Name: 改良酵母双杂交系统，以确定蛋白与生长因子Progranulin的相互作用 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-01-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 56 s
Description: 了解改良酵母双杂交系统如何显著降低假阳性率并提高蛋白质相互作用筛选的可靠性。该方法通过竞争性抑制筛选和生物信息学分析验证阳性克隆，为研究生长因子Progranulin的相互作用提供高效工具。

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本工作由美国国立卫生研究院研究基金 K01AR053210、R01AR061484 及国家银屑病基金会的一项资助支持。

1. 背景信息
酵母双杂交系统是一种强大的遗传学技术，用于发现蛋白质-蛋白质相互作用16, 17。目前已有多类双杂交系统实现商业化，例如基于lexA的系统、Sos招募系统以及基于细菌或哺乳动物细胞的双杂交系统；本文则重点介绍最常用的基于GAL4的酵母双杂交系统的改进方法。该方法的基本原理在于酵母GAL4蛋白具有可分离的DNA结合域和转录激活域。诱饵蛋白与GAL4 DNA结合域（DNA-BD）融合表达，而猎物蛋白则与GAL4激活域（AD）融合表达。当诱饵与猎物融合蛋白发生相互作用时，可激活含有GAL4结合位点的报告基因转录，这些报告基因已整合于酵母基因组中。酵母双杂交（Y2H）的原理如图1所示，其实验流程总结于图2。
2. 所需材料与溶液
<ol>
	<li>YPD培养基（一种由蛋白胨、酵母提取物和葡萄糖按适宜比例混合而成的培养基，适用于培养大多数酵母菌） 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae） 菌株）。</li>
	<li>最小合成定义培养基基础（Minimal synthetic defined (SD) 培养基基础包含酵母氮源基础、硫酸铵和碳源右旋糖。可向最小合成定义培养基基础中添加缺失营养成分补充剂（DO 补充剂），以制备缺乏特定营养成分的合成定义培养基）。</li>
	<li>亮氨酸/色氨酸缺陷型（DO）补充剂（包含除亮氨酸和色氨酸外的所有必需氨基酸）</li>
	<li>-组氨酸/-亮氨酸/-色氨酸/-尿嘧啶 缺失（DO）补充剂（含有除亮氨酸、色氨酸、组氨酸和尿嘧啶外的所有必需氨基酸）</li>
	<li>LB培养基（胰蛋白胨 10 g/L，酵母提取物 5 g/L，NaCl 5 g/L）</li>
	<li>X-Gal（5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-半乳糖吡喃苷）溶液：用N,N-二甲基甲酰胺配制成20 mg/ml的储存液</li>
	<li>10X TE（100 mM Tris-HCl (pH 7.5)，10 mM EDTA，经高压灭菌）</li>
	<li>超声处理的鲱鱼或鲑鱼精子DNA，煮沸（10 mg/ml）</li>
	<li>10X LiAc（1 M 醋酸锂，经高压灭菌）</li>
	<li>50% PEG-3350 溶液，滤膜除菌</li>
	<li>3-氨基-1,2,4-三唑（3AT）</li>
	<li>卡那霉素</li>
	<li>氨苄青霉素</li>
	<li>ELECTROMAX DH5α 细胞</li>
	<li>Z缓冲液：将16.1 g Na2HPO4·7H2O（或8.52 g无水物）、5.5 g NaH2PO4·H2O（或4.8 g无水物）、0.75 g KCl、0.246 g MgSO4·7H2O（或0.12 g无水物）溶于1 L经高压灭菌的蒸馏水中，调节pH至7.0。</li>
</ol>
3. 钓饵质粒构建（pDBLeu-PGRN）
将编码缺乏信号肽（氨基酸21-588）的PGRN的cDNA片段定向克隆至pDBLeu载体（ProQuest双杂交系统，Invitrogen）的Sal I-Not I位点，保持与GAL4 DNA结合域相同的翻译阅读框，以构建pDBLeu-PGRN。
<ol>
	<li>使用设计好的寡核苷酸引物，通过 PCR 扩增上述 PGRN 的 cDNA 片段，引物中包含限制性酶切位点（5′端为 Sal I，3′端为 Not I），以实现同框融合。</li>
	<li>对 PCR 产物进行琼脂糖凝胶纯化，随后用限制性内切酶 Sal I 和 Not I 进行酶切消化。 
	 同时，使用相同的限制性内切酶对 DB 载体 pDBLeu 进行双酶切，以制备线性化载体。</li>
	<li>将经限制性酶切的 PGRN 片段连接至线性化的 pDBLeu 载体中，并转化至 DH5α 感受态细胞，于含有卡那霉素（25 μg/ml）的 LB 培养基中进行筛选。</li>
	<li>通过 DNA 测序验证构建质粒的正确性。</li>
</ol>
4. 诱饵质粒的小规模转化
<ol>
	<li>取一株Mav203（Invitrogen）菌落接种于5 ml YPD培养基中，30°C振荡培养过夜。</li>
	<li>将过夜培养物按1:10比例稀释至50 ml YPD培养基中，继续培养2-4小时。</li>
	<li>室温下3000 rpm离心5分钟收集菌体，用40 ml灭菌蒸馏水重悬菌体沉淀。</li>
	<li>再次离心收集菌体，用2 ml溶液I重悬，室温孵育10分钟。 
溶液I：0.5 ml 10xLiAc，0.5 ml 10xTE，4 ml H2O</li>
	<li>向各离心管中加入DNA：2-3 μl pDBLeu-PGRN（0.25 μg/μl）和10 μl变性剪切的鲑鱼精DNA（10 μg/μl）。加入100 μl酵母细胞，充分混匀。</li>
	<li>加入700 μl溶液II，充分混匀，30°C孵育30分钟。溶液II：0.2 ml 10xLiAc，0.2 ml 10xTE，1.6 ml 50% PEG3350。</li>
	<li>42°C热激15分钟。</li>
	<li>2分钟离心，弃上清，用200 μl灭菌蒸馏水重悬菌体沉淀。</li>
	<li>将菌液进行系列稀释后涂布于SD-Leu平板，30°C培养2-3天。</li>
</ol>
5. 钓饵验证
在进行酵母双杂交筛选之前，需检测 pDBLeu-PGRN 是否存在自激活现象，并确定 HIS3 报告基因的基础表达水平。该检测可判断诱饵蛋白是否能够激活转录，以及自激活是否可通过抑制剂消除。3-氨基-1,2,4-三唑（3-AT）是 HIS3 基因产物的竞争性抑制剂，可用于滴定在组氨酸缺陷培养基上生长所需的最低 HIS3 表达水平。
<ol>
	<li>将 pDBLeu-PGRN 转化至酵母 Mav203 菌株中，将转化产物涂布于 SD-Leu 平板上，并在 30°C 下培养 48–72 小时。</li>
	<li>使用灭菌牙签从每次转化的菌落中取样，点种到含有不同浓度（10 mM、25 mM、50 mM、75 mM 和 100 mM）3-AT 的 SD-Leu-His 平板上。3-AT 是 HIS3 酶的竞争性抑制剂，只有表现出自激活效应的诱饵才能在 3-AT 存在下生长。</li>
	<li>在含 100 mM 3-AT 的平板上仍能生长的诱饵菌株不适合用于双杂交筛选。对于可用的诱饵菌株，应选用能够抑制细胞生长的最低 3-AT 浓度。在多数情况下，筛选时使用 25 mM 的 3-AT。</li>
</ol>
6. cDNA 文库筛选
将pDBLeu-PGRN质粒通过小规模转化方法导入MaV203中，具体操作如上所述。为将pPC86文库（Invitrogen）导入MaV203（pDBLeu-PGRN）中，以下所述步骤通常在使用0.5 μg质粒文库DNA时可获得约4 × 104个菌落。因此，获得2.5 × 106个酵母转化子需要约30.0 μg的pPC86-cDNA文库质粒DNA、25次转化反应以及50块10 cm培养板（SD-Leu-Trp-His-Ura+3AT）。
<ol>
	<li>准备适当数量的 10-cm SD-Leu-Trp-His-Ura+3AT 平板（以下操作需准备 50 个）。同时准备至少四个 10-cm SD-Leu 平板，用于估算转化子数量。</li>
	<li>按照下述步骤，将文库转化至含有 pDBLeu-PGRN 的 MaV203 菌株中。
	<ol>
		<li>取 MaV203 (pDBLeu-PGRN) 的数个单菌落，悬浮于约 100 μl 经高压灭菌的去离子水中，均匀涂布于一个 10-cm SD-Leu 平板上。对第二个 SD-Leu 平板重复相同操作。将两个平板于 30°C 培养 18–24 小时。</li>
		<li>用刮菌铲收集菌体，并将其完全重悬于 10 ml 高压灭菌的去离子水中。取适量菌液加入锥形瓶中的 500 ml 液体 YPD 培养基，使 OD600 约为 0.1。</li>
		<li>接种后确认 OD 值约为 0.1。</li>
		<li>于 30°C 摇床培养，直至 OD600 达到约 0.4。</li>
		<li>新鲜配制以下溶液：
		<ol type="a">
			<li>通过混合 11 ml 10X TE、11 ml 10X LiAc 和 88 ml 高压灭菌水，配制 110 ml 1X TE/LiAc 溶液。</li>
			<li>通过混合 1.6 ml 10X TE、1.6 ml 10X LiAc 和 12.8 ml 50% PEG-3350，配制 16 ml PEG/LiAc 溶液。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>于室温下以 3000 g 离心 5 分钟，收集菌体。</li>
		<li>弃去上清液，用移液器反复吹打，将沉淀轻轻重悬于 100 ml 室温高压灭菌的去离子水中。</li>
		<li>于室温下以 3000 g 离心 5 分钟。</li>
		<li>弃去上清液，将菌体沉淀重悬于 50 ml 1X TE/LiAc 溶液中。</li>
		<li>于室温下以 3000 g 离心 5 分钟。</li>
		<li>弃去上清液，将沉淀最终重悬于 2.5 ml 1X TE/LiAc 溶液中。</li>
		<li>进行 25 次转化反应。将 2.5 ml 菌液、125 μl（10 μg/μl）变性并剪切的鲑鱼精 DNA 以及 30 μg cDNA 文库混合，通过移液器轻柔吹打混匀。加入 15 ml PEG/LiAc 溶液，再次轻柔混匀。将混合物分装至 25 个已灭菌的 1.5-ml 微量离心管中，每管 700 μl。</li>
		<li>于 30°C 水浴中孵育 30 分钟。</li>
		<li>于 42°C 水浴中热激 15 分钟。</li>
		<li>于室温下以 6,000 g 离心 1 分钟。小心弃去上清液，用移液器反复吹打，将每管沉淀轻轻重悬于 400 μl 高压灭菌的去离子水中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用涂布棒将每次转化反应的 200 μl 混合物分别涂布于单个 10-cm SD-Leu-Trp-His-Ura+3AT 平板（3AT 浓度：25 mM）上，25 个已灭菌的 1.5-ml 微量离心管可制备 50 个平板（SD-Leu-Trp-His-Ura +3AT）。</li>
	<li>于 30°C 培养 5–10 天。</li>
	<li>为评估转化效率，将其中一次转化反应液进行系列稀释（1:40；1:400 和 1:4000），并涂布于 SD-Leu-Trp 平板。于 30°C 培养 3 天后，计数菌落数并计算转化子总数。</li>
</ol>
7. X-gal 检测
<ol>
	<li>将菌落转移至YPD平板，30°C过夜培养。</li>
	<li>将圆形硝酸纤维素膜放置于YPD平板上，确保膜与平板之间无气泡。1-2分钟后，确认所有菌落均已转移至膜上（硝酸纤维素膜）。</li>
	<li>将膜菌落面朝上置于铝箔纸制成的舟形容器中。</li>
	<li>将膜放入液氮中，等待20秒，再完全浸入液氮中数分钟。</li>
	<li>取出膜使其解冻。</li>
	<li>同时配制以下试剂： 
	1.5 ml Z缓冲液 
	20 μl X-gal（20 mg/ml）</li>
	<li>在培养皿中加入Z缓冲液/X-gal混合液，其上放置一张Whatman滤纸。</li>
	<li>小心地将硝酸纤维素膜置于Whatman滤纸上。</li>
	<li>37°C孵育，直至出现蓝色菌落。</li>
</ol>
8. 重新转化实验
从文库筛选中获得的猎物融合蛋白（AD-Y）应保留与诱饵融合蛋白（DB-X）的相互作用，以激活报告基因；将猎物克隆和诱饵质粒重新转化至酵母中，可进一步消除假阳性结果，并有助于后续分析。
<ol>
	<li>从可能含有相互作用蛋白的酵母菌株中分离质粒DNA。</li>
	<li>将DNA转化至E. coli DH5α细胞中，将转化产物涂布于LB+100 μg/ml氨苄青霉素平板上，以选择性分离pPC86-cDNA文库，并在37°C下过夜培养。</li>
	<li>从平板上挑取数个菌落，接种至LB+100 μg/ml氨苄青霉素液体培养基中。</li>
	<li>制备质粒小量提取DNA，并使用Sal I和Not I进行双酶切限制性分析鉴定。</li>
	<li>将猎物质粒和诱饵质粒共转化至MaV203酵母菌株中，将转化混合物涂布于SC-Leu-Trp平板上，在30°C下培养2-3天。</li>
	<li>从SC-Leu-Trp平板上挑取三个不同的菌落，进行X-gal显色检测。</li>
</ol>
9. 测序与生物信息学分析
对从可能的真阳性克隆中分离得到的质粒DNA进行测序，利用BLAST程序将这些序列与GenBank中的序列进行比对，并鉴定出对应于已知基因的双杂交克隆。测序结果表明，上述获得的12个阳性克隆中有两个为细胞表面TNFR2（TNFRSF1B/CD120b；登录号 #NM_130426）。此外，PGRN与TNFR之间的相互作用通过多种蛋白质-蛋白质相互作用实验得到了验证，包括体外固相结合实验、免疫共沉淀、表面等离子共振分析以及流式细胞术检测14。
10. 代表性结果
筛选流程图如图3所示。通常在此步骤可获得50-100个阳性克隆候选株。我们在250万个以PGRN为诱饵筛选的转化子中，最初分离出54个阳性克隆候选株。随后通过X-gal检测对阳性克隆候选株进行验证。通常，约50%的假阳性克隆可通过X-gal检测被剔除。在此步骤中，我们获得了23个针对PGRN诱饵的阳性克隆候选株（图4）。将捕获克隆与诱饵载体重新共转化至酵母中，可进一步消除假阳性克隆；仍能激活报告基因的克隆很可能为真阳性。通常约有50%的阳性克隆候选株将被排除。最终，我们分离出12个在酵母中与PGRN发生相互作用的阳性克隆。
<img alt="显示蛋白质相互作用检测及报告基因表达结果的酵母双杂交示意图" src="/files/ftp_upload/3562/3562fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 1"> 
图1. 酵母双杂交系统原理
<img alt="蛋白质相互作用分析流程图：诱饵蛋白生成、cDNA文库筛选、生物信息学分析。" src="/files/ftp_upload/3562/3562fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 2"> 
图 2. 利用酵母双杂交系统鉴定蛋白质结合伴侣的实验流程
<img alt="酵母双杂交实验示意图；质粒转化，X-gal 检测，cDNA 融合分析。" src="/files/ftp_upload/3562/3562fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 3"> 
图 3. 酵母双杂交文库筛选流程图。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3562/3562fig3large.jpg" target="_blank">点击此处查看该图像的完整尺寸版本。</a>
<img alt="显示酶活性的微生物培养板对比，四分格设置中颜色变化。" src="/files/ftp_upload/3562/3562fig4.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 4"> 
图 4. 阳性克隆候选子的β-半乳糖苷酶检测。A，从文库筛选中获得的阳性克隆被转移至YPD平板，并在30°C下过夜培养；B，YPD平板上的所有菌落被转移至硝酸纤维素膜，并进行β-半乳糖苷酶活性检测。

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</ol>

未声明任何利益冲突。

酵母双杂交筛选已被证实是鉴定蛋白质相互作用的有效工具16, 17。与其他鉴定蛋白质结合伴侣的方法（如生化共纯化和蛋白质芯片）相比，酵母双杂交系统是一种灵敏的遗传学方法，可在相对简单的实验中筛选大量编码序列；此外，该方法可检测体内相互作用，且无需复杂的蛋白质纯化步骤。当然，酵母双杂交系统也存在局限性，例如缺乏必要的翻译后修饰、融合蛋白折叠不充分和/或稳定性不足，以及亚细胞定位的改变（蛋白质被带入细胞核，而这可能并非其真实的生理状态）。此外，某些能非特异性激活报告基因（如自激活蛋白）的蛋白质不能直接用作筛选猎物cDNA文库的诱饵。为了克服这一缺陷，通常使用单个功能结构域而非完整蛋白质作为诱饵，随后再通过多种方法利用完整蛋白质验证所发现的相互作用。例如，我们曾成功利用COMP的EGF样结构域作为诱饵，筛选出ADAMTS-7金属蛋白酶和前颗粒蛋白生长因子作为COMP的结合伴侣10, 13。
传统的筛选过程耗时较长，因为需要先将酵母转化子涂布于第一块三缺培养基（SD-Leu-Trp-His +3AT）上以筛选His+克隆，再将这些克隆转移到第二块三...

<table><tbody><tr><td>ProQuest 双杂交系统</td><td>Invitrogen</td><td>10835</td><td></td></tr><tr><td>YPD 生长培养基</td><td>Clontech Laboratories</td><td>630409</td><td></td></tr><tr><td>YPD 琼脂培养基</td><td>Clontech Laboratories</td><td>630410</td><td></td></tr><tr><td>最小SD琼脂基础培养基</td><td>Clontech Laboratories</td><td>630412</td><td></td></tr><tr><td>-Leu DO补充剂</td><td>Clontech Laboratories</td><td>630414</td><td></td></tr><tr><td>-Leu/-Trp DO补充剂</td><td>Clontech Laboratories</td><td>630417</td><td></td></tr><tr><td>-His/-Leu/-Trp/-Ura DO补充剂</td><td>Clontech Laboratories</td><td>630425</td><td></td></tr><tr><td>3-氨基-1,2,4-三唑（3AT）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8056</td><td></td></tr><tr><td>LB培养基（Luria broth）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L3022</td><td></td></tr><tr><td>X-Gal</td><td>Invitrogen</td><td>15520-034</td><td></td></tr><tr><td>超声处理的鲑精DNA</td><td>Stratagene, Agilent Technologies</td><td>201190</td><td></td></tr><tr><td>氨苄青霉素</td><td>AMRESCO</td><td>0339</td><td></td></tr><tr><td>硫酸卡那霉素</td><td>Invitrogen</td><td>11815-024</td><td></td></tr><tr><td>Subcloning Efficiency&amp;#8482; DH5&amp;#945;&amp;#8482; 感受态细胞</td><td>Invitrogen</td><td>18265-017</td><td></td></tr><tr><td>Trizma&amp;#174; 碱基</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6066</td><td></td></tr><tr><td>乙酸锂</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L4158</td><td></td></tr><tr><td>乙二胺四乙酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>ED</td><td></td></tr><tr><td>硝酸纤维素膜</td><td>Bio-Rad</td><td>162-0115</td><td></td></tr><tr><td>10 cm培养皿</td><td>ITI Scientific</td><td>CT-903</td><td></td></tr><tr><td>培养箱（30 &amp;#x00B0;C）</td><td>ATR (Ecotron)</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

改良的酵母双杂交系统用于鉴定与生长因子前颗粒蛋白相互作用的蛋白质

Modified Yeast-Two-Hybrid System to Identify Proteins Interacting with the Growth Factor Progranulin

颗粒蛋白前体（Progranulin，PGRN），也称为颗粒蛋白上皮素前体（granulin epithelin precursor，GEP），是一种由593个氨基酸组成的自分泌生长因子。已知PGRN在多种生理和疾病过程中发挥关键作用，包括早期胚胎发生、伤口愈合1、炎症2, 3以及宿主防御4。PGRN还具有神经营养因子功能5，PGRN基因的突变导致PGRN蛋白部分缺失，可引起额颞叶痴呆6, 7。我们近期的研究已将PGRN鉴定为软骨发育与降解的重要调控因子8-11。尽管PGRN在近二十年前即被发现，并在多种生理和病理状态下具有重要作用，但由于一直未能明确其结合受体，对PGRN功能的深入探索及其作用机制的研究受到显著限制。为解决这一问题，我们基于最常用的GAL4酵母双杂交系统，开发了一种改良的酵母双杂交（modified yeast two-hybrid，MY2H）方法。与传统的酵母双杂交筛选相比，MY2H显著缩短了筛选周期，并大幅减少了假阳性克隆的数量。此外，该方法具有良好的可重复性和可靠性，我们已成功利用该系统筛选出多种“诱饵”蛋白的结合蛋白，包括离子通道12、细胞外基质蛋白10, 13以及生长因子14。本文以PGRN为例，详细描述了该MY2H实验流程，该方法最终成功鉴定出TNFR2为首个已知的PGRN相关受体14, 15。

我们对传统的酵母双杂交筛选方法进行了改进，该方法是一种用于鉴定蛋白质相互作用的有效遗传学工具。这种改进显著缩短了实验周期，减轻了工作量，更重要的是减少了假阳性结果的数量。此外，该方法具有良好的可重复性和可靠性。

前颗粒蛋白（Progranulin，PGRN），又称颗粒蛋白前体（granulin epithelin precursor，GEP），是一种由593个氨基酸组成的自分泌生长因子。已知PGRN在多种生物学过程中发挥关键作用……

该MY双杂交系统对传统的酵母双杂交方案进行了改进，显著减少了假阳性结果的数量。首先，将诱饵质粒小规模转化至酵母中。随后，通过竞争性抑制剂筛选验证诱饵构建体，再在缺乏四种营养成分的培养板上筛选cDNA文库。通过XGL和反应测定验证阳性克隆，然后通过DNA测序和生物信息学分析鉴定潜在的相互作用蛋白。最终，这种改进的酵母双杂交系统显著提高了筛选过程的效率和成功率。传统的酵母双杂交系统以产生大量假阳性结果而闻名。本视频展示了一种经过改进的筛选流程，该流程显著提高了双点验证的效率。接下来，让我们开始吧。用5毫升过夜培养的MAV 2 0 3菌液接种50毫升YPD培养基，在30°C下培养2至4小时。然后离心收集酵母，经一次洗涤后，将菌体沉淀重悬于2毫升溶液一中，室温孵育10分钟。准备用于转化的DNA混合物。加入100微升酵母细胞并充分混匀。然后加入700微升溶液二并充分混匀。首先在 30°C 下孵育 30 分钟，然后进行热激。通过离心收集细胞，并将沉淀重悬于 200 µL 经高压灭菌的蒸馏水中。将该悬液进行系列稀释后，涂布于 SD LU 平板，在 30°C 下培养 2 至 3 天。此步骤可验证诱饵质粒是否能够激活转录，并确认这种自激活作用可被抑制剂（如三氨基三嗪，即 hiss three 基因产物的竞争性抑制剂）所中和。首先，将诱饵质粒转化至MAV203酵母中。将反应物涂布于SD-LU平板上，并在30°C条件下培养。为了筛选在三种不同浓度3-AT诱导下无自激活的菌落，使用经高压灭菌的牙签从每次转化的平板上挑取菌落，转接到含梯度浓度3-AT的SD-LU-His平板上，于30°C培养。 淘汰在含有100毫摩尔三唑的平板上生长的诱饵菌株，因其不适用于后续的双杂交筛选实验。对于剩余的诱饵菌株，选择能够抑制细胞生长的最低三唑浓度，用于cDNA文库筛选。取含有诱饵质粒的酵母单克隆数个，悬浮于100微升经高压灭菌的蒸馏水中，均匀涂布于两个10厘米的SD-Leu平板上。将两个培养皿在30摄氏度下孵育。用10毫升无菌水刮取并充分悬浮细胞。将蒸馏水灭菌，并接种500毫升液体YPD培养基。通过光谱、光度测定及在30摄氏度下培养来验证细胞密度。随后通过离心收集细胞。先用100毫升经高压灭菌的蒸馏水洗涤一次，再用50毫升溶液一洗涤一次。然后将沉淀重悬于2.5毫升溶液一中。加入变性的剪切鲑鱼精子DNA，以及CD NA文库，用移液器轻轻混匀。随后加入15毫升含40%聚乙二醇的溶液二。轻轻混匀，并将700 µL分装至25个经高压灭菌的1.5 mL微量离心管中，在30 °C水浴中孵育30分钟，随后在42 °C水浴中进行15分钟热激处理。通过离心收集细胞，轻轻将每个沉淀重悬于400 µL经高压灭菌的蒸馏水中。将每种转化混合物涂布于两块筛选平板上，在30 °C下培养5至10天，作为对照以评估反应体系的转化效率。对其中一个反应进行系列稀释。在30摄氏度下培养三天后，计数总菌落数。将菌落转移至YPD平板，在30摄氏度下过夜培养。然后将一张圆形硝酸纤维素膜直接置于YPD平板上，确保无气泡产生。一分钟后，检查所有菌落是否已转移至膜上。将膜的菌落面朝上置于铝箔船中，放在液氮表面持续20秒，然后浸入液氮中数分钟。现在取下膜进行解冻。同时，准备一个培养皿，内含新鲜的XCA溶液层Aman纸。然后小心地将解冻后的膜浸入其中，并在37°C下孵育。直到出现蓝色菌落。将猎物、克隆和诱饵构建体共同转入酵母，可进一步消除假阳性结果。首先，从可能含有相互作用蛋白的酵母菌株中分离质粒DNA。将DNA转化至大肠杆菌DH5α中，并通过在LB氨苄青霉素平板上培养进行筛选。通过限制性酶切分析筛选转化子。随后将猎物质粒和诱饵质粒共同转化至酵母MAV203中，涂布于SC-Leu-Trp平板，30°C下培养2至3天。选取三个不同的菌落进行xal检测序列，从阳性克隆中提取质粒DNA，并利用生物信息学方法鉴定基因。在本实验中，使用生长因子前体Grn（Pro Granulin）作为诱饵，筛选了脑cDNA文库，共获得54个阳性克隆。从250万个克隆中筛选出候选克隆。使用前颗粒蛋白诱饵对转化子进行筛选。通过离体颅骨实验进一步分析，发现23个对前颗粒蛋白诱饵呈阳性的克隆候选株。有趣的是，对测序数据的生物信息学分析鉴定出 TNF R two。确实如此。进一步的功能实验证实，颗粒体蛋白前体（progranulin）是 TT NF 受体的一种新型配体。观看本视频后，您应能充分理解如何针对您感兴趣的靶标执行这种改良的杂交筛选方法。请务必佩戴手套操作，因为所用的一些区域存在危险。祝您的实验顺利。

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Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

改良酵母双杂交系统，以确定蛋白与生长因子Progranulin的相互作用

MYTH技术能够灵敏地检测在模式生物酿酒酵母（Saccharomyces...

基于分裂泛素的膜酵母双杂交（MYTH）系统：鉴定蛋白质-蛋白质相互作用的有力工具

一种用于鉴定新型具有信号传导能力的跨膜受体的高内涵筛选方法被描述。该方法适用于大规模自动化，并可对受体功能进行预测 体内...

一种通过表达克隆研究Grb2信号复合物的高内涵成像工作流程

本视频演示了利用酵母双杂交实验检测特定蛋白质自身相互作用的方法。在该实验中，将目标蛋白分别与编码β-半乳糖苷酶的转录因子的两个结构域进行融合标记。当两个蛋白发生相互作用时，会启动转录和翻译过程，形成具有活性的酶，随后通过生化实验检测该酶的存在。...

酵母双杂交实验检测酵母细胞中蛋白质的自身结合能力

在本视频中，我们展示了改良的酵母单杂交实验方法，该方法可用于检测多种蛋白质与靶DNA的相互作用。转化后的酵母细胞在报告基因上游含有靶DNA序列，同时表达转录因子蛋白。当这些蛋白形成复合物并结合到靶DNA上时，报告基因将被表达，并可通过酶学方法进行检测。...

改良的酵母单杂交法检测异源蛋白复合物-DNA相互作用

本文重点介绍利用两种正交方法相结合的策略，鉴定宿主与病原体蛋白质之间高可信度相互作用数据集：酵母双杂交系统，随后进行一种称为高通量哺乳动物细胞相互作用检测（HT-GPCA）的高通量相互作用分析。...

宿主-病原体蛋白质-蛋白质相互作用图谱的比较研究方法

酮康唑可结合并拮抗妊娠X受体（PXR）的活化。通过酵母高通量筛选PXR突变体，确定了酮康唑结合的独特区域。这种基于酵母的遗传学方法可发现核受体与配体之间的新型相互作用，这些配体结合于受体表面的结合位点。...

利用反向酵母双杂交系统鉴定与配体和/或拮抗剂相互作用的哺乳动物核受体残基

利用高密度功能性蛋白质微阵列检测蛋白质-蛋白质相互作用

细菌效应蛋白对于成功建立感染至关重要。本实验方案描述了在细菌效应蛋白的天然植物宿主中，鉴定其蛋白质类结合伴侣的方法。鉴定这些效应蛋白的相互作用 通过...

利用酵母双杂交筛选解析不可培养植物病原菌效应子的功能

本文所述的改良型酵母单杂交检测方法是对经典酵母单杂交（Y1H）检测技术的扩展，可用于在异源系统中研究并验证任何功能基因组学中的异源蛋白复合物-DNA相互作用。...

一种用于异源蛋白复合物- DNA 相互作用研究的改良酵母单杂交系统

批量处理酵母双杂交筛选可实现多种诱饵蛋白与高度复杂的猎物融合蛋白集合之间相互作用谱的直接比较。本文介绍了优化的方法、新试剂及其在此类筛选中的应用方式。...

一种批量进行的酵母双杂交筛选方法用于比较蛋白质相互作用

生物分子之间的相互作用，例如蛋白质-蛋白质相互作用，是生物功能的分子基础。如果能够分离出特异性缺失相关相互作用的相互作用缺失或功能受损突变体，将极大有助于理解该相互作用的功能。本文介绍了一种高效分离相互作用缺失或功能受损突变体的方法。...

利用酵母双杂交实验分离相互作用缺失/受损突变体

了解改良酵母双杂交系统如何显著降低假阳性率并提高蛋白质相互作用筛选的可靠性。该方法通过竞争性抑制筛选和生物信息学分析验证阳性克隆，为研究生长因子Progranulin的相互作用提供高效工具。

改良的酵母双杂交系统用于鉴定与生长因子前颗粒蛋白相互作用的蛋白质

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