Name: 果实角质层分离和生物物理研究 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-03-30T12:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 53 s
Description: 学习使用固态核磁共振和原子力显微镜技术分离番茄果实角质层并进行生物物理研究。该方法可评估工程化角质材料的交联能力，为植物生物学研究提供重要技术支持。

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本工作得到了美国国家科学基金会资助项目 # MCB-0741914 和 MCB-0843627 的支持；纽约市立学院还获得了美国国立卫生研究院国家研究资源中心提供的额外基础设施支持，项目编号为 2 G12 RR03060-26。我们衷心感谢康奈尔大学植物生物学系 J.K.C. Rose 团队提供了 M82（野生型）和 CM15（突变型）番茄表皮。我们感谢纽约市立学院化学工程系 Alexander Couzis 教授团队的 Spyros Monastiriotis 博士在原子力显微镜实验中提供的大力支持。我们感谢 Lauren Gohara 女士在图形设计方面提供的帮助。

1. 番茄表皮的酶法分离5
<ol>
 <li>将若干市售或栽培的番茄放入碗中。将果实的表皮大片剥下，去除内层的中果皮组织。用去离子水清洗番茄表皮，并将其浸没于水中，保存在烧杯中。</li>
 <li>配制50 mM、pH 4.0的醋酸钠缓冲液（31 °C）：将1.22 g三水合醋酸钠（Mr. 136.08 g/mol）和2.34 ml冰醋酸（17.485 M）加入烧杯中，加入200 ml去离子水，然后在31 °C下调节pH至4.0。另配制酶混合液：将4 ml果胶酶（EC 3.2.1.15；10 U ml-1，TCI America）、0.2 g纤维素酶（EC 232.734.4；1.3 units/mg solid，Sigma Aldrich）和13 mg NaN3混合，再加入196 ml醋酸钠缓冲液，得到200 ml终体积的酶解液5。将去皮后的番茄表皮完全浸入酶解液中，在31 °C下以恒定振荡培养24小时（G24 Environmental Incubator Shaker；New Brunswick Scientific Co.）。</li>
 <li>用厨房滤网或布氏漏斗收集番茄表皮，并用去离子水冲洗。随后将其置于室温下的真空烘箱中干燥1小时。将干燥后的番茄表皮保存在贴有标签并加盖的瓶中，用于后续脱蜡处理。</li>
</ol>
2. 索氏提取法彻底脱蜡6
<ol>
 <li>用于彻底脱蜡的设备包括热源（加热套和调压控制器）、作为溶剂储液瓶的圆底烧瓶、索氏提取器、烧结玻璃套管或一次性提取套管、防暴沸颗粒以及冷凝管（见图1）。请注意，窄虹吸臂（图1中的部件6和7）非常脆弱，易发生断裂，操作时需格外小心。</li>
 <li>取0.5–1 g番茄表皮（来自步骤1），放入研钵中，用研杵研磨成粗粉，除非样品将用于原子力显微镜（AFM）检测（第5节）。将样品填充至烧结玻璃或一次性套管约一半高度，并用镊子小心地将其置于提取柱底部。</li>
 <li>安装冷凝管并用铝箔包裹。在加入少量防暴沸颗粒的条件下加热甲醇溶剂（ACS级），直至其轻微沸腾并在烧瓶壁上形成回流。用玻璃棉和铝箔共同覆盖溶剂储液瓶。观察过程约1小时，调节调压控制器电压，使储液瓶每秒收集约一滴溶剂，并确保当套管充满时索氏提取器内发生虹吸作用。</li>
 <li>继续提取12小时后，降低加热套位置，使装置冷却。将提取器和储液瓶作为一个整体单元拆下以处理废液。用镊子将套管提起至提取柱颈部稍下方，排出多余溶剂，然后将套管放置于洁净表面。倾斜提取柱，使液体通过虹吸进入下方烧瓶。断开烧瓶，将废液倒入贴有标签的废液容器中。</li>
 <li>依次使用极性逐步降低的溶剂重复步骤2.3和2.4，例如分别用氯仿和正己烷各提取12小时。</li>
 <li>让番茄角质样品在套管内干燥，可通过吹入氮气气流或将其置于室温下的真空烘箱中实现。最后，称量干燥样品的质量，并将其储存在室温下、用封口膜密封的螺旋盖瓶中。</li>
</ol>
3. 表皮蜡质和内皮蜡质的选择性分离3,4
<ol>
 <li>首先，用蒸馏水清洗整颗番茄（与1中所述番茄为不同批次）。用纸巾和擦镜纸擦干，并将番茄茎端朝下放置在铝箔纸上。</li>
 <li>自上而下地将120%（w/w，质量比）的阿拉伯胶水溶液均匀涂覆于整颗番茄表面，静置约一小时，使阿拉伯胶在果皮表面干燥形成一层薄膜。用镊子小心剥离该薄膜，注意避免刺破番茄表皮。重复此操作一次。</li>
 <li>将所得薄膜加入含有1:1（v/v）氯仿-水的样品瓶中，混合三分钟。剧烈振荡并完成相分离后，用移液器取出氯仿相，分别置于未加盖的样品瓶中蒸发溶剂，得到表皮蜡质。番茄组织在此过程中保持物理完整性。随后将番茄在室温下浸入氯仿中两分钟，蒸发溶剂后收集内表皮蜡质。接着剥离番茄果皮，并使用酶法处理（在乙酸钠缓冲液中加入纤维素酶和果胶酶）以分别去除纤维素和果胶（方法如1所述）。</li>
 <li>如有需要，可对经酶法分离得到的表皮进一步进行索氏提取脱蜡（见步骤2），依次使用三种极性不同的溶剂（分别为甲醇、氯仿和正己烷）进行彻底脱蜡处理。</li>
</ol>
4. 通过交叉极化魔角旋转固态核磁共振（CPMAS ssNMR）对番茄果实角质进行分子表征6
<ol>
 <li>使用厂商提供的装样工具，将4-6 mg完全脱蜡的番茄表皮（角质）放入1.6 mm快速魔角旋转（fastMAS）氧化锆转子中。（可选用研磨后的脱蜡番茄表皮，或少量部分脱蜡的微小表皮碎片。）确保样品在转子中填充均匀，但不要压得过紧。盖上顶部盖帽后，用黑色记号笔涂黑盖帽的一半，以便于测量旋转速率。</li>
 <li>调节核磁共振（NMR）波谱仪的匀场，使谱线半高宽最小，并使用金刚烷等标准物质校准质子（1H）和碳（13C）的90°脉冲宽度。</li>
 <li>以甘氨酸或谷氨酰胺作为模型化合物，通过优化交叉极化魔角旋转（CPMAS）实验中的所有参数（Hartmann-Hahn匹配功率、1H - 13C接触时间、异核1H去耦强度），获得最大信号强度。在1H频率为600 MHz条件下采集谱图时，推荐条件包括：10 kHz或15 kHz旋转频率、每次采集间延迟3秒、采用SPINAL异核质子去耦7，去耦场强对应频率为185 kHz。</li>
 <li>将装有角质样品的转子插入探头，然后将探头置入磁体中。逐步提高旋转速度至10 kHz，以检查样品填充情况和转子稳定性。确认转子最终旋转稳定性在±20 Hz范围内。</li>
 <li>反复调节探头的调谐和匹配电容，使在1H和13C核磁共振频率下均达到最小功率反射。将实验温度设定为25 °C（或室温）。</li>
 <li>启动预先优化的CPMAS实验，采用在10 kHz旋转频率下确定的Hartmann-Hahn匹配条件。</li>
 <li>采集4096次瞬态信号，对谱图进行50–100 Hz的指数（洛伦兹）线宽展宽处理，然后进行傅里叶变换，生成信号强度相对于化学位移（ppm）的核磁共振谱图。</li>
 <li>使用金刚烷的亚甲基（-CH2-）基团在38.4 ppm处的信号8作为外标，对13C化学位移进行校准。</li>
 <li>将转子旋转频率提高至15 kHz，并重复进行对应于该旋转频率下确定的Hartmann-Hahn匹配条件的CPMAS测量（步骤4.6–4.8）。</li>
 <li>对天然（带蜡质）和部分脱蜡的果实表皮样品，重复进行CPMAS实验（步骤4.1–4.9）。</li>
</ol>
5. 使用原子力显微镜检测番茄表皮表面（Digital Instruments Nanoscope IIIa；不同显微镜的操作步骤略有差异）6
<ol>
 <li>打开扫描探针显微镜（SPM）（图2），并确保显微镜模式切换开关设置为接触式原子力显微镜（AFM）模式。</li>
 <li>通过旋转SPM头部的两个用户可调前旋钮，手动抬升SPM头部。旋转头部后部的夹紧螺丝，将AFM探针夹持器从SPM头部拆下。</li>
 <li>使用镊子将现有AFM悬臂从夹持器上取下，然后小心地从包装中取出一个新的氮化硅悬臂（AFM探针），并将其安装至原位置。使用光学显微镜检查新安装的AFM悬臂是否完好无损。</li>
 <li>使用双面胶带将番茄表皮样品（一段部分脱蜡的番茄表皮，约10 mm × 10 mm）固定在不锈钢圆盘（样品载片）上。使用光学显微镜检查样品放置在载片后，表皮表面是否保持平整光滑。</li>
 <li>将带有番茄表皮样品的载片放置在SPM扫描器顶部的磁性区域上。</li>
 <li>通过旋转旋钮将扫描器的前两个手动调节螺丝调至较高位置；将电动后调节螺丝也调整至与其他两个前螺丝大致相同的高度。确保三个螺丝均调至足够高的位置，以避免在将探针夹持器装入SPM头部时损坏AFM探针尖端。</li>
 <li>将探针夹持器重新插入SPM头部，并通过拧紧头部后部的夹紧螺丝将其固定。</li>
 <li>打开激光后，使用头部顶部的中央（y方向）和右侧（x方向）激光调节旋钮，将激光光斑对准AFM悬臂。通过观察纸张上反射的激光光束，将激光光斑精确对准AFM悬臂末端。</li>
 <li>使用光电探测器调节旋钮，迭代调整可移动镜片的位置，以获得最大信号（SUM信号），从而确保反射的激光束被光电探测器的四个象限均匀接收。</li>
 <li>通过旋松SPM扫描器的手动前调节螺丝和电动后调节螺丝，降低AFM探针尖端，并使用倒置显微镜目视监控探针尖端接近样品表面的过程。确保三个螺丝处于同一高度，以避免因样品倾斜成像而产生伪影。使探针接近样品，但不要过于靠近，以免探针接触或刺穿样品表面。</li>
 <li>此时，从AFM悬臂反射的激光将经由可移动镜片反射至光电探测器。对于使用氮化硅AFM探针的接触式AFM模式，通过调节镜片位置，将输出信号（垂直偏转）电压设置为-2 V（设定点为0 V），并将差分信号（垂直/水平差值）调整为0 V。</li>
 <li>在Nanoscope软件中，点击显微镜图标，并选择合适的配置文件（接触式AFM模式）。</li>
 <li>在“扫描控制设置”面板中，设置扫描速率和扫描尺寸，例如10微米扫描尺寸和2 Hz扫描速率。</li>
 <li>点击“探针接近”图标，使AFM探针与样品表面接触。程序将通过控制SPM基座的电动后螺丝，自动降低探针直至其与样品表面接触。探针成功接触后，扫描过程将自动开始。</li>
 <li>使用软件的图像和示波模式监控扫描过程，迭代调整设定点、积分增益、比例增益、扫描尺寸、扫描速率、扫描线数和每线采样点数等参数，以获得最高分辨率的图像。初始扫描时使用较大的z轴范围（数据尺度）；然后逐步减小数据尺度值，以观察图像中表面特征的最佳对比度。尽量减少扫描图像中白色区域的出现，这些区域表示表面特征的高度超出了可用的z轴范围。</li>
 <li>捕获图像以保存数据文件；然后使用平整化功能处理数据，以消除因垂直（Z）扫描器漂移、图像弯曲以及扫描线间垂直偏移引起的图像伪影；9最后计算平均粗糙度。保存数据后，通过反转计算机控制的螺丝电机动作，将AFM探针收回。图像处理可在离线图像分析模式下进行，也可使用另一台计算机完成。</li>
 <li>使用探针夹持器底部前方的灰色金属旋钮，改变扫描区域的x和y位置；然后在五个不同样品位置重复测量，以检验结果的可重复性。若图像质量下降，应更换AFM悬臂。</li>
</ol>
6. 代表性结果
通过分析全脱蜡番茄角质层（角质）的 CPMAS 13C NMR 谱图的化学位移（图3），可鉴定其中存在的主要官能团。角质生物聚酯中的关键碳基团包括长链脂肪族（0–45 ppm）、含氧脂肪族（45–110 ppm）、多重键合及芳香族（110–160 ppm）以及羰基（160–220 ppm）。其中，含氧烷基基团（CHO + CH2O）在角质生物聚合物单体单元之间形成共价连接中起关键作用，从而构建角质基质的分子结构。在45至100 ppm谱区观察到的相对峰面积差异表明，与野生型角质相比，突变体角质中含有相对更高比例的可形成交联的CHO结构基团；采用直接极化（DPMAS）NMR5方法进行的精确定量测量支持这一推断（数据未显示）。
CPMAS 13C NMR 谱图也显示，在 31 ppm 处的蜡质峰逐渐减弱（图 4），表明表皮蜡质和内角质层蜡质从角质-蜡质复合物中被逐步去除，同时保留了角质生物聚合物主要的化学结构。平行的原子力显微镜（AFM）图像分析（图 5）揭示了由于果实角质层中表皮蜡质和内角质层蜡质逐步被提取而引起的表面不规则性，表明角质层组装结构的有序性发生了改变。
<img alt="索氏提取装置示意图，标注各组件，用于高效固液提取。" src="/files/ftp_upload/3529/3529fig1.jpg" data-altupdatedat="1761809329000" data-alt="图1"> 
图1. 索氏提取器（图像来源：Wikipedia）。
<img alt="扫描探针显微镜装置及用于纳米级表面分析的组件示意图。" src="/files/ftp_upload/3529/3529fig2.jpg" data-altupdatedat="1761809329000" data-alt="图 2"> 
图 2. A) 扫描探针显微镜。B) SPM 探头（改编自 Digital Instruments 提供的原子力显微镜培训手册）。
<img alt="比较 M82 和 CM15 番茄品种的 ^13C 化学位移的核磁共振波谱图" src="/files/ftp_upload/3529/3529fig3.jpg" data-altupdatedat="1761809329000" data-alt="图 3"> 
图 3. 野生型（M82）和突变体（CM15）完全脱蜡的红熟番茄果实角质层（角质）的 150 MHz CPMAS 13C NMR 谱图显示了对应于交联羟基脂肪酸聚酯以及一些多键片段官能团的化学位移共振峰。所有谱图均在 10 kHz 旋转频率下采集获得。
<img alt="显示蜡质去除过程的核磁共振谱图；峰表示蜡质含量分析中的化学位移。" src="/files/ftp_upload/3529/3529fig4.jpg" data-altupdatedat="1761809329000" data-alt="图 4"> 
图 4. 商品化红熟番茄果实角质层的 150 MHz 13CCPMAS NMR 谱图显示，在依次通过阿拉伯胶机械提取和两分钟氯仿浸泡分别去除表皮蜡质和内皮蜡质后，其组成发生改变。所有谱图均在 15 kHz 旋转频率下采集获得。
<img alt="表面粗糙度分析；3D图；均方根粗糙度；脱蜡对表面形貌的影响。" src="/files/ftp_upload/3529/3529fig5.jpg" data-altupdatedat="1761809329000" data-alt="图5"> 
图5. 对图4中所述的部分脱蜡商业番茄表皮进行逐步去除表皮蜡质（左）和内层蜡质（右）后的原子力显微镜（AFM）图像及粗糙度估算结果。

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</ol>

未声明任何利益冲突。

本文所述的实验方案能够在无需破坏性化学降解的前提下，对一种复杂的难处理植物材料进行详细的分子和微观尺度表征。为了研究控制角质层组装结构组织的角质生物聚酯与多种脂类（蜡质）的混合情况10，我们实施并监测了从异质角质层混合物中选择性去除表皮蜡质和内角质层蜡质的步骤。采用固态13C核磁共振（NMR）技术评估蜡质分子组分的提取效果，同时利用原子力显微镜检测表面粗糙度的相应变化6,11。为了比较栽培野生型与单基因突变番茄果实中角质的交联能力，同样采用固态13C NMR技术估算CHO和CH2O化学基团的相对数量。
本方案具有若干显著的设计特点。由于蜡质材料包含多种脂类，使用一系列极性不同的溶剂处理果实角质层对于实现彻底脱蜡至关重要。此外，脱蜡时间可根据角质层样品的性质在8小时至24小时之间变化。为了从完整的果实角质层中一致地提取表皮蜡质，必须将粘合涂层均匀地涂覆于表面。
固态交叉极化魔角旋转（CPMAS）13C 核磁共振波谱法12是一种快速定性方法，可用于鉴定高度异质且不溶的植物生物聚合物的各种结构组分，同时保持其天然的物理特性；13传统的溶液态核磁共振也可用于表征提取的蜡质混合物。若需对完整植物聚合物中的官能团进行定量估算，5应采用高保真度的直接极化魔角旋转（DPMAS）13C 核磁共振5,14作为互补方法。官能团的准确定量需要对弛豫延迟时间、激发脉冲长度以及异核去耦强度进行仔细优化。15可通过使用TPPM16或SPINAL7方法，将异核去耦设置为1H射频场强度在50 kHz至185 kHz范围内。除上述参数外，CPMAS测量的灵敏度还取决于自旋锁定时间及哈特曼-汉恩匹配条件。15除传统CPMAS外，还可采用振幅递增交叉极化（RAMP-CP）技术，通过在自旋锁定期间线性（约20–50%）或切向调节1H振幅，同时保持13C射频场强度恒定（或反之），以最大化交叉极化效率。17,18进行CPMAS测定时，必须在至少两种不同的转子旋转频率下进行，以区分旋转边带与主谱峰。
在接触模式下进行的同步原子力显微镜（AFM）测量能够以高扫描速度和高分辨率直接成像角质层表面状态19，例如在逐步去除蜡质组分的过程中。采用轻敲（非接触）模式运行AFM可作为 delicate（脆弱）的“软”植物材料表面表征的替代方法，避免因侧向（剪切）力导致的样品表面损伤或刮擦5,20。无论何种模式，对样品表面同一位置连续获取多幅图像均有助于识别AFM测量过程中由“探针-表面相互作用”引起的任何表面损伤6,21。为获得最佳可重复性，应选用弹簧常数适合软性角质层表面的AFM探针，并保持恒定的温度和湿度条件6,15,20。固态核磁共振（NMR）可提供番茄果实角质层整体平均（体相）性质的分子图谱，而原子力成像则提供了一种互补的、非侵入性的探测手段22,23，用于追踪这些极为复杂的高分子组装体的表面形貌1,2

<table><tbody><tr><td>三水合醋酸钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8625-500G</td><td></td></tr><tr><td>果胶酶</td><td>TCI America</td><td>P0026</td><td>EC 3.2.1.15；10 U ml&lt;sup&gt;-1&lt;/sup&gt;，储存于冰箱中</td></tr><tr><td>纤维素酶</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1184-100KU</td><td>EC232.734.4；1.3 单位/mg，储存于冰箱中</td></tr><tr><td>冰醋酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9967</td><td></td></tr><tr><td>叠氮化钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2002-100G</td><td>极度危险</td></tr><tr><td>培养摇床</td><td>New Brunswick Scientific</td><td>型号 G24</td><td>制造编号 M1036-000G</td></tr><tr><td>真空烘箱</td><td>Precision Scientific</td><td>31566</td><td></td></tr><tr><td>可变变压器控制器（Variac Controller）</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>烧结玻璃套管（85 mm/25 mm）</td><td>VWR international</td><td>89056</td><td></td></tr><tr><td>一次性提取套管（80 mm/25 mm）</td><td>VWR international</td><td>28320</td><td></td></tr><tr><td>甲醇</td><td>VWR international</td><td>EMD-MX0485-7</td><td></td></tr><tr><td>玻璃棉</td><td>VWR international</td><td>RK20789</td><td></td></tr><tr><td>铝箔</td><td>Fisher Scientific</td><td>01-213-100</td><td></td></tr><tr><td>镊子</td><td>VWR international</td><td>82027-452</td><td></td></tr><tr><td>氯仿</td><td>VWR international</td><td>EM-CX1050-1</td><td></td></tr><tr><td>己烷</td><td>Fisher Scientific</td><td>H302-4</td><td></td></tr><tr><td>氮气</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>封口膜（Parafilm）</td><td>VWR international</td><td>52858</td><td></td></tr><tr><td>纸巾</td><td>VWR international</td><td>89002-984</td><td></td></tr><tr><td>Kim擦拭纸</td><td>VWR international</td><td>21905-026</td><td></td></tr><tr><td>阿拉伯胶</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9752</td><td></td></tr><tr><td>1.6 mm fastMAS 氧化锆转子</td><td>Varian Inc., Agilent</td><td></td><td></td></tr><tr><td>核磁共振波谱仪（NMR spectrometer）</td><td>Varian Inc., Agilent</td><td>标准口径磁体</td><td></td></tr><tr><td>甘氨酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>50046</td><td>CPMAS 的模型化合物</td></tr><tr><td>谷氨酰胺</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>49419</td><td>CPMAS 的模型化合物</td></tr><tr><td>金刚烷</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>100277</td><td>用于校准核磁共振中的90&amp;#x00B0;脉冲</td></tr><tr><td>多模式扫描探针显微镜（Nanoscope IIIA）</td><td>Digital Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nanoscope 软件</td><td>Digital Instruments</td><td></td><td>版本 5.30r3sr3（2005）</td></tr><tr><td>原子力显微镜探针（非导电氮化硅针尖）</td><td>Veeco Instruments, Inc.</td><td>型号 NP-20</td><td></td></tr><tr><td>光学显微镜</td><td>Digital Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>磁性托盘（Magnetic puck）</td><td>Digital Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>双面胶带</td><td>VWR international</td><td></td><td></td></tr><tr><td>水果削皮器</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>布氏漏斗（B&amp;#252;chner funnel）</td><td>VWR international</td><td>89038</td><td></td></tr></tbody></table>

果实角质层的分离与生物物理研究

Isolation and Biophysical Study of Fruit Cuticles

角质层是陆生植物地上部分表面的一层疏水性保护结构，具有多种防御功能，可抵御各种生物和非生物胁迫，同时调节植物与外界环境之间的水分流动。1 角质层主要由一种生物聚酯（角质）和长链脂肪酸（蜡质）构成；其功能完整性依赖于外层的“表皮蜡质层”以及由角质生物聚合物与“内层蜡质”组成的复合结构。2 本文中，我们描述了一种系统性的实验方案，可用于从市售番茄（Solanum lycopersicum）果实角质层中彻底提取蜡质，或对角质层复合物中的表皮蜡质和内层蜡质进行逐级、选择性去除。该方法借鉴了Jetter和Schäffer（2001年）提出的分步提取策略，用于从果实角质层中依次分离表皮和内层蜡质。3,4 为监测蜡质逐级去除的过程，我们同时采用固态交叉极化魔角旋转（CPMAS）13C核磁共振波谱法与原子力显微镜（AFM）技术，从而在分子水平上获得材料整体的结构特征，并结合角质表面微尺度形貌与粗糙度的信息进行分析。为进一步评估栽培型野生型及单基因突变型番茄果实脱蜡后角质层的交联能力，我们利用魔角旋转（MAS）13C核磁共振波谱法比较了含氧脂肪族（CHO和CH2O）化学基团的相对比例。
通过逐步使用一系列极性不同的溶剂进行索氏提取，实现彻底脱蜡，可有效根据蜡类组分中脂肪族和芳香族成分的疏水特性分离出蜡类组分，同时保持角质生物聚酯的化学结构。通过互补的物理方法监测表皮蜡质的机械提取以及内表皮蜡质的选择性去除，为研究角质层的组装提供了前所未有的手段：该方法揭示了多种蜡质的超分子组织与结构整合方式、角质-蜡质基质的架构，以及各组分的化学组成。此外，固态 13C NMR 显示 CHO 与 CH 的相对数量存在差异2野生型和突变型红熟番茄果实中O化学基团的分析。核磁共振（NMR）技术为表征角质层材料的分子结构提供了极为有效的工具，这类材料通常不溶、无定形且化学组成复杂。作为一种非侵入性、表面选择性的成像技术，原子力显微镜（AFM）能够在纳米尺度上有效且直接地探测角质层组装结构的组织形态。&mu;米尺度。

植物地上器官由角质层保护，角质层是一种超分子生物聚酯-蜡质复合结构。本文介绍了通过固态核磁共振和原子力显微镜分别在分子和微米尺度上监测番茄果实角质层表皮蜡质和内角质层蜡质选择性去除的实验方案，并评估了人工设计的角质层生物聚酯交联能力的方法。

角质层是陆生植物地上部分表面的疏水性保护层，作为多功能防御屏障，可抵御多种生物和非生物胁迫。

本实验采用生物物理技术评估番茄角质层中具有交联能力的亲水性保护聚合物，并监测果实角质层中外角质蜡和内角质蜡的选择性去除过程。通过酶法处理番茄表皮及其附着的细胞壁，实现角质层与完整果实的分离。第二步采用溶剂萃取法对果实角质层进行彻底脱蜡，以获得分离出的角质素分子的表征。利用固态核磁共振技术对生物聚酯进行分析。固态核磁共振谱学分析表明，在野生型和基因工程番茄果实角质层的角质中，能够发生交联的含氧脂肪族基团的相对比例存在差异。另一种方法是，将整个果实涂上阿拉伯胶并剥离，以去除表皮角质蜡，随后将果实浸入氯仿中，以去除果皮角质层内的内层蜡质。然后，采用与番茄表皮相同的酶处理方法分离得到部分脱蜡的角质层，并利用固态核磁共振和原子力显微镜进行检测。最终，通过核磁共振谱图中蜡质峰信号的逐步减弱以及同步原子力显微镜成像所观察到的果实角质层表面形貌的变化，可以清晰地揭示表层和内层角质蜡质的逐级去除过程。植物地上器官由一种称为角质层的聚酯-蜡质复合生物保护结构所覆盖。本文将介绍利用固态核磁共振和原子力显微镜技术，选择性去除番茄果实角质层内外蜡质组分的实验方案。这些方法也可用于评估人工设计的表皮材料的交联能力。演示实验操作的人员包括三位 stark 团队成员：Ishish Chatterjee 博士、博士生 Shantani Sarkar 以及前高中生 Julia Tik。另一位演示者是 Dr. Olivia Nisau，她是我们的化学工程同事 Alexander S. 博士实验室的一名博士后研究员。开始进行番茄表皮的酶法分离时，将三个市售或栽培的果实放入碗中，以大片形式剥离表皮，并弃去内部的中果皮组织。然后用去离子水清洗番茄表皮，并将其完全浸没于烧杯中的去离子水中保存。将去皮的番茄表皮完全浸入按照书面实验方案所述配制的酶混合液中。在31°C条件下持续振荡孵育24小时。使用布氏漏斗或厨房滤网收集番茄表皮，并用去离子水冲洗。将表皮置于室温下的真空烘箱中干燥一小时后，可将干燥的表皮储存于已标记并加盖的瓶子中。后续进行脱蜡操作时，用镊子取番茄角质层样品，将其小心放置于提取柱底部的中心玻璃或一次性套管中，填充量约为套管的一半。随后按照书面实验方案中的描述，使用甲醇作为溶剂继续组装固液萃取装置。监测该过程一小时，调节调压变压器电压，使储液器每秒收集约一滴溶剂，并确保虹吸过程在装置的套管内发生。当提取套管充满后，在持续提取12小时后，让装置冷却，然后降低加热套，将提取器和储液器作为一个整体单元取下，以处理提取后的溶剂。倾斜冷凝柱，使溶剂虹吸进入下方的接收瓶中。使用镊子将萃取套管提升至萃取柱颈部稍下方位置。将多余的溶剂排干后，把套管放置在干净的表面上。断开烧瓶连接，并将废液倒入贴有标签的溶剂容器中。依次使用极性逐渐降低的溶剂重复提取步骤，例如氯仿和紫杉烷，每种溶剂处理12小时。待番茄表皮样品干燥后，称量其质量，并在室温下置于用Parafilm密封的螺旋盖瓶中保存。为进行核磁共振（NMR）分析，取4至6毫克完全脱蜡的番茄角质层（称为角质）样品，放入1.6毫米快速魔角旋转氧化锆转子中，并使用厂商提供的装样工具进行装填。安装顶盖后，用黑色记号笔将顶盖的一半涂黑，以便测量旋转速率。固体核磁共振实验的初始设置是一个技术要求较高的过程，需在经验丰富的工作人员指导下完成。首先使用标准样品化合物，按照书面实验方案中所述方法调节磁场均匀性并优化实验参数。然后将装好样品且密封的转子插入探头，并将探头置入磁体中。逐步增加转速至10千赫兹，以确认样品填充良好，并验证转子在转速变化小于20赫兹的情况下能够稳定旋转。反复调节探头的调谐和匹配电容，使在质子和碳13核磁共振频率下均达到最小的功率反射。将实验温度设定为25摄氏度。在10 kHz旋转频率下确定Hartman-Hahn质子-碳匹配条件后，启动预优化的CPMA实验。采集4,096次累加信号后，对谱图进行50至100 Hz的指数线宽加宽处理，并进行傅里叶变换，得到以百万分之一（ppm）为单位的化学位移对应的信号强度NMR谱图。按照文中所述方法对碳-13化学位移进行化学位移基准校准。将转子旋转频率提高至15千赫兹，并重复进行C-P-M-A-S测量，该测量对应于通过梯形旋转频率下的C-P-M-A-S碳化学偏移分析所确定的Hartman Han匹配条件。13C核磁共振谱鉴定了在经充分脱蜡处理的番茄表皮蜡质中主要存在的官能团，包括长链聚羟基烷酸酯（PHAs）、含氧PHAs、多重键合的芳香族化合物以及碳的产率。其中，含氧化合物在表皮聚酯生物聚合物单体单元之间形成共价连接中起关键作用，从而构建出表皮聚酯基质的分子结构。在百万分之45至100的光谱区域中观察到的相对峰面积差异表明，与野生型角质相比，突变体角质含有相对较高比例的可形成交联的CHO结构单元。为开始选择性分离表皮外和表皮内蜡质。用蒸馏水清洗第二批完整的番茄。用纸巾和Kim擦拭布擦干，并将它们茎部朝下放置在一张铝箔纸上。用120%的阿拉伯胶水溶液从顶部到底部均匀涂刷整个番茄。让阿拉伯胶在果实表皮上干燥一小时，形成一层薄膜。用镊子去除该薄膜，但避免刺破番茄表皮。按照文中所述对薄膜进行进一步处理，可得到表皮角质层蜡质。番茄将保持物理完整性。将它们浸入氯仿中两分钟。在室温下，待溶剂蒸发后可收集表皮蜡质，剥去番茄表皮，并用纤维素酶和果胶酶以及醋酸钠缓冲液进行酶处理，以分别去除纤维素和果胶。随后可按照前文所述方法进行溶剂提取，以彻底脱除番茄角质层中的蜡质。文中所述的C-P-M-A-S实验可使用天然及部分脱蜡的果实角质层样品重复进行。原子力显微镜的设置过程较为复杂，最好在经验丰富的技术人员初始指导下完成。进行调频（FM）模式时，首先打开扫描探针显微镜（简称SPM），并确保显微镜模式切换开关已设定为接触式原子力显微镜模式。接下来，通过旋转SPM探头的两个用户可调节的前部旋钮，手动抬升SPM探头。通过旋转探头后部的夹紧螺丝，将FM探针 holder 从SPM探头上拆下。使用镊子将现有的FM悬臂梁从其 holder 中取出。然后小心地从包装中取出一个新的带有氮化硅针尖的悬臂，并将其安装到原悬臂的位置。使用光学显微镜检查新安装的FM悬臂是否完好无损。用双面胶带将番茄表皮样品固定在样品载片上。使用光学显微镜确认角质层样品保持平整且光滑。将样品放置于样品托上后，把附着在样品托上的番茄角质层样品置于SPM扫描仪顶部的磁性区域。通过旋转旋钮，将扫描仪前部的两个手动螺钉调至足够高度，以避免损坏原子力显微镜（AFM）探针。将探针支架放入SPM探头时，调节电动后部螺钉，使其高度大致与其他两个前部螺钉齐平。重新将探针支架插入SPM探头，并拧紧探头后部的夹紧螺钉以固定。打开激光后，使用探头上方的中央和右侧激光调节旋钮，将激光光斑对准FM悬臂梁。在一张纸上观察反射的激光束，以将激光光斑精确地定位在 FM 悬臂末端。调整激光光斑的位置以获得最大的总信号。通过水平和垂直调节可移动镜片的位置，调节光电探测器上反射激光光斑的位置，确保入射光被四个象限均匀接收。通过调节SPM扫描器的前部手动控制螺丝和后部电机驱动螺丝，降低探测器上的FM探针。使用倒置显微镜目视监测FM探针接近样品表面的过程。确保所有三个螺丝处于同一水平位置。为避免因样品倾斜成像而产生伪影，需将探针移向样品，但不可过于接近，以免接触或穿透样品表面。从原子力显微镜（AFM）悬臂反射的激光将经由可移动镜面反射至光电探测器，用于硅氮化物AFM探针的接触式AFM模式。通过调节镜面位置，将输出信号电压设为负2伏（对应零伏设定点），并将差分信号调整为零伏。使用 nano scope 软件。单击显微镜图标并选择适当的配置文件。在扫描控制设置面板中，设置扫描速率和扫描尺寸。单击“探针接触”图标，使原子力显微镜（AFM）探针接触样品表面。程序将通过控制SPM基座的电机化后部螺钉，逐步降低探针，直至其与样品表面接触。探针成功接触后，扫描过程将自动开始。使用软件的图像和显微模式监测扫描过程，根据书面方案中所述，逐步调整参数以获得最高分辨率的图像。例如，首先使用较大的Z轴数据尺度值开始扫描，然后仔细减小Z轴数据尺度值，以在图像上获得表面特征的最佳对比度。捕获图像以保存数据文件。使用平整化函数处理数据，以消除由于垂直扫描仪漂移、图像弯曲以及扫描线之间垂直偏移所导致的图像伪影。最后，计算平均粗糙度碳。13 C-P-M-A-S-N-M-R 谱图显示，在 31 百万分之一处的蜡质峰逐渐减弱，表明从表皮与蜡质复合物中依次去除了表皮蜡和内层蜡，同时保留了角质生物聚合物的主要化学结构。原子力显微镜图像分析揭示了由于逐步提取果实角质层中的表皮蜡和内层蜡所导致的表面不规则性，表明角质层组装结构发生了改变。一旦掌握该技术，便可于两小时内完成对番茄果实角质层中表皮蜡和内层蜡的逐步去除。在对果实角质层进行彻底萃取时，使用接触角测量后，应采用一系列极性不同的溶剂进行固相萃取。本文展示了该FM方案。此外，还可利用其他A FM实验来测定角质层表面的弹性。观看本视频后，您应能够充分理解如何系统地从角质-蜡质复合物中分离组分，并利用固态核磁共振（MR）和原子力显微镜（FM）分别对角质层材料进行分子表征和快速表面分析。本视频所展示的技术使植物生物学领域的研究人员能够确定天然及人工改造植物组织的分子组成和超分子结构。

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