测量肽在大单层囊泡中的转位

为了定量测定肽段穿过囊泡膜的转位。生成含有包封胰蛋白酶的荧光标记脂质囊泡。加入胰蛋白酶抑制剂以抑制任何外源性胰蛋白酶的活性，从而保留囊泡腔内具有活性的胰蛋白酶。

只有当荧光标记的肽段被添加到囊泡中时，其荧光标签才会作为FRET供体，激发囊泡上的荧光分子。然而，当蛋白质穿过膜时，会被胰蛋白酶消化，导致FRET信号消失。光谱分析可揭示肽段转位的程度，表现为随时间推移囊泡与肽段之间的FRET信号逐渐减弱。

与其他方法（包括其他脂质体技术以及测量肽进入细胞的方法）相比，该技术的主要优势在于能够提供关于膜穿透动力学的信息，并且如果肽含有色氨酸，则无需添加荧光标记。该方法有助于回答膜活性肽设计与工程中的关键问题，例如哪些特性是实现有效膜转位所必需的。本实验的第一步是制备大单层脂质体（UUVs），作为检测中的细胞膜模拟物。

首先将磷脂酰胆碱、磷脂酰甘油和1-磺基-8-萘胺-5-二甲基在氯仿中的磷脂酰乙醇胺按50:45:5的比例混合。通常，0.376毫克的总脂质足以制备一次实验组或对照组试验所需的脂质体。

准备一个样品管作为实验组，另一个作为对照组，使用氮气流吹干氯仿。此步骤后残留的干燥脂质称为脂质膜。将脂质膜在真空干燥器中干燥9至14小时。

接下来，配制10毫摩尔的HEI储备液、0.4毫摩尔的猪源胰蛋白酶储备液以及4.0毫摩尔的博曼-伯克制胰蛋白酶抑制剂储备液，具体配制方法详见随附文件。向干燥的脂质饼中加入等体积的0.4毫摩尔胰蛋白酶储备液和10毫摩尔HEI缓冲液。然后涡旋振荡小瓶，以重构多层囊泡（MVs）。对于对照组MVs的重构，向干燥的脂质饼中加入等体积的0.4毫摩尔胰蛋白酶储备液和4.0毫摩尔胰蛋白酶抑制剂，再像之前一样涡旋振荡。

一旦将 mvs 重悬后，将 MLV 溶液从玻璃小瓶转移至 1.7 毫升微量离心管中。随后将 MLV 溶液进行五次冻融循环，交替使用液氮和 30°C 水浴。接下来，通过在 Heiss 缓冲液中润湿两个滤膜支撑架来准备脂质挤出器。

然后将每个样品置于湿润的聚四氟乙烯（Teflon）挤出器部件上，并在两个聚四氟乙烯挤出器部件之间放置一张孔径为0.1微米的核孔径迹蚀刻膜。接着将挤出器部件放入金属挤出器筒体内，并在两个挤出器部件上方放置一个环形垫片。拧紧挤出器筒体的金属盖，然后将其安装到支架上，并使用250 µL玻璃注射器进行操作。

用500微升10毫摩尔的Hepe缓冲液填充挤出器空腔，以防止囊泡样品损失。将样品转移至10毫升烧杯中。

然后将每个MLV样品加入挤出器中，并使样品至少通过膜21次。为确保挤出后Ella囊泡大小均一，将大ELLAs脂质囊泡或L UUVs转移至1.7毫升微量离心管中。将UUVs在4°C下保存，并在48小时内使用。

为评估 LUV 浓度，需测定样品中的总磷含量。以下试剂应根据随附书面方案中的说明进行配制：8.9 mol/L 的 H₂SO₄、2.5%（重量/体积）的钼酸铵、6 mol/L 的 10%（重量/体积）抗坏血酸以及 0.65 mmol/L 的磷酸盐缓冲液。

按照此处所示配制六种磷标准品。然后配制一个大单层囊泡（LUV）空白样品，其中含有与对照组相同体积的 0.2 毫摩尔胰蛋白酶和 2.0 毫摩尔 Bowman BIR 抑制剂溶液。此步骤用于校正 Bowman B 抑制剂粉末中可能含有的干燥磷盐。

接下来，用移液器将约0.1微摩尔（通常约为25微升）的UUVs加入一次性玻璃培养管中，每组三个平行样。然后，向每个样品管、标准管和空白管中加入450微升8.9 mol/L的H₂SO₄。随后，将样品、标准品和空白样品置于175至210摄氏度的烘箱中加热25分钟。

25分钟后，从烘箱中取出所有试管，使其冷却。向每支试管中加入150 µL的30% H₂O₂溶液。然后将样品、标准品和空白样在175至210°C下再加热30分钟。

30分钟后，将样品、标准品和空白管从加热装置中取出。如果任何溶液尚未变为无色，则向所有试管中各加入50微升H2O，并在175至210摄氏度下继续加热15分钟。待溶液变为无色后，向每根试管中加入3.9毫升纳米纯水、0.5毫升钼酸铵溶液和0.5毫升抗坏血酸溶液。

然后将所有试管在沸水浴中加热5至7分钟，使用Agilent 8453紫外-可见分光光度计在820纳米处测定每个标准品和样品的吸光度。实验组和对照组LUV的浓度必须分别测定。

含有 0.0 毫摩尔磷的试管应作为所有标准品和实验用 LUV 样品的空白对照。含有 0.2 毫摩尔胰蛋白酶、2.0 毫摩尔骨和 bir 抑制剂溶液的试管应作为对照 LUV 样品的空白对照。应利用所得的吸光度与磷含量之间的线性标准曲线，计算各样品的总磷含量及 LUV 浓度。

配制肽溶液时，将肽溶解于超纯 H2O 中。本实验所用的肽必须含有一个色氨酸残基。以282纳米波长测定肽溶液的吸光度，重复三次。使用色氨酸的摩尔消光系数5,700计算肽的浓度。

以纳米纯水将肽稀释至终浓度为30 µM，于-20 °C保存。为定量转位，于1.7 mL微量离心管中制备实验组和对照组样品。向每种溶液中加入足量UUVs，使其终浓度为250 µM。

加入足量的Bowman BIR抑制剂溶液，使抑制剂的终浓度为胰蛋白酶浓度的10倍。加入足量的10毫摩尔海斯缓冲液，使最终溶液总体积达到450微升。取50微升肽溶液加入至石英微量荧光比色皿中，并将其放入分光光度计程序中。

使用荧光分光光度计进行一个25分钟的荧光动力学实验，在25摄氏度下，以280纳米为激发波长，525纳米为发射波长，每秒至少记录一次荧光读数。将PMT灵敏度调至最高后，将实验样品或对照样品加入qve中的肽溶液。应使终浓度立即达到三微摩尔，随即开始荧光动力学实验。

在实验组和对照组样品均完成运行后，按照随附文档中所述方法计算转位比率。当肽段与丹酰基团的比例足够高时，可确保几乎所有完整的肽段都处于足够接近丹酰基团的位置，从而产生FRET信号，即使这些肽段未转入囊泡内。这与在对照条件下观察到的结果一致：无论肽段是否转入囊泡，其FRET信号均相似。

易位实验的实施方法如本视频所述。该图展示了一种具有显著易位效果的代表性肽段的实验结果。本实验中由黑色轨迹表示的信号显示出明显的 FRET 信号下降。

随着时间的推移，较高的转位比率表明肽具有高效的转位能力。此处所示的穿膜肽的转位比率为1.19，而转位效率较低的肽其转位比率接近于1，以此作为对照，以排除因FRET信号不完全、抑制作用或其他与转位能力无关因素导致的信号损失。测量了肽与同时含有胰蛋白酶和博曼-布罗克（Bowman-Birk）胰蛋白酶抑制剂的UUVs之间的FRET信号。

如灰色轨迹所示。本实验数据凸显了使用含有胰蛋白酶抑制剂的UUVs作为对照实验的重要性。在此情况下，实验样品（以黑色轨迹表示）中的肽信号下降程度与前一张图中的下降程度相似。

然而，对照样品中该肽的减少速度更快，因此其净易位量较低。观看本视频后，您应能较好地掌握如何制备脂质体以及如何测量含色氨酸肽的易位过程。在尝试该实验操作时，重要的是要记住在肽与脂质体混合后立即开始采集数据。