小鼠肺树突状细胞的分离

本实验的总体目标是获得高纯度的小鼠肺树突状细胞制备物。首先在不包含引流淋巴结的情况下收集肺组织，随后通过胶原酶消化获得单细胞悬液。

接下来的步骤是使用磁性细胞分离系统富集 CD11c 阳性细胞。现在，通过流式细胞术分选获得传统树突状细胞亚群。最终，从小鼠肺组织中分离得到的传统树突状细胞可通过流式细胞术和光学显微镜进行分析。

该方法有助于解答免疫学领域的一些关键问题，例如传统树突状细胞亚群在呼吸道先天免疫和感染性疾病中的作用是什么？本实验操作将由我实验室的研究助理Issa Lancelin与我共同演示。在处死小鼠后，首先剪开并轻轻向后剥离腹膜外层皮肤，以暴露胸腔。

通过切开肋骨暴露膈肌，以显露心脏和肺。心脏和肺暴露后，即可开始灌注操作。用五毫升注射器抽取EDTA-HBSS，并在注射器上连接25号针头。

然后将针头插入右心室以防止注射时漏液。用镊子夹住针头周围的心肌组织，保持固定。在维持恒定压力的同时，缓慢注入溶液。

准确的灌注将导致肺部膨胀，并变为粉红色或白色。为避免潜在污染，去除并丢弃引流淋巴结。随后收集肺组织，将切除的器官转移至冰上的培养皿中。用5毫升肺胶原酶消化液填充gentle max C管，然后将肺组织切成小块。

使用剃须刀片将组织轻轻转移到管中，并进行最大解离。为获得单细胞悬液，选择程序 M lung zero one。随后将样品在 37°C 下孵育 30 分钟，每 5 分钟摇动试管一次，以重新悬浮组织碎片，然后继续执行程序 M lung zero two。

现在将样品转移至15毫升锥形管中，在4°C条件下以335 × g离心10分钟。弃去上清液，向沉淀中加入2毫升CK裂解缓冲液，在室温下作用1分钟以裂解残留的红细胞。然后用13毫升含0.5% BSA的冷PBS洗涤细胞。

弃去上清液后，再次将该沉淀重悬于5 mL含BSA的冷PBS中，然后将细胞悬液通过100 µm尼龙滤网。最后通过台盼蓝排斥法测定总细胞数。替代温和解离法的操作是，每肺组织加入5 mL胶原酶溶液至15 mL锥形管中。

将切碎的肺组织加入离心管中，在37摄氏度下孵育肺组织1小时。每15分钟涡旋振荡细胞一次，以重新悬浮组织碎片。然后通过连接20号针头的3毫升注射器将样品反复推注6至8次，以破碎消化的组织。

在操作过程中避免产生气泡。首先，将单细胞悬液在4°C条件下以200 × g离心10分钟，弃去上清液。然后将细胞重悬于400 µL分离缓冲液中。

使用0.5微克抗CD16/32抗体阻断Fc介导的非特异性抗体结合，置于冰上孵育六细胞30分钟，温度为4摄氏度。用10毫升冷分离缓冲液洗涤细胞后，将细胞重悬于400微升分离缓冲液中。然后加入100微升CD11c微珠，作用于八分之一个总细胞数，充分混匀，并将细胞与微珠混合液置于冰箱中孵育15分钟。

用 10 毫升冷分离缓冲液去除未结合的磁珠后，弃去上清液，并将细胞沉淀重悬于 1 毫升冷分离缓冲液中。最后，将样品加入 AutoMax pro 分离仪，运行 P-O-S-S-E-L-D 程序，以收集表达 CD11C 的细胞组分。

将富集的 CD11C 阳性细胞悬液与抗 CD11C PE-Cy7 抗体以及针对这些细胞表面 MHC II 类分子的抗体在 4°C 条件下孵育 30 分钟。用预冷的含 BSA 的 PBS 洗涤细胞后，将细胞重悬于 0.5 毫升含 BSA 的 PBS 中，并通过 40 微米尼龙滤网过滤。最后，将纯化的 CD11C 阳性细胞加入离心管中，用于后续在单独的空白管中进行定量分析。

向5毫升收集管中加入100微升含BSA的PBS，以防止纯化细胞受损，并在分选过程中始终保持过滤后的细胞悬液处于冷藏温度。在这些密度图中，脾脏中发现的传统树突状细胞数量是肺组织中的三倍以上。此外，在肺组织中，CD11c阳性细胞包含一个非传统树突状细胞的细胞群，表现为位于传统树突状细胞门控范围之外的MHC II类分子低表达事件群。

如该密度图左侧所示，通过 CD11c 磁珠分选富集总肺细胞后，传统树突状细胞的比例从约占总细胞数的 1.5% 提高到约 16.5%。然而，在分离过程的此阶段，CD11c 阳性且 MHC II 类分子低表达的巨噬细胞仍占总细胞群的 70% 以上，对富集后的肺传统树突状细胞亚群纯度造成显著污染。然而，通过流式细胞分选（FACS）可将传统树突状细胞的纯度提高至 96% 以上，如右上角显微照片所示。其中 CD11c 高表达且 MHC II 类分子高表达的传统树突状细胞呈圆形，具有典型的树突状突起；而右下角显微照片中所示的 CD11c 高表达但 MHC II 类分子低表达的细胞，则表现出更类似于巨噬细胞形态的细胞突起。

在进行该操作时，重要的是要牢记在指定温度下处理肺组织和单细胞制备物，因为这对维持细胞活力和常规树突状细胞的得率至关重要。观看本视频后，您应能充分掌握如何从小鼠肺组织中分离树突状细胞亚群。

分离肺部树突状细胞亚群是深入了解这些细胞在应对可触发肺部宿主免疫反应的呼吸道病原体和环境因素时所发挥功能的非常有用的工具。