在过表达或敲低特定基因后评估Ramos B细胞中的体细胞高频突变

以下实验的总体目标是改变一个基因的表达，然后测量其对体细胞高频突变的影响。该目标通过转染 Bosque 23 细胞产生含有过表达载体或含 SHRA 构建体的病毒颗粒来实现。第二步，用这些病毒转导 ramo 细胞，从而实现目标基因的表达下调或过表达。

随后，单细胞克隆需培养数周，以使细胞积累突变。最后，可通过分析IgM的丢失情况以及IG基因的测序来确定基因表达改变所产生的效应。该方法有助于鉴定参与抗体多样性的新因子。

首先，取 600 µL 温热的完全 DMEM 培养基加入到一个 1.5 mL 微量离心管中。然后小心地将 30 µL FUgene6 直接加入培养基中，涡旋混合不到一秒钟，随后在室温下孵育 5 分钟。接下来，对于此类慢病毒转导实验，向 DMEM 与 FUgene6 的混合液中加入 6 µg 的 shRNA 载体以及 P-V-S-V-G、P-M-D-L-G-P-R-R-E 和 PRSV rev 载体各 1.5 µg。

短暂涡旋混匀溶液，然后再次于室温孵育25分钟。最后，用DNA-DMEM FU基因六转染汇合度为50%至60%的Bosque 23细胞培养物。混匀后，将细胞在37°C和5%二氧化碳条件下孵育24小时。

第二天，向细胞中加入5 mL DMEM，然后将其放回培养箱中继续培养24小时。转染后的第三天，使用10 mL注射器从转染的box 23细胞中收集10 mL培养基，然后在注射器末端连接一个0.45 µm滤器。将过滤后的培养基收集到干净的15 mL聚丙烯管中。感染前24小时，将每毫升2 × 10⁵个Ramo细胞接种至6孔板中，每孔加入2 mL完全RPMI培养基。次日，向Ramo细胞中加入3 µL浓度为10 µg/mL的Polybrene溶液和1 mL病毒液，用移液器轻轻吹打混匀细胞悬液。

对于未感染的对照组，在其中一个孔中加入一毫升完全RPMI培养基和三微升多聚脑（poly brain），以代替病毒。同时，用匹配的阴性对照感染一个孔，另用含有GFP的载体感染一个孔，以便通过流式细胞术（fax）测定感染效率。随后将六孔板在室温下以3000 ×g离心90分钟，然后将培养板放回培养箱中继续培养48小时。

最后，在室温下，将感染的细胞在15毫升聚丙烯管中以400 ×g离心4分钟，然后吸去上清液，注意不要扰动细胞沉淀，用新鲜RPMI培养基重悬细胞。计数细胞后，将感染的Ramo细胞稀释至每毫升10个细胞。

在RPMI条件培养基和FBS中配制溶液，每块接种板终体积为10毫升。然后使用多通道移液器将稀释后的细胞接种至96孔板，每孔100微升。

将培养板在37摄氏度、5%二氧化碳条件下孵育24小时后，使用显微镜检查每个单独的孔。为确认细胞的存在，需注意单个细胞的识别深度较难确定。首先，尝试聚焦于96孔板底部印制的孔号。

两周后尝试寻找细胞。使用永久性墨水检查孔边缘的细胞克隆。标记出细胞生长旺盛的孔，然后将克隆转移至含有1毫升RPMI的24孔板中，进行进一步培养。

培养数天后，将细胞转移至六孔板中，并继续孵育培养物。在六孔板中接种细胞集落三周后，从每个孔中收集 5 × 10⁵ 个细胞至 1.5 毫升微量离心管中。此时，同时收集各对照组和 HRNA 沉默孔中的细胞，以及一个未染色对照样本。

现在将所有细胞在室温下以400 × g离心4分钟，第二次离心时用1毫升PBS洗涤细胞一次。第二次洗涤后，将未染色的对照组细胞沉淀重悬于50微升PBS中，其余样品沉淀则重悬于PBS中含1:20稀释的PE标记抗人IgM抗体的溶液中。然后将所有细胞样品置于冰上避光孵育1小时，孵育前按前述方法再用PBS洗涤细胞两次，弃去上清液，再将所有沉淀重悬于100微升PBS中。

接下来，将重悬的染色细胞和未染色对照细胞转移至流式管中，然后通过流式细胞术分析细胞。比较对照组与S-H-R-N-A敲低组中IgM阴性细胞的百分比。将携带ID基因的逆转录病毒过表达载体转染至Bosque 23细胞中。

随后收获病毒，并用于感染Ramos细胞，包括野生型（wt）细胞和a ID过表达的a ID.High细胞。将细胞进行单细胞铺板并培养三周，之后通过qRT-PCR分析基因表达。正如预期，qRT-PCR结果表明，用a ID过表达载体感染细胞后，a ID的表达显著升高。同时，也通过流式细胞术（FACS）评估了感染细胞表面IgM的丢失情况。根据前图所示方法，在三周时间点通过FACS检测表面IgM水平，并分别计算野生型细胞和a ID高表达细胞的IgM丢失百分比，结果以图形方式展示。如预期，a ID过表达细胞表现出更显著的表面IgM丢失。

在另一项实验中，于bosque 23细胞中制备了含有无关S-H-R-N-A（作为对照）或靶向一种高保真DNA修复因子的S-H-R-N-A的慢病毒，该修复因子被认为可保护细胞免受体细胞高频突变（SHM）的影响。随后将这些慢病毒感染至Ramos细胞的一个a ID高表达克隆中。再次分析基因表达水平，结果与预期一致，当存在靶向该因子的S-H-R-N-A时，该DNA修复因子的表达水平下降。同时，在三周后也分析了单细胞克隆中IgM的丢失情况。由于该修复因子被认为可在SHM过程中提供对抗突变的保护作用，因此在该因子缺失的情况下，IgM丢失和SHM均增加，这一点可从本图中观察到。

观看本视频后，您应该能够充分理解如何在 RAW B 细胞系中对含有过表达或 S-H-R-N-A 构建体的病毒进行感染，并进一步掌握如何检测这些细胞中的体细胞高频突变。