inhibitor potency and selectivity across mutant and wild-type LRRK2.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypothesis by measuring kinase activity as a functional readout of LRRK2 target modulation.
- Operational Value: Enables biological de-risking through direct comparison of wild-type and pathogenic variants (e.g., G2019S, D1994A) in a controlled in vitro system.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by quantifying how mutations alter kinase output, guiding prioritization of LRRK2 as a drug target in Parkinson’s disease.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares a validated biochemical system using recombinant LRRK2 and MBP as a generic substrate for consistent kinase activity measurement.
- Operational Value: Establishes a standardized, reproducible format for assessing compound effects on LRRK2 phosphorylation, enabling assay scalability and cross-lab reproducibility.
- Screening Readiness: Supports reliable compound evaluation by providing a quantitative readout (autoradiographic signal) that reflects kinase activity under defined conditions.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Connects discovery-phase kinase assays to preclinical validation by establishing a disease-relevant biochemical readout linked to PD-associated mutations.
- Risk-Adjusted Advancement: Informs preclinical go/no-go decisions by demonstrating how mutations alter kinase activity, helping assess target modulation thresholds for therapeutic efficacy.
- Mechanistic De-risking: Focuses on predictive value by using MBP phosphorylation to assay LRRK2 activity independent of uncertain physiological substrates, reducing ambiguity in target validation.
Pipeline & Workflow Integration
The LRRK2 kinase assay fits within the discovery continuum from target validation through lead identification to preclinical evaluation, providing a functional bridge between genetic insight and biochemical mechanism.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by measuring kinase output as a direct function of LRRK2 activity, enabling assessment of mutation impact.
- Screening: Delivers assay readiness through standardized incubation, radiolabel incorporation, and SDS-PAGE/Western blot separation, yielding quantitative phosphorylation data.
- Analytics: Generates measurable readouts (auto- and substrate phosphorylation) via phosphorimaging, allowing comparison of kinase activity across conditions and variants.
- Translational Research: Connects to preclinical work by establishing a mutation-sensitive biochemical assay that mirrors disease-associated LRRK2 dysfunction.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable platform for evaluating LRRK2-targeted compounds, mutant panels, and pathway modulators across discovery projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Provides predictive confidence in target validation by quantifying kinase activity changes due to mutations, reducing mechanistic ambiguity in LRRK2 biology.
- Operational Value: Ensures standardization and reproducibility through defined reagent concentrations, incubation times, and separation methods, supporting consistent data generation.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by linking genetic variants to functional kinase output, increasing capital efficiency in target prioritization.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted advancement by identifying LRRK2 variants with altered activity, informing biomarker strategy and preclinical model selection.
Implementation Considerations
- Requires expertise in radiolabel handling, kinase biochemistry, and Western blot detection to ensure safe and accurate execution.
- Dependent on instrumentation including heating blocks, Geiger counters, SDS-PAGE apparatus, and phosphorimagers for signal detection.
- Necessitates cross-team standardization of reaction setup, quenching, and exposure protocols to maintain inter-lab consistency.
- Adaptation to alternative substrates (e.g., LRRKtide, α-synuclein) must account for variable phosphorylation efficiency and validation status.
- Practical limitations include radioactivity safety protocols, signal exposure time variability, and the need for careful normalization to account for incomplete kinase ablation in mutant controls.
