Name: 小鼠肺树突状细胞的分离 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-11-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 4 s
Description: 学习使用胶原酶消化和磁珠分选技术从小鼠肺组织中分离常规树突状细胞的方法。该流程结合流式细胞术可获得高纯度细胞，适用于研究肺部免疫应答机制。

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作者谨此感谢路易斯安那州立大学流式细胞术核心设施的Marilyn Dietrich在细胞分选方面的帮助，以及Peter Mottram在显微摄影方面的协助。本研究由飞行乘务员医学研究基金会、路易斯安那州立大学竞争性研究计划奖以及美国国立卫生研究院/过敏与传染病研究所资助，资助编号分别为P20 RR020159和R03AI081171。

1. 肺灌注与单细胞悬液制备
<ol>
 <li>通过腹腔注射戊巴比妥/甲苯噻嗪麻醉混合物（每只小鼠注射剂量为：戊巴比妥 1.8 mg，甲苯噻嗪 0.19 mg）实施安乐死，并通过股静脉放血。</li>
 <li>剪开并轻轻向后剥离腹膜外层皮肤，暴露胸腔。剪开肋骨以打开膈肌，暴露心脏和肺组织。</li>
 <li>使用装有 EDTA-HBSS（含 1 mM EDTA 的无钙/无镁 HBSS）的 5 ml 注射器轻柔灌注肺组织。连接 25 G 针头，并将其插入右心室。为防止注射过程中液体泄漏，使用镊子夹住针头周围的肌性心肌组织。在保持恒定压力的同时缓慢注入溶液。充分灌注后，肺组织将膨胀并变为粉白色。</li>
 <li>移除引流淋巴结，以避免该组织可能带来的污染。</li>
 <li>收集肺组织，转移至冰上培养皿中，使用刀片将其切成小块。</li>
 <li>将切碎的组织转移至 gentleMACS C 管中，每只肺加入 5 ml 胶原酶消化液（HBSS 中含 0.5 mg/ml I 型胶原酶 A、20 μg/ml IV 型牛胰 DN 酶、5% FBS、100 U/ml 青霉素和 100 μg/ml 链霉素）。</li>
 <li>使用 gentleMACS 组织解离仪制备单细胞悬液。选择程序：m_lung_01。将样品在 37 °C 下孵育 30 分钟，每 5 分钟振荡一次以重悬组织碎片。随后运行程序 m_lung_02。</li>
 <li>将样品转移至 15 ml 圆底离心管中，在 4 °C 下以 335 x g 离心 10 分钟。此后所有试剂和离心步骤均需在 4 °C 下进行，以防止细胞活力下降。</li>
 <li>弃去上清液，加入 2 ml ACK 裂解缓冲液，在室温下裂解残留红细胞 1 分钟。用 13 ml 冷 PBS/0.5% BSA 洗涤细胞，并在 4°C 下以 335 x g 离心 10 分钟。</li>
 <li>弃去上清液，将总细胞重悬于 5 ml 冷 PBS/0.5% BSA 中，并通过 100 μm 尼龙滤网过滤。</li>
 <li>使用台盼蓝排斥染色法测定总细胞数量。</li>
</ol>
2. 磁珠分离与CD11c+细胞富集
<ol>
 <li>将单细胞悬液在 4 °C 条件下以 200 x g 离心 10 分钟，弃去上清液。</li>
 <li>每 108 个总细胞用 400 μl 分离缓冲液（PBS、0.5% BSA 和 2 mM EDTA）重悬细胞沉淀。加入抗 CD16/CD32 抗体（0.5 μg/106 个细胞）于 4 °C 孵育 30 分钟，以阻断 Fc 受体介导的非特异性抗体结合。</li>
 <li>用 10 ml 冷分离缓冲液洗涤细胞，在 4 °C 条件下以 200 x g 离心 10 分钟。将细胞重悬于 400 μl 分离缓冲液中。</li>
 <li>每 108 个总细胞加入 100 μl CD11c MicroBeads。充分混匀后于冰箱（2–8 °C）孵育 15 分钟。</li>
 <li>用 10 ml 冷分离缓冲液洗涤细胞，在 4 °C 条件下以 200 x g 离心 10 分钟，弃去上清液。</li>
 <li>将细胞沉淀重悬于 3 ml 冷分离缓冲液中。</li>
 <li>使用 autoMACS ProTM 分离仪，选择 posseld 程序进行磁性分离，收集阳性组分（0.5 ml）。</li>
</ol>
3. 传统树突状细胞（cDC）的分离
<ol>
 <li>将富集的CD11c阳性细胞悬液与抗CD11c PE-Cy7和抗I-A/I-E（MHC-II）-FITC抗体在4 °C下孵育30分钟。抗体的最佳浓度为每106个细胞使用0.5 μg。</li>
 <li>用冷的PBS/0.5% BSA洗涤细胞，并在4 °C下以335 x g离心10分钟。将细胞重悬于0.5 ml PBS/0.5% BSA中，并通过40 μm尼龙滤网过滤。</li>
 <li>使用FACS Aria细胞分选仪在纯度模式下进行细胞分选。在收集管中加入100 μl PBS/0.5% BSA，以防止纯化后的细胞受损。在整个细胞分选过程中保持细胞处于冷藏温度。</li>
</ol>
4. 获得单细胞悬液和富集CD11c+细胞的替代方案
<ol>
 <li>可使用15 ml锥形管替代gentleMACS解离仪，将步骤1.5中研磨后的肺组织转移至含5 ml胶原酶溶液（每肺组织一份）的15 ml锥形管中，于37 °C孵育1小时。每隔15分钟涡旋振荡一次，以重悬组织碎片。将样本通过连接20 G针头的3 ml注射器反复推注6–8次，以机械方式解离组织。操作过程中应避免产生气泡，否则将影响细胞活力。获得单细胞悬液后，继续进行步骤1.8。</li>
 <li>可使用两根MACS柱手动操作，替代AutoMACSProTM分选仪，以实现CD11c细胞的磁珠分离富集。所选用的MACS柱类型需根据样本量进行适当选择。</li>
</ol>
5. 代表性结果：
肺部cDC被鉴定为CD11chi/MHC-IIhi细胞群体。如图1所示，与其他组织（如脾脏，占4.8%）相比，cDC所占比例较小，仅为1.4%。然而，与脾脏不同的是，肺部CD11c阳性细胞表达不同水平的MHC-II，其中包括一个不同于cDC的细胞群体。单细胞制备后，每只肺获得的总肺细胞数量约为3.0至3.8 x 107个细胞，细胞活力为60–70%，其中cDC亚群约占略高于1%。经CD11c磁珠分选后，cDC的比例较原始制备样本提高了约10倍（>16%）（图2A）。然而，表达低水平MHC-II的CD11c细胞（CD11chi/MHC-IIlo，即巨噬细胞）构成了一个高比例的污染细胞群体（>70%），并与肺cDC亚群混合存在。如图2B所示，在细胞分选步骤后，这些污染细胞被有效去除，cDC纯度达到>96%。整个实验流程结束后，每只肺通常可获得约5 x 104个cDC细胞。显微照片显示cDC具有典型的形态学特征，表现为具有典型树突状突起的圆形细胞（上图）。另一方面，CD11chi/MHC-IIlo细胞则代表了一个形态学上不同的亚群，其具有典型的巨噬细胞（MΦ）样细胞突起（下图）12。
<img alt="显示肺和脾脏cDC分析中CD11c与MHC-II表达的流式细胞术散点图。" src="/files/ftp_upload/3563/3563fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图1"> 
图1. 小鼠肺和脾脏中树突状细胞频率的差异。收集C57BL/6小鼠的肺和脾组织，并用胶原酶处理。胶原酶消化后，细胞用抗小鼠CD11c-PE-Cy7和抗小鼠I-A/I-E-FITC染色。代表性流式细胞术图显示肺和脾中cDC（CD11chi/MHC-IIhi）的百分比。
<img alt="磁分离示意图，CD11c/MHC-II 流式细胞术图谱、细胞分选结果、cDC 形态学。" src="/files/ftp_upload/3563/3563fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 2"> 
图 2. 从小鼠肺组织中分离cDC。 将小鼠肺单细胞悬液用抗CD11c磁珠标记后，通过自动细胞分选仪进行分离。A) 典型图显示在CD11c富集后cDC（CD11chi/MHC-IIhi）和巨噬细胞（MΦ，CD11chi/MHC-IIlo）群体的百分比。对富集后的细胞进一步使用抗小鼠CD11c-PE-Cy7和抗小鼠I-A/I-E-FITC抗体染色，分选双阳性细胞并进行流式细胞术分析。为鉴定其形态，将细胞进行细胞离心涂片，并采用改良的瑞氏-吉姆萨染色法染色。B) 代表性图谱显示细胞分选后cDC与MΦ的百分比。显微照片展示肺cDC和肺MΦ的典型图像。比例尺 = 20 μm。

<ol><li>Pulendran, B., Palucka, K., Banchereau, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensing+pathogens+and+tuning+immune+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Sensing pathogens and tuning immune responses.</a> Science. 293, 253-256 (2001).</li>
<li>Banchereau, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunobiology+of+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Immunobiology of dendritic cells.</a> Annual Review of Immunology. 18, 767-811 (2000).</li>
<li>Manicassamy, S., Pulendran, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+cell+control+of+tolerogenic+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Dendritic cell control of tolerogenic responses.</a> Immunol. Rev. 241, 206-227 (2011).</li>
<li>Steinman, R. M., Cohn, Z. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+novel+cell+type+in+peripheral+lymphoid+organs+of+mice.+I.+Morphology%2C+quantitation%2C+tissue+distribution%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Identification of a novel cell type in peripheral lymphoid organs of mice. I. Morphology, quantitation, tissue distribution.</a> J. Exp. Med. 137, 1142-1162 (1973).</li>
<li>Asselin-Paturel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+type+I+IFN-producing+cells+are+immature+APCs+with+plasmacytoid+morphology%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Mouse type I IFN-producing cells are immature APCs with plasmacytoid morphology.</a> Nat. Immunol. 2, 1144-1150 (2001).</li>
<li>Chan, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interferon-producing+killer+dendritic+cells+provide+a+link+between+innate+and+adaptive+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">Interferon-producing killer dendritic cells provide a link between innate and adaptive immunity.</a> Nat. Med. 12, 207-213 (2006).</li>
<li>Taieb, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+dendritic+cell+subset+involved+in+tumor+immunosurveillance%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">A novel dendritic cell subset involved in tumor immunosurveillance.</a> Nat. Med. 12, 214-219 (2006).</li>
<li>Guerrero-Plata, A., Kolli, D., Hong, C., Casola, A., Garofalo, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subversion+of+pulmonary+dendritic+cell+function+by+paramyxovirus+infections%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Subversion of pulmonary dendritic cell function by paramyxovirus infections.</a> Journal of Immunology. 182, 3072-3083 (2009).</li>
<li>Larson, R. S., Springer, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+function+of+leukocyte+integrins%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Structure and function of leukocyte integrins.</a> Immunol. Rev. 114, 181-217 (1990).</li>
<li>Sung, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+major+lung+CD103+%28alphaE%29-beta7+integrin-positive+epithelial+dendritic+cell+population+expressing+Langerin+and+tight+junction+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">A major lung CD103 (alphaE)-beta7 integrin-positive epithelial dendritic cell population expressing Langerin and tight junction proteins.</a> J. Immunol. 176, 2161-2172 (2006).</li>
<li>Wang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Local+CD11c%2B+MHC+class+II-+precursors+generate+lung+dendritic+cells+during+respiratory+viral+infection%2C+but+are+depleted+in+the+process%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Local CD11c+ MHC class II- precursors generate lung dendritic cells during respiratory viral infection, but are depleted in the process.</a> J. Immunol. 177, 2536-2542 (2006).</li>
<li>Bhatia, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+host+defense+against+Aspergillus+fumigatus+involves+alveolar+macrophages+with+a+predominance+of+alternatively+activated+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Rapid host defense against Aspergillus fumigatus involves alveolar macrophages with a predominance of alternatively activated phenotype.</a> PLoS One. 6, e15943-e15943 (2011).</li>
<li>Shao, Z., Makinde, T. O., McGee, H. S., Wang, X., Agrawal, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fms-like+tyrosine+kinase+3+ligand+regulates+migratory+pattern+and+antigen+uptake+of+lung+dendritic+cell+subsets+in+a+murine+model+of+allergic+airway+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Fms-like tyrosine kinase 3 ligand regulates migratory pattern and antigen uptake of lung dendritic cell subsets in a murine model of allergic airway inflammation.</a> J. Immunol. 183, 7531-75381 (2009).</li>
<li>Hao, X., Kim, T. S., Braciale, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+response+of+respiratory+dendritic+cell+subsets+to+influenza+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Differential response of respiratory dendritic cell subsets to influenza virus infection.</a> J. Virol. 82, 4908-4919 (2008).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

从小鼠肺部分离树突状细胞是研究多种呼吸道刺激物的重要技术。获取这些细胞的过程包含若干关键步骤，以防止细胞丢失，并确保细胞的活力和纯度。在收集前对肺组织进行灌注，有助于清除外周血细胞并减少红细胞污染。当处理大量肺组织时，可采用自动化组织解离系统；否则可选择替代方案，但需注意在手动操作时，胶原酶消化后的组织分散过程应轻柔进行。肺组织在胶原酶溶液中的孵育时间不应超过规定时长。此步骤之后，所有操作必须使用预冷缓冲液并在冷藏离心机中进行，以减少细胞死亡。去除污染性红细胞的裂解步骤在整个过程中不应重复超过两次。在指定步骤中将细胞悬液通过尼龙筛网过滤，对于防止细胞分选仪堵塞以及减少细胞团块至关重要，后者会影响细胞纯度。若需进一步培养 体外 由于涉及分离细胞的操作，所有步骤必须在生物安全柜中进行，以防止任何污染。细胞分选步骤不会影响样品的无菌性。
树突状细胞对于研究先天免疫与适应性免疫的相互作用至关重要。如果在磁性分离和细胞分选过程中使用适当的抗体，所述方法有望应用于其他树突状细胞亚群的分离。 8此外，肺泡巨噬细胞（CD11c你好/M...

<table><tbody><tr><td>ACK 裂解缓冲液</td><td>Invitrogen</td><td>D6-0005DG</td><td></td></tr><tr><td>抗小鼠 CD11c（HL3）</td><td>BD Biosciences</td><td>5580979</td><td>PE-Cy7 标记</td></tr><tr><td>抗小鼠 I-A/I-E（269）</td><td>BD Biosciences</td><td>553623</td><td>FITC 标记</td></tr><tr><td>胶原酶 I 型 A</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>9891-500MG</td><td></td></tr><tr><td>细胞滤筛</td><td>BD Biosciences</td><td>352340, 352360</td><td></td></tr><tr><td>CD11c（N418）微珠</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-052-001</td><td></td></tr><tr><td>脱氧核糖核酸酶 I（DNase I）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5025-150KU</td><td></td></tr><tr><td>Hank&amp;rsquo;s 平衡盐溶液</td><td>Invitrogen</td><td>14170</td><td></td></tr><tr><td>HEPES 缓冲液</td><td>Invitrogen</td><td>15630</td><td></td></tr><tr><td>60 mm 培养皿</td><td>BD Biosciences</td><td>351016</td><td></td></tr><tr><td>GentleMACS&amp;#8482; C 管</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-237</td><td></td></tr><tr><td>Gentle MACS 组织解离仪</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-235</td><td></td></tr><tr><td>AutoMACS-Pro&amp;#8482;</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-092-545</td><td></td></tr><tr><td>FACS Aria</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

小鼠肺树突状细胞的分离

Isolation of Mouse Lung Dendritic Cells

肺树突状细胞（DC）在感知入侵病原体1,2以及调控呼吸道耐受性免疫应答3中发挥关键作用。在小鼠中，至少已鉴定出三种主要的肺树突状细胞亚群：传统树突状细胞（cDC）4、浆细胞样树突状细胞（pDC）5和干扰素产生型杀伤性树突状细胞（IKDC）6,7。其中，cDC亚群是肺中数量最多的树突状细胞亚群8。
已知用于鉴定树突状细胞亚群的共同标志物是CD11c，这是一种I型跨膜整合素（β2），也在单核细胞、巨噬细胞、中性粒细胞以及部分B细胞上表达。 9在某些组织中，使用 CD11c 作为标记物来鉴定小鼠树突状细胞是可行的，例如在脾脏中，大多数 CD11c+ 细胞代表表达高水平主要组织相容性复合物II类（MHC-II）的cDC亚群。然而，肺是一种更为异质性的组织，除树突状细胞（DC）亚群外，还存在大量表型独特的细胞群体，其表达高水平的CD11c但低水平的MHC-II。根据其表型特征，尤其是对F4/80（一种脾巨噬细胞标志物）的表达，该CD11c⁺细胞群体被鉴定为肺泡巨噬细胞。你好MHC-IIlo 肺细胞群体已被鉴定为肺泡巨噬细胞10，最近还被认为是潜在的树突状细胞前体 11. 
与小鼠浆细胞样树突状细胞（pDC）不同，由于缺乏可用于分离这些细胞的特异性标记物，目前对经典树突状细胞（cDC）在肺部免疫反应中特定作用的研究仍然有限。因此，本研究描述了一种用于分离高纯度小鼠肺部cDC的方法。肺树突状细胞亚群的分离是研究这些细胞在应对呼吸道病原体以及可触发肺部宿主免疫反应的环境因素时功能的重要工具。

本文介绍了一种高度纯化的小鼠肺树突状细胞的制备方法。重点在于分离传统的树突状细胞亚群。

肺树突状细胞（DC）在感知入侵病原体1,2以及调控耐受性免疫应答3中发挥关键作用

本实验的总体目标是获得高纯度的小鼠肺树突状细胞制备物。首先在不包含引流淋巴结的情况下收集肺组织，随后通过胶原酶消化获得单细胞悬液。接下来的步骤是使用磁性细胞分离系统富集 CD11c 阳性细胞。现在，通过流式细胞术分选获得传统树突状细胞亚群。最终，从小鼠肺组织中分离得到的传统树突状细胞可通过流式细胞术和光学显微镜进行分析。该方法有助于解答免疫学领域的一些关键问题，例如传统树突状细胞亚群在呼吸道先天免疫和感染性疾病中的作用是什么？本实验操作将由我实验室的研究助理Issa Lancelin与我共同演示。在处死小鼠后，首先剪开并轻轻向后剥离腹膜外层皮肤，以暴露胸腔。通过切开肋骨暴露膈肌，以显露心脏和肺。心脏和肺暴露后，即可开始灌注操作。用五毫升注射器抽取EDTA-HBSS，并在注射器上连接25号针头。然后将针头插入右心室以防止注射时漏液。用镊子夹住针头周围的心肌组织，保持固定。在维持恒定压力的同时，缓慢注入溶液。准确的灌注将导致肺部膨胀，并变为粉红色或白色。为避免潜在污染，去除并丢弃引流淋巴结。随后收集肺组织，将切除的器官转移至冰上的培养皿中。用5毫升肺胶原酶消化液填充gentle max C管，然后将肺组织切成小块。使用剃须刀片将组织轻轻转移到管中，并进行最大解离。为获得单细胞悬液，选择程序 M lung zero one。随后将样品在 37°C 下孵育 30 分钟，每 5 分钟摇动试管一次，以重新悬浮组织碎片，然后继续执行程序 M lung zero two。现在将样品转移至15毫升锥形管中，在4°C条件下以335 × g离心10分钟。弃去上清液，向沉淀中加入2毫升CK裂解缓冲液，在室温下作用1分钟以裂解残留的红细胞。然后用13毫升含0.5% BSA的冷PBS洗涤细胞。弃去上清液后，再次将该沉淀重悬于5 mL含BSA的冷PBS中，然后将细胞悬液通过100 µm尼龙滤网。最后通过台盼蓝排斥法测定总细胞数。替代温和解离法的操作是，每肺组织加入5 mL胶原酶溶液至15 mL锥形管中。将切碎的肺组织加入离心管中，在37摄氏度下孵育肺组织1小时。每15分钟涡旋振荡细胞一次，以重新悬浮组织碎片。然后通过连接20号针头的3毫升注射器将样品反复推注6至8次，以破碎消化的组织。在操作过程中避免产生气泡。首先，将单细胞悬液在4°C条件下以200 × g离心10分钟，弃去上清液。然后将细胞重悬于400 µL分离缓冲液中。使用0.5微克抗CD16/32抗体阻断Fc介导的非特异性抗体结合，置于冰上孵育六细胞30分钟，温度为4摄氏度。用10毫升冷分离缓冲液洗涤细胞后，将细胞重悬于400微升分离缓冲液中。然后加入100微升CD11c微珠，作用于八分之一个总细胞数，充分混匀，并将细胞与微珠混合液置于冰箱中孵育15分钟。用 10 毫升冷分离缓冲液去除未结合的磁珠后，弃去上清液，并将细胞沉淀重悬于 1 毫升冷分离缓冲液中。最后，将样品加入 AutoMax pro 分离仪，运行 P-O-S-S-E-L-D 程序，以收集表达 CD11C 的细胞组分。将富集的 CD11C 阳性细胞悬液与抗 CD11C PE-Cy7 抗体以及针对这些细胞表面 MHC II 类分子的抗体在 4°C 条件下孵育 30 分钟。用预冷的含 BSA 的 PBS 洗涤细胞后，将细胞重悬于 0.5 毫升含 BSA 的 PBS 中，并通过 40 微米尼龙滤网过滤。最后，将纯化的 CD11C 阳性细胞加入离心管中，用于后续在单独的空白管中进行定量分析。向5毫升收集管中加入100微升含BSA的PBS，以防止纯化细胞受损，并在分选过程中始终保持过滤后的细胞悬液处于冷藏温度。在这些密度图中，脾脏中发现的传统树突状细胞数量是肺组织中的三倍以上。此外，在肺组织中，CD11c阳性细胞包含一个非传统树突状细胞的细胞群，表现为位于传统树突状细胞门控范围之外的MHC II类分子低表达事件群。如该密度图左侧所示，通过 CD11c 磁珠分选富集总肺细胞后，传统树突状细胞的比例从约占总细胞数的 1.5% 提高到约 16.5%。然而，在分离过程的此阶段，CD11c 阳性且 MHC II 类分子低表达的巨噬细胞仍占总细胞群的 70% 以上，对富集后的肺传统树突状细胞亚群纯度造成显著污染。然而，通过流式细胞分选（FACS）可将传统树突状细胞的纯度提高至 96% 以上，如右上角显微照片所示。其中 CD11c 高表达且 MHC II 类分子高表达的传统树突状细胞呈圆形，具有典型的树突状突起；而右下角显微照片中所示的 CD11c 高表达但 MHC II 类分子低表达的细胞，则表现出更类似于巨噬细胞形态的细胞突起。在进行该操作时，重要的是要牢记在指定温度下处理肺组织和单细胞制备物，因为这对维持细胞活力和常规树突状细胞的得率至关重要。观看本视频后，您应能充分掌握如何从小鼠肺组织中分离树突状细胞亚群。分离肺部树突状细胞亚群是深入了解这些细胞在应对可触发肺部宿主免疫反应的呼吸道病原体和环境因素时所发挥功能的非常有用的工具。

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小鼠单核细胞来源树突状细胞的分离方案及其后续处理 体外 使用肿瘤免疫复合物激活

本文介绍一种经济高效的方法，通过在含10 ng/mL...

从小鼠骨髓分离和培养树突状细胞的经济高效方案

本文中，从新生小鼠分离并培养了原代肺内皮细胞。...

原代小鼠肺内皮细胞的分离

我们提供了一种详细的实验方案，通过磁珠法富集T细胞结合肽：主要组织相容性复合体（MHC）四聚体技术，从小鼠肺组织中分离并鉴定稀有的抗原特异性T细胞群体。...

利用肽：主要组织相容性复合体四聚体鉴定小鼠肺中稀有抗原特异性T细胞

本方案详细描述了从小鼠肺组织中分离稳态及流感病毒感染后活体免疫细胞和非免疫细胞群体的方法。同时提供了用于鉴定上皮细胞和髓系细胞亚群的设门策略。...

从小鼠肺组织中分离活体髓系细胞和上皮细胞群体

学习使用胶原酶消化和磁珠分选技术从小鼠肺组织中分离常规树突状细胞的方法。该流程结合流式细胞术可获得高纯度细胞，适用于研究肺部免疫应答机制。

小鼠肺树突状细胞的分离

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