果实角质层的分离与生物物理研究

本实验采用生物物理技术评估番茄角质层中具有交联能力的亲水性保护聚合物，并监测果实角质层中外角质蜡和内角质蜡的选择性去除过程。通过酶法处理番茄表皮及其附着的细胞壁，实现角质层与完整果实的分离。第二步采用溶剂萃取法对果实角质层进行彻底脱蜡，以获得分离出的角质素分子的表征。

利用固态核磁共振技术对生物聚酯进行分析。固态核磁共振谱学分析表明，在野生型和基因工程番茄果实角质层的角质中，能够发生交联的含氧脂肪族基团的相对比例存在差异。另一种方法是，将整个果实涂上阿拉伯胶并剥离，以去除表皮角质蜡，随后将果实浸入氯仿中，以去除果皮角质层内的内层蜡质。

然后，采用与番茄表皮相同的酶处理方法分离得到部分脱蜡的角质层，并利用固态核磁共振和原子力显微镜进行检测。最终，通过核磁共振谱图中蜡质峰信号的逐步减弱以及同步原子力显微镜成像所观察到的果实角质层表面形貌的变化，可以清晰地揭示表层和内层角质蜡质的逐级去除过程。植物地上器官由一种称为角质层的聚酯-蜡质复合生物保护结构所覆盖。本文将介绍利用固态核磁共振和原子力显微镜技术，选择性去除番茄果实角质层内外蜡质组分的实验方案。

这些方法也可用于评估人工设计的表皮材料的交联能力。演示实验操作的人员包括三位 stark 团队成员：Ishish Chatterjee 博士、博士生 Shantani Sarkar 以及前高中生 Julia Tik。另一位演示者是 Dr. Olivia Nisau，她是我们的化学工程同事 Alexander S. 博士实验室的一名博士后研究员。开始进行番茄表皮的酶法分离时，将三个市售或栽培的果实放入碗中，以大片形式剥离表皮，并弃去内部的中果皮组织。

然后用去离子水清洗番茄表皮，并将其完全浸没于烧杯中的去离子水中保存。将去皮的番茄表皮完全浸入按照书面实验方案所述配制的酶混合液中。在31°C条件下持续振荡孵育24小时。使用布氏漏斗或厨房滤网收集番茄表皮，并用去离子水冲洗。

将表皮置于室温下的真空烘箱中干燥一小时后，可将干燥的表皮储存于已标记并加盖的瓶子中。后续进行脱蜡操作时，用镊子取番茄角质层样品，将其小心放置于提取柱底部的中心玻璃或一次性套管中，填充量约为套管的一半。随后按照书面实验方案中的描述，使用甲醇作为溶剂继续组装固液萃取装置。

监测该过程一小时，调节调压变压器电压，使储液器每秒收集约一滴溶剂，并确保虹吸过程在装置的套管内发生。当提取套管充满后，在持续提取12小时后，让装置冷却，然后降低加热套，将提取器和储液器作为一个整体单元取下，以处理提取后的溶剂。倾斜冷凝柱，使溶剂虹吸进入下方的接收瓶中。

使用镊子将萃取套管提升至萃取柱颈部稍下方位置。将多余的溶剂排干后，把套管放置在干净的表面上。断开烧瓶连接，并将废液倒入贴有标签的溶剂容器中。

依次使用极性逐渐降低的溶剂重复提取步骤，例如氯仿和紫杉烷，每种溶剂处理12小时。待番茄表皮样品干燥后，称量其质量，并在室温下置于用Parafilm密封的螺旋盖瓶中保存。为进行核磁共振（NMR）分析，取4至6毫克完全脱蜡的番茄角质层（称为角质）样品，放入1.6毫米快速魔角旋转氧化锆转子中，并使用厂商提供的装样工具进行装填。

安装顶盖后，用黑色记号笔将顶盖的一半涂黑，以便测量旋转速率。固体核磁共振实验的初始设置是一个技术要求较高的过程，需在经验丰富的工作人员指导下完成。首先使用标准样品化合物，按照书面实验方案中所述方法调节磁场均匀性并优化实验参数。然后将装好样品且密封的转子插入探头，并将探头置入磁体中。

逐步增加转速至10千赫兹，以确认样品填充良好，并验证转子在转速变化小于20赫兹的情况下能够稳定旋转。反复调节探头的调谐和匹配电容，使在质子和碳13核磁共振频率下均达到最小的功率反射。将实验温度设定为25摄氏度。

在10 kHz旋转频率下确定Hartman-Hahn质子-碳匹配条件后，启动预优化的CPMA实验。采集4,096次累加信号后，对谱图进行50至100 Hz的指数线宽加宽处理，并进行傅里叶变换，得到以百万分之一（ppm）为单位的化学位移对应的信号强度NMR谱图。按照文中所述方法对碳-13化学位移进行化学位移基准校准。

将转子旋转频率提高至15千赫兹，并重复进行C-P-M-A-S测量，该测量对应于通过梯形旋转频率下的C-P-M-A-S碳化学偏移分析所确定的Hartman Han匹配条件。13C核磁共振谱鉴定了在经充分脱蜡处理的番茄表皮蜡质中主要存在的官能团，包括长链聚羟基烷酸酯（PHAs）、含氧PHAs、多重键合的芳香族化合物以及碳的产率。其中，含氧化合物在表皮聚酯生物聚合物单体单元之间形成共价连接中起关键作用，从而构建出表皮聚酯基质的分子结构。

在百万分之45至100的光谱区域中观察到的相对峰面积差异表明，与野生型角质相比，突变体角质含有相对较高比例的可形成交联的CHO结构单元。为开始选择性分离表皮外和表皮内蜡质。

用蒸馏水清洗第二批完整的番茄。用纸巾和Kim擦拭布擦干，并将它们茎部朝下放置在一张铝箔纸上。用120%的阿拉伯胶水溶液从顶部到底部均匀涂刷整个番茄。

让阿拉伯胶在果实表皮上干燥一小时，形成一层薄膜。用镊子去除该薄膜，但避免刺破番茄表皮。按照文中所述对薄膜进行进一步处理，可得到表皮角质层蜡质。

番茄将保持物理完整性。将它们浸入氯仿中两分钟。在室温下，待溶剂蒸发后可收集表皮蜡质，剥去番茄表皮，并用纤维素酶和果胶酶以及醋酸钠缓冲液进行酶处理，以分别去除纤维素和果胶。

随后可按照前文所述方法进行溶剂提取，以彻底脱除番茄角质层中的蜡质。文中所述的C-P-M-A-S实验可使用天然及部分脱蜡的果实角质层样品重复进行。原子力显微镜的设置过程较为复杂，最好在经验丰富的技术人员初始指导下完成。进行调频（FM）模式时，首先打开扫描探针显微镜（简称SPM），并确保显微镜模式切换开关已设定为接触式原子力显微镜模式。

接下来，通过旋转SPM探头的两个用户可调节的前部旋钮，手动抬升SPM探头。通过旋转探头后部的夹紧螺丝，将FM探针 holder 从SPM探头上拆下。使用镊子将现有的FM悬臂梁从其 holder 中取出。

然后小心地从包装中取出一个新的带有氮化硅针尖的悬臂，并将其安装到原悬臂的位置。使用光学显微镜检查新安装的FM悬臂是否完好无损。用双面胶带将番茄表皮样品固定在样品载片上。

使用光学显微镜确认角质层样品保持平整且光滑。将样品放置于样品托上后，把附着在样品托上的番茄角质层样品置于SPM扫描仪顶部的磁性区域。通过旋转旋钮，将扫描仪前部的两个手动螺钉调至足够高度，以避免损坏原子力显微镜（AFM）探针。

将探针支架放入SPM探头时，调节电动后部螺钉，使其高度大致与其他两个前部螺钉齐平。重新将探针支架插入SPM探头，并拧紧探头后部的夹紧螺钉以固定。打开激光后，使用探头上方的中央和右侧激光调节旋钮，将激光光斑对准FM悬臂梁。

在一张纸上观察反射的激光束，以将激光光斑精确地定位在 FM 悬臂末端。调整激光光斑的位置以获得最大的总信号。通过水平和垂直调节可移动镜片的位置，调节光电探测器上反射激光光斑的位置，确保入射光被四个象限均匀接收。

通过调节SPM扫描器的前部手动控制螺丝和后部电机驱动螺丝，降低探测器上的FM探针。使用倒置显微镜目视监测FM探针接近样品表面的过程。确保所有三个螺丝处于同一水平位置。

为避免因样品倾斜成像而产生伪影，需将探针移向样品，但不可过于接近，以免接触或穿透样品表面。从原子力显微镜（AFM）悬臂反射的激光将经由可移动镜面反射至光电探测器，用于硅氮化物AFM探针的接触式AFM模式。通过调节镜面位置，将输出信号电压设为负2伏（对应零伏设定点），并将差分信号调整为零伏。

使用 nano scope 软件。单击显微镜图标并选择适当的配置文件。在扫描控制设置面板中，设置扫描速率和扫描尺寸。

单击“探针接触”图标，使原子力显微镜（AFM）探针接触样品表面。程序将通过控制SPM基座的电机化后部螺钉，逐步降低探针，直至其与样品表面接触。探针成功接触后，扫描过程将自动开始。

使用软件的图像和显微模式监测扫描过程，根据书面方案中所述，逐步调整参数以获得最高分辨率的图像。例如，首先使用较大的Z轴数据尺度值开始扫描，然后仔细减小Z轴数据尺度值，以在图像上获得表面特征的最佳对比度。

捕获图像以保存数据文件。使用平整化函数处理数据，以消除由于垂直扫描仪漂移、图像弯曲以及扫描线之间垂直偏移所导致的图像伪影。最后，计算平均粗糙度碳。

13 C-P-M-A-S-N-M-R 谱图显示，在 31 百万分之一处的蜡质峰逐渐减弱，表明从表皮与蜡质复合物中依次去除了表皮蜡和内层蜡，同时保留了角质生物聚合物的主要化学结构。原子力显微镜图像分析揭示了由于逐步提取果实角质层中的表皮蜡和内层蜡所导致的表面不规则性，表明角质层组装结构发生了改变。一旦掌握该技术，便可于两小时内完成对番茄果实角质层中表皮蜡和内层蜡的逐步去除。

在对果实角质层进行彻底萃取时，使用接触角测量后，应采用一系列极性不同的溶剂进行固相萃取。本文展示了该FM方案。此外，还可利用其他A FM实验来测定角质层表面的弹性。

观看本视频后，您应能够充分理解如何系统地从角质-蜡质复合物中分离组分，并利用固态核磁共振（MR）和原子力显微镜（FM）分别对角质层材料进行分子表征和快速表面分析。本视频所展示的技术使植物生物学领域的研究人员能够确定天然及人工改造植物组织的分子组成和超分子结构。