Name: 评估拉莫斯B细胞的特定基因的过表达或击倒后的体细胞超突变 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-11-01T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 12 s
Description: 学习利用逆转录病毒或慢病毒感染技术，在Ramos B细胞中实现基因过表达或敲低，进而分析体细胞超突变及IgM水平变化，为抗体多样化机制研究提供新方法。

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pMSCV-AID-I-Thy1.1 和 pKat2 载体由 D. G. Schatz 惠赠，pVSV-G、pRSV-Rev 和 pMDLg/pRRE 载体由 B. R. Cullen 惠赠。

1. 样品和细胞的准备
<ol>
	<li>对过表达或含shRNA的载体以及逆转录病毒包装载体pKat2，或慢病毒包装载体pVSV-G、pMDLg/pRRE和pRSV-Rev25进行中等规模的DNA制备（中提）。每种构建体质粒使用6 μg DNA，若用于逆转录病毒感染，则使用4 μg pKat2；若用于慢病毒感染，则pVSV-g、pMDLg/pRRE和pRSV-Rev三种包装质粒各使用1.5 μg DNA。</li>
	<li>准备BOSC 23细胞培养基。转染时需使用未添加任何成分的DMEM（Dulbecco′s改良Eagle′s培养基）以及完全DMEM。配制完全DMEM时，向一瓶DMEM中加入1% HEPES缓冲液、1%青霉素-链霉素-谷氨酰胺（PGS）和10%新生牛血清（NCS）。</li>
	<li>准备Ramos细胞培养基。感染步骤中，通过向RPMI-1640培养基（RPMI）中添加1% HEPES、1% PGS和10%胎牛血清（FBS）配制完全RPMI培养基。在单细胞铺板步骤中，需制备“条件培养基”：将Ramos细胞在完全RPMI中培养2天，随后以400 × g离心4分钟，将上清液经0.2 μm滤器过滤至无菌瓶中。与其它完全培养基相同，条件培养基在4°C保存，待用时取出。</li>
	<li>转染前一天，将3 × 106个BOSC 23细胞接种于含10 mL完全DMEM的100 mm培养皿中，使转染当天细胞融合度达到50–60%。每种拟转染的载体需单独准备一个培养皿。需注意细胞不可长期传代培养；为确保良好的感染效率，转染和感染步骤均应使用低代次或近期复苏的细胞。</li>
	<li>实验中应设置对照组。在转染和感染实验中，需设立阴性对照（未转染或未感染细胞）和阳性对照（表达GFP和嘌呤霉素抗性基因的病毒）。在shRNA敲低实验中，需用乱序或无关的shRNA对照感染一个孔作为对照。</li>
</ol>
2. 转染 BOSC 23 细胞
<ol>
	<li>将未添加成分的 DMEM 和完全 DMEM 培养基瓶置于 37°C 预热。</li>
	<li>移除 BOSC 23 细胞中的培养基，并加入 5 mL 完全 DMEM。将细胞放回 37°C 培养箱中，待步骤 2.6 使用。</li>
	<li>将 FuGENE 6 试剂瓶于室温下放置 5 分钟使其升温，然后短暂涡旋振荡（&lt;1 秒）。</li>
	<li>将 600 μL 未添加成分的 DMEM 分装至 1.5 mL 微量离心管中。</li>
	<li>将 30 μL FuGENE 6 加入上述 600 μL 未添加成分的 DMEM 中，短暂涡旋振荡（&lt;1 秒），然后于室温孵育 5 分钟。注意移液时应直接将液体加入培养基中，避免 FuGENE 6 接触管壁。</li>
	<li>向 DMEM/FuGENE 6 混合液中加入 6 μg 质粒构建物以及 4 μg pKat2（用于逆转录病毒感染）或各 1.5 μg 的 pVSV-G、pMDLg/pRRE 和 pRSV-Rev（用于慢病毒感染），短暂涡旋振荡（&lt;1 秒），然后于室温孵育 25 分钟。</li>
	<li>将 DNA/DMEM/FuGENE 6 混合液加入 BOSC 23 细胞中，放回 37°C 培养箱继续培养 24 小时。</li>
	<li>24 小时后，向转染后的细胞中加入 5 mL 完全 DMEM，放回 37°C 培养箱继续培养 24 小时。</li>
</ol>
3. 收获病毒颗粒
<ol>
	<li>使用10 mL注射器收集转染后的BOSC 23细胞的10 mL培养基。</li>
	<li>将0.45 μm滤器连接至注射器末端，并将培养基过滤至洁净的15 mL聚丙烯管中。</li>
	<li>立即使用病毒上清，或将其分装为1 mL等份，置于2 mL冻存管中，于-80°C保存。</li>
	<li>收集病毒上清后，通过FACS检测阳性对照细胞以确认转染效率。如果构建体包含荧光标记（如GFP）或细胞表面标记（如Thy1），也可对所有样品进行检测。</li>
</ol>
4. 感染B细胞
<ol>
	<li>在感染前24小时，将2 mL浓度为2 × 105 个细胞/mL的Ramos细胞接种于完全RPMI培养基中，置于6孔板内。请务必使用低代次或近期复苏的细胞，以确保良好的感染效率。</li>
	<li>若使用冷冻保存的病毒，需在37°C快速解冻病毒培养液。</li>
	<li>将1 mL病毒培养液与3 μL浓度为10 mg/mL的polybrene混合。最终polybrene的终浓度应为10 μg/mL，总体积为3 mL。</li>
	<li>将病毒与polybrene的混合液加入细胞中，并用移液器轻轻吹打混匀。如前所述，应设置一个未感染的对照孔；该孔中加入1 mL完全RPMI培养基和3 μL polybrene，代替1 mL病毒液。请务必同时设置一个匹配的阴性对照孔。我们还使用含GFP的载体感染一个孔，以便通过流式细胞术（FACS）测定感染效率。</li>
	<li>将6孔板在室温下以3000 × g离心90分钟。</li>
	<li>将培养板放回37°C培养箱中继续培养48小时。</li>
	<li>48小时后，将感染后的细胞转移至15 mL聚丙烯离心管中，在室温下以400 × g离心4分钟。用移液器小心吸除上清液，注意不要扰动细胞沉淀。用新鲜RPMI培养基重悬细胞。</li>
	<li>通过流式细胞术（FACS）检测阳性对照样本的感染效率。如前所述，若构建体含有荧光标记（例如GFP）或细胞表面标记（例如Thy1），可对所有样本进行检测。</li>
	<li>开始进行细胞筛选（如适用）。我们所用的shRNA载体均含有嘌呤霉素抗性表达盒。我们使用0.25 μg/mL嘌呤霉素对shRNA感染的Ramos细胞进行筛选。我们发现Ramos细胞的不同衍生株对嘌呤霉素的敏感性可能存在差异，因此需进行杀灭曲线实验，以优化每种衍生株的嘌呤霉素筛选浓度。同时，应对未感染的对照细胞施加嘌呤霉素处理，以确认筛选的有效性。</li>
</ol>
5. 单细胞接种
单细胞接种可通过两种方式实现：流式细胞荧光分选（FACS）或手动操作。
<ol>
	<li>流式细胞分选（FACS）：使用配备孔板适配器的流式细胞分选仪，将单个细胞分选至已预先加入100 μL含40% RPMI、40%条件培养基和20% FBS的96孔板中，每孔1个细胞。该方法可在每块板上获得更多的单细胞克隆。</li>
	<li>手动法：计数细胞。将细胞等分试样稀释至10个细胞/mL，稀释液为含40% RPMI、40%条件培养基和20% FBS的混合液。每块接种用的96孔板使用10 mL稀释后的细胞悬液。由于不同克隆在此阶段的复苏情况存在差异，建议同时设置多个不同细胞浓度的接种板（浓度范围为3–20个细胞/mL）。选择克隆生长较少的接种板，以避免多细胞来源的克隆。使用多通道移液器，向96孔板中每孔加入100 μL稀释后的细胞悬液进行接种。</li>
	<li>将96孔板置于37°C培养箱中培养2周。</li>
	<li>接种后24小时，在显微镜下检查各孔，确认是否存在细胞。由于需在合适的焦深下观察，单个细胞较难发现。可通过聚焦于96孔板底部印制的孔号来辅助定位。使用流式细胞分选仪接种时，大多数孔中均含有细胞，因此更易于识别。</li>
	<li>培养2周后，通过肉眼从板底部观察可勉强看到正在生长的克隆，但在显微镜下更易观察。克隆通常沿孔边缘生长，且同一块板中多数克隆倾向于沿相同方向的孔边缘生长。标记出细胞生长良好的孔，并将细胞转移至含1 mL RPMI的24孔板中，继续置于37°C培养箱中培养。</li>
	<li>维持细胞密度在1 × 105 至 1 × 106 个细胞/mL。室温下以400 × g离心4分钟，根据需要更换培养基，弃去旧培养基后加入1 mL新鲜RPMI培养基。</li>
	<li>经过数天生长后，将细胞转移至6孔板中，并继续在37°C培养箱中培养。</li>
	<li>3周后，检测克隆中IgM的丢失情况（如下所述）。</li>
	<li>继续培养细胞2周，于第5周时间点再次分析克隆。</li>
</ol>
6. 分析：IgM 丢失（3 周和 5 周）
<ol>
	<li>从每个孔中取5 × 105个细胞，加入1.5 mL微量离心管中，在室温下以400 × g离心4分钟。分别取自对照组和shRNA敲低组的各孔细胞，并另设一个未染色对照样本。</li>
	<li>用1 mL PBS洗涤细胞，然后在室温下以400 × g再次离心4分钟。</li>
	<li>将细胞重悬于50 μL PBS（未染色对照）或含1:20稀释的PE标记抗人IgM抗体的PBS中，冰上孵育1小时。</li>
	<li>在室温下以400 × g离心4分钟，沉淀细胞。</li>
	<li>用1 mL PBS洗涤细胞两次，每次均在室温下以400 × g离心4分钟。</li>
	<li>弃去上清液，将细胞重悬于100 μL PBS中，将染色后的细胞转移至FACS管中。</li>
	<li>使用FACS仪器分析细胞。</li>
	<li>比较对照组与shRNA敲低组中IgM-细胞的百分比。如前所述，通过FACS检测到的IgM表达减少是评估Ramos细胞体细胞高频突变（SHM）的一种可靠半定量指标。</li>
</ol>
7. 分析：通过定量 RT-PCR 确认基因敲低（5 周）
<ol>
	<li>从每个孔中取 3 × 106 个细胞的等分试样，在室温下以 400 × g 离心 4 分钟。</li>
	<li>从细胞等分试样中提取 RNA。我们按照制造商的建议使用 TRIzol 法进行提取。</li>
	<li>以提取的 RNA 为模板合成 cDNA。我们使用 2 μg RNA，并按照制造商的建议使用 Superscript II 进行反应。</li>
	<li>以 cDNA 为模板进行定量 PCR 以确认基因敲低效果。我们使用 GAPDH 作为归一化对照，并采用 SYBR FAST qPCR 试剂盒，在总体积为 10 μL 的反应体系中进行扩增。</li>
</ol>
8. 分析：基因组测序（5 周）
<ol>
	<li>从每个孔中分装 5 × 106 个细胞，并在室温下以 400 × g 离心 4 分钟。</li>
	<li>从这些细胞中提取基因组 DNA。我们采用 Wizard SV 基因组 DNA 纯化试剂盒，按照制造商的说明进行操作。</li>
	<li>使用 KAPA HiFi DNA 聚合酶对基因组 DNA 进行 Ig V 基因19（见表 1）及其他感兴趣基因的 PCR 扩增。选择该聚合酶是因为其具有较低的错误率，但任何高保真 PCR 聚合酶均可适用。</li>
	<li>使用 QIAquick 凝胶回收试剂盒，在 1% 琼脂糖凝胶上对 PCR 产物进行凝胶纯化。</li>
	<li>某些聚合酶会在 PCR 产物的 3′ 末端添加单个脱氧腺苷（A）残基，而另一些则不会。这些 3′ A 尾对于 TOPO TA 克隆步骤是必需的。KAPA HiFi 聚合酶不会产生 3′ A 尾。通过将 25 μL 凝胶纯化的 PCR 产物与 3 μL 10× Taq 反应缓冲液、1 μL 10 mM dNTPs 和 1 单位 Taq 聚合酶混合，在 72°C 下孵育 30 分钟，为 PCR 产物加 A 尾。</li>
	<li>使用 TOPO TA 克隆试剂盒对凝胶纯化的 PCR 产物进行克隆。将 TOPO 反应产物转化至试剂盒提供的 E. coli DH5α-T1R 感受态细胞中，并按照制造商的说明涂布于含有 100 μg/mL 氨苄青霉素并补充 1.6 mg X-gal 的 LB/琼脂平板上。</li>
	<li>送单个菌落进行测序。</li>
	<li>进行序列分析，以确定突变的类型和位置。</li>
</ol>
9. 代表性结果：
如前所述，我们使用一种表达GFP和嘌呤霉素抗性基因的阳性对照病毒载体。转染后两天，通常可观察到50-75%的细胞呈GFP+。在感染实验中，感染后两天（筛选前）通常有50-70%的细胞呈GFP+。筛选完成后，&gt;95%的细胞呈GFP+。
作为代表性实验，我们展示了在Ramos细胞中过表达AID或敲低一种修复因子的效果。具体而言，我们将一个逆转录病毒过表达载体（该载体通过IRES位点连接AID与Thy1.1）与逆转录病毒包装载体pKat2共同转染至BOSC 23细胞中。收集含病毒的培养基，过滤后用于感染Ramos细胞。将野生型（WT）和AID过表达（AIDhi）细胞进行单细胞接种，并培养3周，随后通过qRT-PCR分析基因表达（图2），并通过FACS分析IgM丢失情况（图3）。在FACS染色过程中，细胞分别与1:20稀释的PE标记抗人IgM抗体以及1:400稀释的FITC标记抗大鼠CD90/小鼠CD90.1（Thy1.1）抗体共同孵育。在另一项实验中，在BOSC 23细胞中生成了包含无关shRNA（对照）或靶向一种高保真DNA修复因子的shRNA的慢病毒（该修复因子被认为可抵御体细胞高频突变SHM），随后感染至Ramos细胞的一个AIDhi克隆中。同样，在培养3周后，对单细胞克隆进行基因表达（图4）和IgM丢失（图5）分析。由于该修复因子被认为可在SHM过程中提供对抗突变的保护作用，因此在缺失该因子的情况下，我们观察到IgM丢失和SHM水平升高。如果我们敲低的是参与产生SHM相关突变的因子，则会观察到IgM丢失减少。
正如预期，我们的qRT-PCR结果显示，当细胞感染AID过表达载体后，AID的表达水平显著升高（图2），而当存在针对DNA修复因子的特异性shRNA时，该因子的表达水平则下降（图4）。由于单个克隆之间可能存在差异，您可能会观察到基因表达水平的一些变异。鉴于基因表达本身具有变异性，因此有必要对计划进一步分析的每一个克隆都确认其表达情况。针对同一基因的不同shRNA对基因表达的抑制效果也可能不同，因此应筛选多个shRNA以确定其中影响最大的一个。基因敲低效果也可通过免疫印迹法在蛋白水平上加以验证。同样，不同单细胞克隆在IgM丢失水平上也可能存在显著差异。某些克隆可能表现出“中奖”效应（jackpot effect），即IgM突变发生在细胞分裂的极早期——例如，由于在二细胞阶段就有一个细胞变为IgM-，您将观察到&gt;50%的IgM丢失。通过计算多个单细胞克隆的中位数，可最大限度地降低这类克隆的影响。
<img alt="转染流程图；DNA转染、病毒颗粒收获、感染、qRT-PCR分析。" src="/files/ftp_upload/3573/3573fig1.jpg" data-altupdatedat="1761809329000" data-alt="图1"> 
图1. IgM丢失的转染、感染及分析示意图。详见正文。
<img alt="AID表达量比较图表；野生型与突变型；基因表达分析；科学数据" src="/files/ftp_upload/3573/3573fig2.jpg" data-altupdatedat="1761809329000" data-alt="图2"> 
图2. Ramos细胞中AID的过表达。将野生型（WT）和AIDhi Ramos细胞进行单细胞克隆，并培养3周，随后通过qRT-PCR检测各单克隆中AID的表达水平。以GAPDH表达量作为归一化对照。将野生型设为1。图中显示中位值。*表示p值&lt;0.01，采用单尾Student′s t检验计算得出。
<img alt="流式细胞术点图和散点图，IgM 对 AID-Thy1.1 表达，WT 与 AID^hi 分析。" src="/files/ftp_upload/3573/3573fig3.jpg" data-altupdatedat="1761809329000" data-alt="图 3"> 
图 3. AIDhi 细胞相较于 WT 细胞表现出更显著的 IgM 丢失。在第 3 周时间点通过 FACS 检测表面 IgM，并计算 WT 和 AIDhi 细胞中 IgM 丢失的百分比。（A）一个 WT 克隆和一个 AIDhi 克隆的代表性 FACS 图。AID 过表达载体通过 IRES 位点将 AID 与 Thy1.1 连接，因此 Thy1.1 的表达被用作 AID 表达的替代指标。（B）多个 WT 和 AIDhi 克隆中 IgM 丢失的定量分析。图中显示中位值。* 表示 p 值 &lt;0.01，采用单尾 Student's t 检验计算得出。
<img alt="基因表达比较，对照组 vs. shRNA，标准化数值，科学数据分析，图表。" src="/files/ftp_upload/3573/3573fig4.jpg" data-altupdatedat="1761809329000" data-alt="图 4"> 
图 4. 在 AIDhi 细胞中敲低一种修复因子。细胞分别感染无关的 shRNA 对照（对照）或我们感兴趣的 shRNA（shRNA），并进行单细胞接种。三周后，通过 qRT-PCR 检测各个克隆中基因的表达水平。以 GAPDH 表达量作为标准化对照。野生型（WT）设为 1。图中显示中位值。* 表示 p 值 &lt;0.01，采用单尾 Student t 检验计算得出。
<img alt="对照组与shRNA组中IgM%损失的分析；基因表达研究结果的点状图。" src="/files/ftp_upload/3573/3573fig5.jpg" data-altupdatedat="1761809329000" data-alt="图5"> 
图5. 在AIDhi细胞中，当修复因子水平被敲低时，IgM的丢失增加。通过FACS在3周时间点测量多个克隆的表面IgM，并计算仍过表达AID的细胞中IgM丢失的百分比。图中显示中位值。*表示p值&lt;0.01，采用单尾Student′s t检验计算得出。
<img src="/files/ftp_upload/3573/3573table1.jpg" alt="Ig基因引物序列（Cμ、V_H、V_L）表格，用于基因扩增研究。" data-altupdatedat="1761809329000" data-alt="表1"> 
表1. Ig基因19的引物序列：恒定区Cμ、重链可变区（VH）和轻链可变区（VL）。

<ol><li>Di Noia, J. M., Neuberger, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanisms+of+antibody+somatic+hypermutation%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanisms of antibody somatic hypermutation.</a> Annu. Rev. Biochem. 76, 1-22 (2007).</li>
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<li>Basu, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+RNA+exosome+targets+the+AID+cytidine+deaminase+to+both+strands+of+transcribed+duplex+DNA+substrates%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The RNA exosome targets the AID cytidine deaminase to both strands of transcribed duplex DNA substrates.</a> Cell. 144, 353-363 (2011).</li>
<li>Yabuki, M., Fujii, M. M., Maizels, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+MRE11-RAD50-NBS1+complex+accelerates+somatic+hypermutation+and+gene+conversion+of+immunoglobulin+variable+regions%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Immunol%22%5BJournal%5D)">The MRE11-RAD50-NBS1 complex accelerates somatic hypermutation and gene conversion of immunoglobulin variable regions.</a> Nat. Immunol. 6, 730-736 (2005).</li>
<li>Sale, J. E., Neuberger, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TdT-accessible+breaks+are+scattered+over+the+immunoglobulin+V+domain+in+a+constitutively+hypermutating+B+cell+line%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">TdT-accessible breaks are scattered over the immunoglobulin V domain in a constitutively hypermutating B cell line.</a> Immunity. 9, 859-869 (1998).</li>
<li>Cumbers, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+and+iterative+affinity+maturation+of+antibodies+in+vitro+using+hypermutating+B-cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Generation and iterative affinity maturation of antibodies in vitro using hypermutating B-cell lines.</a> Nat. Biotechnol. 20, 1129-1134 (2002).</li>
<li>Papavasiliou, F. N., Schatz, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-cycle-regulated+DNA+double-stranded+breaks+in+somatic+hypermutation+of+immunoglobulin+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cell-cycle-regulated DNA double-stranded breaks in somatic hypermutation of immunoglobulin genes.</a> Nature. 408, 216-221 (2000).</li>
<li>Parsa, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AID+mutates+a+non-immunoglobulin+transgene+independent+of+chromosomal+position%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Immunol%22%5BJournal%5D)">AID mutates a non-immunoglobulin transgene independent of chromosomal position.</a> Mol. Immunol. 44, 567-575 (2007).</li>
<li>Zhang, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clonal+instability+of+V+region+hypermutation+in+the+Ramos+Burkitt%27s+lymphoma+cell+line%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Clonal instability of V region hypermutation in the Ramos Burkitt's lymphoma cell line.</a> Int. Immunol. 13, 1175-1184 (2001).</li>
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<li>Dull, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+third-generation+lentivirus+vector+with+a+conditional+packaging+system%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">A third-generation lentivirus vector with a conditional packaging system.</a> J. Virol. 72, 8463-8471 (1998).</li>
<li>Nakamura, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+frequency+class+switching+of+an+IgM%2B+B+lymphoma+clone+CH12F3+to+IgA%2B+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+Immunol%22%5BJournal%5D)">High frequency class switching of an IgM+ B lymphoma clone CH12F3 to IgA+ cells.</a> Int. Immunol. 8, 193-201 (1996).</li>
<li>Muramatsu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+expression+of+activation-induced+cytidine+deaminase+%28AID%29%2C+a+novel+member+of+the+RNA-editing+deaminase+family+in+germinal+center+B+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Specific expression of activation-induced cytidine deaminase (AID), a novel member of the RNA-editing deaminase family in germinal center B cells.</a> J. Biol. Chem. 274, 18470-18476 (1999).</li>
</ol>

无利益冲突声明。

如前所述，用于抗体多样性的细胞系模型已成为识别影响抗体多样化各个步骤的新蛋白的常用起点。本文介绍了一种方法，即通过病毒感染在 Ramos B 细胞系中敲低或过表达特定蛋白，进而检测其对体细胞高频突变（SHM）的影响。
在这些研究中，我们同时使用野生型Ramos细胞和AIDhi Ramos细胞。野生型细胞可用于研究参与AID靶向或表达的因子以及修复AID诱导的DNA损伤的相关机制，而AIDhi细胞则排除了影响AID表达的因素。
还应注意，此处通过检测初始为IgM+的细胞群体中IgM的丢失来测量SHM。或者，也可以从IgM-细胞开始，在回复突变检测中寻找获得IgM+的细胞23。
通过使用不同的筛选标记（例如嘌呤霉素、潮霉素、GFP或Thy1.1），我们还可以采用相同的实验方案同时进行多重感染。然而，我们发现当使用两种不同的抗生素筛选标记时，细胞的...

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;em&gt;推荐试剂——其中大多数可替换为其他供应商的类似产品。&lt;/em&gt;</td></tr><tr><td>6孔透明TC处理培养板</td><td>Corning</td><td>3516</td><td></td></tr><tr><td>10 mL BD Luer-Lok注射器</td><td>BD Biosciences</td><td>309604</td><td></td></tr><tr><td>24孔透明TC处理培养板</td><td>Corning</td><td>3526</td><td></td></tr><tr><td>96孔透明平底聚苯乙烯TC处理微孔板</td><td>Corning</td><td>3596</td><td></td></tr><tr><td>100 mm TC处理培养皿</td><td>Corning</td><td>430167</td><td></td></tr><tr><td>Acrodisc注射器滤器，0.45 &amp;mu;m</td><td>Pall Corporation</td><td>4604</td><td></td></tr><tr><td>琼脂</td><td>TEKnova, Inc.</td><td>A7777</td><td></td></tr><tr><td>琼脂糖</td><td>GeneMate</td><td>E-3120-500</td><td></td></tr><tr><td>氨苄青霉素</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A0166</td><td>100 mg/mL 水溶液</td></tr><tr><td>BD FACSCanto II 流式细胞仪</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>或类似仪器</td></tr><tr><td>BD Falcon 圆底聚苯乙烯管</td><td>BD Biosciences</td><td>352054</td><td>用于FACS</td></tr><tr><td>BOSC 23 细胞</td><td>ATCC</td><td>CRL-11270</td><td></td></tr><tr><td>CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 培养箱，可维持37&amp;#x00B0;C</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM（Dulbecco&amp;#8242;s 改良 Eagle&amp;#8242;s 培养基）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D6429</td><td></td></tr><tr><td>FBS（胎牛血清）</td><td>Gemini Bio Products</td><td>100-106</td><td></td></tr><tr><td>FITC &amp;alpha;-大鼠 CD90/小鼠 CD90.1 抗体</td><td>BioLegend</td><td>202503</td><td>FITC &amp;alpha;-Thy1.1</td></tr><tr><td>FuGENE 6 转染试剂</td><td>Roche Group</td><td>11814443001</td><td></td></tr><tr><td>HEPES 缓冲液</td><td>Invitrogen</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>KAPA HiFi DNA 聚合酶</td><td>KAPA Biosystems</td><td>KK2101</td><td></td></tr><tr><td>LB 肉汤（溶菌肉汤 - Luria）粉末</td><td>Difco Laboratories</td><td>240230</td><td></td></tr><tr><td>MISSION TRC shRNA 细菌甘油菌种</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td>shRNA 载体</td></tr><tr><td>NCS（新生牛血清）</td><td>Gemini Bio Products</td><td>100-504</td><td></td></tr><tr><td>PBS（磷酸盐缓冲液）</td><td>Invitrogen</td><td>70011</td><td>用水稀释至1x</td></tr><tr><td>PE &amp;alpha;-人 IgM 抗体</td><td>BioLegend</td><td>314508</td><td></td></tr><tr><td>PGS（青霉素-链霉素-谷氨酰胺溶液）</td><td>Gemini Bio Products</td><td>400-110</td><td></td></tr><tr><td>聚凝胺（六亚甲基溴化铵）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>107689</td><td>10 mg/mL 水溶液</td></tr><tr><td>PureYield 质粒中量提取系统</td><td>Promega Corp.</td><td>A2495</td><td></td></tr><tr><td>嘌呤霉素</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8833</td><td>250 &amp;#x03BC;g/mL 水溶液</td></tr><tr><td>QIAquick 凝胶回收试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>28706</td><td></td></tr><tr><td>Ramos (RA 1) 细胞</td><td>ATCC</td><td>CRL-1596</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640 培养基</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R8758</td><td></td></tr><tr><td>SuperScript II</td><td>Invitrogen</td><td>18064-022</td><td></td></tr><tr><td>SYBR FAST qPCR 试剂盒</td><td>KAPA Biosystems</td><td>KK4601</td><td></td></tr><tr><td>Taq DNA 聚合酶</td><td>Invitrogen</td><td>18038-042</td><td></td></tr><tr><td>TOPO TA 克隆试剂盒</td><td>Invitrogen</td><td>K4520-01</td><td></td></tr><tr><td>TRIzol</td><td>Invitrogen</td><td>15596-026</td><td></td></tr><tr><td>Wizard SV 基因组DNA纯化系统</td><td>Promega Corp.</td><td>A2361</td><td></td></tr><tr><td>X-Gal [5-溴-4-氯-3-吲哚基-&amp;#946;-D-半乳糖吡喃糖苷]</td><td>Growcells</td><td>C-5687</td><td>40 mg/mL DMSO 溶液</td></tr></tbody></table>

在过表达或敲低特定基因后评估ramos b细胞中的体细胞高频突变

Assessing Somatic Hypermutation in Ramos B Cells after Overexpression or Knockdown of Specific Genes

B细胞通过V(D)J重排产生低亲和力抗体而开始其生命周期。然而，当检测到病原体时，免疫球蛋白（Ig）基因的可变区（V区）发生体细胞高频突变（SHM），其突变率比基因组其他区域高出约100,000倍，从而产生高亲和力抗体1,2。此外，类别转换重组（CSR）可根据针对特定病原体所需的免疫反应类型，产生具有不同效应功能的抗体。CSR和SHM均由活化诱导的胞苷脱氨酶（AID）启动，AID将DNA中的胞嘧啶残基脱氨生成尿嘧啶。这些尿嘧啶通过易错的DNA修复通路进行加工，最终导致突变和重组事件的发生1-3。
目前，关于体细胞超突变（SHM）和类别转换重组（CSR）分子机制的研究成果主要来源于小鼠、原代细胞、细胞系以及无细胞实验的综合研究。小鼠模型仍然是金标准，基因敲除实验已证明多种修复因子在其中发挥关键作用（例如 Ung、Msh2、Msh6、Exo1 和 DNA 聚合酶 η）4-10。然而，并非所有基因都适用于敲除研究。例如，若干双链断裂修复蛋白的敲除会导致胚胎致死或损害B细胞的发育11-14。此外，有时目标蛋白在SHM或CSR中的特定功能可能被基因敲除引起的更广泛的缺陷所掩盖。同时，由于小鼠实验周期较长，通过细胞系调控单个基因的表达已成为识别和表征候选基因日益常用的初步手段15-18。
Ramos——一种持续发生体细胞超突变（SHM）的伯基特淋巴瘤细胞系——是研究SHM的常用细胞模型18-24。Ramos细胞的一个优势在于其自身具备一种方便的半定量检测SHM的方法。野生型细胞表达IgM，随着突变的积累，部分突变会导致IgM表达丧失。因此，通过荧光激活细胞分选（FACS）检测IgM的丢失情况，可快速反映SHM水平。通过直接测序抗体基因，可以获得更为定量的SHM测量结果。
由于Ramos细胞难以转染，我们通过使用含有过表达元件或短发夹RNA（shRNA）的逆转录病毒或慢病毒载体感染细胞，从而构建出特定基因表达升高或降低的稳定细胞系。本文中，我们描述了如何感染Ramos细胞，并利用这些细胞研究特定基因在体细胞高频突变（SHM）中的作用（图1）。

我们介绍了如何在人Ramos B细胞系中进行含有过表达或shRNA构建体的逆转录病毒或慢病毒感染，以及如何检测这些细胞中的体细胞高频突变。

在过表达或敲低特定基因后评估Ramos B细胞中的体细胞高频突变

B细胞通过V(D)J重排产生低亲和力抗体而开始其生命周期。然而，当检测到病原体后，抗体的可变区（V区）会发生……

以下实验的总体目标是改变一个基因的表达，然后测量其对体细胞高频突变的影响。该目标通过转染 Bosque 23 细胞产生含有过表达载体或含 SHRA 构建体的病毒颗粒来实现。第二步，用这些病毒转导 ramo 细胞，从而实现目标基因的表达下调或过表达。随后，单细胞克隆需培养数周，以使细胞积累突变。最后，可通过分析IgM的丢失情况以及IG基因的测序来确定基因表达改变所产生的效应。该方法有助于鉴定参与抗体多样性的新因子。首先，取 600 µL 温热的完全 DMEM 培养基加入到一个 1.5 mL 微量离心管中。然后小心地将 30 µL FUgene6 直接加入培养基中，涡旋混合不到一秒钟，随后在室温下孵育 5 分钟。接下来，对于此类慢病毒转导实验，向 DMEM 与 FUgene6 的混合液中加入 6 µg 的 shRNA 载体以及 P-V-S-V-G、P-M-D-L-G-P-R-R-E 和 PRSV rev 载体各 1.5 µg。短暂涡旋混匀溶液，然后再次于室温孵育25分钟。最后，用DNA-DMEM FU基因六转染汇合度为50%至60%的Bosque 23细胞培养物。混匀后，将细胞在37°C和5%二氧化碳条件下孵育24小时。第二天，向细胞中加入5 mL DMEM，然后将其放回培养箱中继续培养24小时。转染后的第三天，使用10 mL注射器从转染的box 23细胞中收集10 mL培养基，然后在注射器末端连接一个0.45 µm滤器。将过滤后的培养基收集到干净的15 mL聚丙烯管中。感染前24小时，将每毫升2 × 10⁵个Ramo细胞接种至6孔板中，每孔加入2 mL完全RPMI培养基。次日，向Ramo细胞中加入3 µL浓度为10 µg/mL的Polybrene溶液和1 mL病毒液，用移液器轻轻吹打混匀细胞悬液。对于未感染的对照组，在其中一个孔中加入一毫升完全RPMI培养基和三微升多聚脑（poly brain），以代替病毒。同时，用匹配的阴性对照感染一个孔，另用含有GFP的载体感染一个孔，以便通过流式细胞术（fax）测定感染效率。随后将六孔板在室温下以3000 ×g离心90分钟，然后将培养板放回培养箱中继续培养48小时。最后，在室温下，将感染的细胞在15毫升聚丙烯管中以400 ×g离心4分钟，然后吸去上清液，注意不要扰动细胞沉淀，用新鲜RPMI培养基重悬细胞。计数细胞后，将感染的Ramo细胞稀释至每毫升10个细胞。在RPMI条件培养基和FBS中配制溶液，每块接种板终体积为10毫升。然后使用多通道移液器将稀释后的细胞接种至96孔板，每孔100微升。将培养板在37摄氏度、5%二氧化碳条件下孵育24小时后，使用显微镜检查每个单独的孔。为确认细胞的存在，需注意单个细胞的识别深度较难确定。首先，尝试聚焦于96孔板底部印制的孔号。两周后尝试寻找细胞。使用永久性墨水检查孔边缘的细胞克隆。标记出细胞生长旺盛的孔，然后将克隆转移至含有1毫升RPMI的24孔板中，进行进一步培养。培养数天后，将细胞转移至六孔板中，并继续孵育培养物。在六孔板中接种细胞集落三周后，从每个孔中收集 5 × 10⁵ 个细胞至 1.5 毫升微量离心管中。此时，同时收集各对照组和 HRNA 沉默孔中的细胞，以及一个未染色对照样本。现在将所有细胞在室温下以400 × g离心4分钟，第二次离心时用1毫升PBS洗涤细胞一次。第二次洗涤后，将未染色的对照组细胞沉淀重悬于50微升PBS中，其余样品沉淀则重悬于PBS中含1:20稀释的PE标记抗人IgM抗体的溶液中。然后将所有细胞样品置于冰上避光孵育1小时，孵育前按前述方法再用PBS洗涤细胞两次，弃去上清液，再将所有沉淀重悬于100微升PBS中。接下来，将重悬的染色细胞和未染色对照细胞转移至流式管中，然后通过流式细胞术分析细胞。比较对照组与S-H-R-N-A敲低组中IgM阴性细胞的百分比。将携带ID基因的逆转录病毒过表达载体转染至Bosque 23细胞中。随后收获病毒，并用于感染Ramos细胞，包括野生型（wt）细胞和a ID过表达的a ID.High细胞。将细胞进行单细胞铺板并培养三周，之后通过qRT-PCR分析基因表达。正如预期，qRT-PCR结果表明，用a ID过表达载体感染细胞后，a ID的表达显著升高。同时，也通过流式细胞术（FACS）评估了感染细胞表面IgM的丢失情况。根据前图所示方法，在三周时间点通过FACS检测表面IgM水平，并分别计算野生型细胞和a ID高表达细胞的IgM丢失百分比，结果以图形方式展示。如预期，a ID过表达细胞表现出更显著的表面IgM丢失。在另一项实验中，于bosque 23细胞中制备了含有无关S-H-R-N-A（作为对照）或靶向一种高保真DNA修复因子的S-H-R-N-A的慢病毒，该修复因子被认为可保护细胞免受体细胞高频突变（SHM）的影响。随后将这些慢病毒感染至Ramos细胞的一个a ID高表达克隆中。再次分析基因表达水平，结果与预期一致，当存在靶向该因子的S-H-R-N-A时，该DNA修复因子的表达水平下降。同时，在三周后也分析了单细胞克隆中IgM的丢失情况。由于该修复因子被认为可在SHM过程中提供对抗突变的保护作用，因此在该因子缺失的情况下，IgM丢失和SHM均增加，这一点可从本图中观察到。观看本视频后，您应该能够充分理解如何在 RAW B 细胞系中对含有过表达或 S-H-R-N-A 构建体的病毒进行感染，并进一步掌握如何检测这些细胞中的体细胞高频突变。

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科研

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Immunology and Infection

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