改良的酵母双杂交系统用于鉴定与生长因子前颗粒蛋白相互作用的蛋白质

该MY双杂交系统对传统的酵母双杂交方案进行了改进，显著减少了假阳性结果的数量。首先，将诱饵质粒小规模转化至酵母中。随后，通过竞争性抑制剂筛选验证诱饵构建体，再在缺乏四种营养成分的培养板上筛选cDNA文库。

通过XGL和反应测定验证阳性克隆，然后通过DNA测序和生物信息学分析鉴定潜在的相互作用蛋白。最终，这种改进的酵母双杂交系统显著提高了筛选过程的效率和成功率。

传统的酵母双杂交系统以产生大量假阳性结果而闻名。本视频展示了一种经过改进的筛选流程，该流程显著提高了双点验证的效率。接下来，让我们开始吧。

用5毫升过夜培养的MAV 2 0 3菌液接种50毫升YPD培养基，在30°C下培养2至4小时。然后离心收集酵母，经一次洗涤后，将菌体沉淀重悬于2毫升溶液一中，室温孵育10分钟。

准备用于转化的DNA混合物。加入100微升酵母细胞并充分混匀。然后加入700微升溶液二并充分混匀。

首先在 30°C 下孵育 30 分钟，然后进行热激。通过离心收集细胞，并将沉淀重悬于 200 µL 经高压灭菌的蒸馏水中。将该悬液进行系列稀释后，涂布于 SD LU 平板，在 30°C 下培养 2 至 3 天。此步骤可验证诱饵质粒是否能够激活转录，并确认这种自激活作用可被抑制剂（如三氨基三嗪，即 hiss three 基因产物的竞争性抑制剂）所中和。

首先，将诱饵质粒转化至MAV203酵母中。将反应物涂布于SD-LU平板上，并在30°C条件下培养。为了筛选在三种不同浓度3-AT诱导下无自激活的菌落，使用经高压灭菌的牙签从每次转化的平板上挑取菌落，转接到含梯度浓度3-AT的SD-LU-His平板上，于30°C培养。

淘汰在含有100毫摩尔三唑的平板上生长的诱饵菌株，因其不适用于后续的双杂交筛选实验。对于剩余的诱饵菌株，选择能够抑制细胞生长的最低三唑浓度，用于cDNA文库筛选。取含有诱饵质粒的酵母单克隆数个，悬浮于100微升经高压灭菌的蒸馏水中，均匀涂布于两个10厘米的SD-Leu平板上。

将两个培养皿在30摄氏度下孵育。用10毫升无菌水刮取并充分悬浮细胞。将蒸馏水灭菌，并接种500毫升液体YPD培养基。

通过光谱、光度测定及在30摄氏度下培养来验证细胞密度。随后通过离心收集细胞。先用100毫升经高压灭菌的蒸馏水洗涤一次，再用50毫升溶液一洗涤一次。

然后将沉淀重悬于2.5毫升溶液一中。加入变性的剪切鲑鱼精子DNA，以及CD NA文库，用移液器轻轻混匀。随后加入15毫升含40%聚乙二醇的溶液二。

轻轻混匀，并将700 µL分装至25个经高压灭菌的1.5 mL微量离心管中，在30 °C水浴中孵育30分钟，随后在42 °C水浴中进行15分钟热激处理。

通过离心收集细胞，轻轻将每个沉淀重悬于400 µL经高压灭菌的蒸馏水中。将每种转化混合物涂布于两块筛选平板上，在30 °C下培养5至10天，作为对照以评估反应体系的转化效率。对其中一个反应进行系列稀释。

在30摄氏度下培养三天后，计数总菌落数。将菌落转移至YPD平板，在30摄氏度下过夜培养。然后将一张圆形硝酸纤维素膜直接置于YPD平板上，确保无气泡产生。

一分钟后，检查所有菌落是否已转移至膜上。将膜的菌落面朝上置于铝箔船中，放在液氮表面持续20秒，然后浸入液氮中数分钟。

现在取下膜进行解冻。同时，准备一个培养皿，内含新鲜的XCA溶液层Aman纸。然后小心地将解冻后的膜浸入其中，并在37°C下孵育。

直到出现蓝色菌落。将猎物、克隆和诱饵构建体共同转入酵母，可进一步消除假阳性结果。首先，从可能含有相互作用蛋白的酵母菌株中分离质粒DNA。

将DNA转化至大肠杆菌DH5α中，并通过在LB氨苄青霉素平板上培养进行筛选。通过限制性酶切分析筛选转化子。随后将猎物质粒和诱饵质粒共同转化至酵母MAV203中，涂布于SC-Leu-Trp平板，30°C下培养2至3天。

选取三个不同的菌落进行xal检测序列，从阳性克隆中提取质粒DNA，并利用生物信息学方法鉴定基因。在本实验中，使用生长因子前体Grn（Pro Granulin）作为诱饵，筛选了脑cDNA文库，共获得54个阳性克隆。

从250万个克隆中筛选出候选克隆。使用前颗粒蛋白诱饵对转化子进行筛选。通过离体颅骨实验进一步分析，发现23个对前颗粒蛋白诱饵呈阳性的克隆候选株。

有趣的是，对测序数据的生物信息学分析鉴定出 TNF R two。确实如此。进一步的功能实验证实，颗粒体蛋白前体（progranulin）是 TT NF 受体的一种新型配体。观看本视频后，您应能充分理解如何针对您感兴趣的靶标执行这种改良的杂交筛选方法。

请务必佩戴手套操作，因为所用的一些区域存在危险。祝您的实验顺利。