Name: 增强细胞凋亡和自噬的诱导合成一种新型的C-1 7-deoxypancratistatin的类似物在人类乳癌细胞和神经母细胞瘤与他莫昔芬 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-05-30T12:00:00.000+00:00
Duration: 19 min 44 s
Description: 了解JCTH-4与他莫昔芬联合诱导人类乳腺癌和神经母细胞瘤细胞凋亡与自噬的机制。该方法通过监测线粒体膜电位和活性氧产生，评估选择性细胞毒性，为开发安全有效的抗癌联合疗法提供重要依据。

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本工作得到了安大略省温莎市哥伦布骑士会第9671分会以及授予丹尼斯·马（Dennis Ma）的加拿大卫生研究院弗雷德里克·班廷和查尔斯·贝斯特加拿大研究生奖学金的支持。感谢罗伯特·霍奇（Robert Hodge）和伊丽莎白·菲达尔戈·达席尔瓦（Elizabeth Fidalgo da Silva）在延时显微镜实验中的协助。感谢凯蒂·法塞基亚（Katie Facecchia）对延时显微镜视频的编辑。我们还要感谢苏迪帕·朱妮·查特吉（Sudipa June Chatterjee）和菲利普·特雷布莱（Phillip Tremblay）对本文稿的审阅。本研究谨以此纪念于2010年因癌症逝世的凯文·库维隆（Kevin Couvillon）。

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</ol>

无利益冲突声明。

已有研究表明，PST 及类似化合物具有抗癌特性11-15,21。我们此前曾报道，天然 PST 可选择性地破坏癌细胞中的线粒体稳定性，从而通过释放促凋亡因子诱导细胞凋亡12,14。JCTH-4 很可能也通过相同机制发挥作用；JCTH-4 导致 MCF7 细胞线粒体膜电位（MMP）崩溃（如 TMRM 染色所示，图 5a），并增加 SH-SY5Y 细胞分离线粒体中活性氧（ROS）的生成（图 5b），提示线粒体功能障碍。因此，JCTH-4 诱导细胞凋亡的机制极有可能是通过靶向癌细胞中的线粒体实现的。
非癌细胞与癌细胞之间存在多种差异，这些差异可能构成JCTH-4对癌症选择性作用的基础。癌细胞在能量生成过程中高度依赖糖酵解，而对线粒体的依赖性较低；这一现象被称为瓦博格效应22。癌细胞中的这种代谢活动导致胞质内酸性水平升高。因此，酸性的胞质环境会引起癌细胞线粒体的超极化，而线粒体超极化已被证实与增强的侵袭能力及逃避免疫性细胞凋亡相关23。然...

<table><tbody><tr><td>SH-SY5Y 细胞系</td><td>ATCC</td><td>CRL-2266</td><td></td></tr><tr><td>杜尔贝科&amp;rsquo;s 改良 Eagle 培养基 F-12 HAM</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>51448C</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清 </td><td>GIBCO，隶属于 Life Technologies</td><td>16000-044</td><td></td></tr><tr><td>MCF7细胞系</td><td>ATCC</td><td>HTB-22</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640 培养基</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R 0883</td><td></td></tr><tr><td>表观正常的正常人胎儿成纤维细胞系（NFF）</td><td>柯里尔医学研究机构</td><td>AG04431B</td><td></td></tr><tr><td>杜尔贝科&amp;rsquo;s 改良伊格尔&amp;rsquo;s Medium，高糖培养基</td><td>赛默飞世尔科技公司</td><td>SH30022.01</td><td></td></tr><tr><td>枸橼酸他莫昔芬盐 </td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9262</td><td></td></tr><tr><td>35 mm 玻璃底培养皿 </td><td>MatTek 公司</td><td>P35G-014-C</td><td></td></tr><tr><td>Leica DMI6000 B 倒置显微镜</td><td>徕卡显微系统</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>H&amp;#8211;chst 33342 染料</td><td>分子探针，Life Technologies</td><td>H3570</td><td></td></tr><tr><td>Leica DM IRB 倒置荧光显微镜 </td><td>Leica Microsystems</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Annexin V AlexaFluor-488</td><td>Invitrogen</td><td>A13201</td><td></td></tr><tr><td>台盼蓝溶液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8154-20ML</td><td></td></tr><tr><td>血细胞计数板</td><td>Fisher Scientific</td><td>267110</td><td></td></tr><tr><td>WST-1试剂</td><td>罗氏集团</td><td>11644807001</td><td></td></tr><tr><td>Wallac Victor&lt;sup&gt;3&lt;/sup&gt; 1420 多标签计数器</td><td>PerkinElmer, Inc.</td><td>1420-011</td><td></td></tr><tr><td>四甲基罗丹明甲酯（TMRM） </td><td>GIBCO，隶属于 Life Technologies</td><td>T-668</td><td></td></tr><tr><td>玻璃组织研磨器</td><td>Fisher Scientific</td><td>K8885300-0002</td><td></td></tr><tr><td>BioRad 蛋白检测</td><td>伯乐（Bio-Rad）</td><td>500-0001底部表单</td><td></td></tr><tr><td>Amplex Red</td><td>Invitrogen</td><td>A12222</td><td></td></tr><tr><td>辣根过氧化物酶（HRP）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8125</td><td></td></tr><tr><td>SpectraMax Gemini XPS</td><td>Molecular Devices</td><td>3126666</td><td></td></tr><tr><td>兔源抗LC3抗体</td><td>Novus Biologicals</td><td>NB100-2220</td><td></td></tr><tr><td>抗小鼠 HRP 标记二抗</td><td>Abcam</td><td>ab6728</td><td></td></tr><tr><td>辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔二抗</td><td>Abcam</td><td>ab6802</td><td></td></tr><tr><td>化学发光过氧化物酶底物</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CPS160</td><td></td></tr><tr><td>单丹磺酰基尸胺</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>30432</td><td></td></tr></tbody></table>

一种新型合成的7-去氧水仙环素c-1类似物联合他莫昔芬增强人乳腺腺癌和神经母细胞瘤细胞的凋亡与自噬诱导

Enhancement of Apoptotic and Autophagic Induction by a Novel Synthetic C-1 Analogue of 7-deoxypancratistatin in Human Breast Adenocarcinoma and Neuroblastoma Cells with Tamoxifen

乳腺癌是北美女性中最常见的癌症之一。目前许多抗癌疗法，包括电离辐射，均通过DNA损伤诱导细胞凋亡。然而，这类疗法对癌细胞缺乏选择性，对正常细胞也会产生类似的毒性。我们已报道天然化合物平颅菌素（pancratistatin, PST）可选择性地诱导癌细胞凋亡。最近，一种新型PST类似物——7-去氧平颅菌素的C-1乙酰氧甲基衍生物（JCTH-4）通过从头合成获得，其在多种癌细胞系中表现出与PST相当的选择性诱导凋亡活性。近年来，自噬在恶性肿瘤中被发现具有双重作用，既可作为化疗应答中的促存活机制，也可作为促死亡机制。他莫昔芬（Tamoxifen, TAM）在多种癌症中始终表现出诱导促存活自噬的作用。本研究评估了JCTH-4单独使用以及与TAM联合使用在人乳腺癌（MCF7）和神经母细胞瘤（SH-SY5Y）细胞中诱导细胞死亡的效力。单独使用TAM可诱导自噬，但几乎不引起细胞死亡；而单独使用JCTH-4则显著诱导凋亡，并伴随一定程度的自噬诱导。有趣的是，联合治疗显著增强了凋亡和自噬的诱导作用。我们利用延时显微镜监测了MCF7细胞在TAM诱导自噬、JCTH-4诱导凋亡与自噬，以及联合治疗加速细胞死亡过程中的时间依赖性形态学变化。我们已证实这些化合物通过靶向线粒体在这些癌细胞中诱导凋亡/自噬。重要的是，这些处理对非癌性人成纤维细胞的存活无影响。因此，这些结果表明，JCTH-4与TAM联合使用可作为针对乳腺癌和神经母细胞瘤细胞的一种安全且高效的抗癌疗法。

我们合成了一个与天然 pancratistatin 具有相当抗肿瘤活性的新型类似物；有趣的是，JCTH-4 与他莫昔芬联合治疗可显著增强线粒体靶向诱导的细胞凋亡和自噬，同时对非癌变成纤维细胞影响极小。因此，JCTH-4 与他莫昔芬联用可能提供一种安全的抗癌治疗方案。

一种新型合成的7-去氧水仙环素C-1类似物联合他莫昔芬增强人乳腺腺癌和神经母细胞瘤细胞的凋亡与自噬诱导

乳腺癌是北美女性中最常见的癌症之一。目前许多抗癌治疗方法，包括电离辐射，均可诱导……

本实验的总体目标是评估J CTH four（一种天然化合物胰腺抑素的合成类似物）单独或与他莫昔芬联合使用时，在人乳腺癌细胞和神经母细胞瘤细胞中诱导的细胞毒性选择性及细胞死亡机制。该目标通过以下步骤实现：首先培养MC7乳腺癌细胞、SHSY5Y神经母细胞瘤细胞以及正常胎儿成纤维细胞（NFF）；第二步是评估J CTH four和他莫昔芬单独或联合处理后的细胞毒性。通过用这些药物处理细胞，并监测细胞凋亡和自噬特征性的时程形态学变化。接着，通过检测这些癌细胞分离出的线粒体膜电位及活性氧的产生，研究细胞凋亡和自噬的诱导机制。最终，利用延时摄影和多种生物化学检测方法证明，JCT four 可诱导人乳腺癌和神经母细胞瘤细胞发生细胞凋亡和自噬，而加入他莫昔芬后，这些效应显著增强。重要的是，这些处理方法不影响非癌变人成纤维细胞的存活，表明J CTH四与他莫昔芬联合使用可作为针对乳腺癌和神经母细胞瘤细胞的一种安全且高效的抗癌疗法。该技术的应用前景包括癌症联合治疗方案的临床前评估与开发，因为研究者可以监测潜在抗癌化合物所诱导的癌细胞死亡的效应及其作用模式。尽管该方法可用于研究J CT四与他莫昔芬在乳腺癌和神经母细胞瘤细胞中诱导细胞毒性的机制，但它也可推广应用于其他抗癌体系及其它潜在抗癌化合物的研究。我们最初是在观察到J ct H4与他莫昔芬在杀伤癌细胞时具有协同作用时，提出了这一方法。他莫昔芬通常可激活自噬，而J ct H4则在癌细胞中诱导凋亡性细胞死亡。因此，我们希望监测癌细胞在发生凋亡或自噬过程中的形态学变化。MC7 人乳腺腺癌细胞在 RPMI 1640 培养基中培养，并维持在 37 摄氏度和 5% 二氧化碳环境中。在对这些细胞进行药物处理和延时显微镜实验前，必须在二级生物安全柜内无菌条件下操作。将约 2.0 × 10⁵ 个细胞接种于 35 毫米玻璃底培养皿中，于 37 摄氏度和 5% 二氧化碳条件下孵育。当细胞融合度达到 60% 至 70% 时，即可用合成的胰腺他汀类似物 J, CT H4 或他莫昔芬（tam）进行处理，处理浓度分别为 1 微摩尔的 J CT H4 和 10 微摩尔的 tam。三种实验条件分别为：单独使用J CT四处理、单独使用TAM处理，以及JCTH四与TAM联合处理；未处理对照组则仅加入DMSO。在加入相应试剂或试剂组合后，将细胞重新放回培养箱中孵育48小时，随后将细胞置于Leica DMI 6,000荧光显微镜载物台上的加热腔室中，在37摄氏度、5%二氧化碳条件下进行观察。使用LAS AF 6,000软件设置显微镜，以400倍放大倍数每隔5分钟采集一次相差或明场显微图像，持续18小时。开始此操作时，用胰蛋白酶消化一个汇合度为100%的T75培养瓶中的C7SHSY5Y细胞或正常人胚成纤维细胞。待细胞脱落后，加入5至10毫升培养基终止胰蛋白酶反应，并将细胞悬

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增强细胞凋亡和自噬的诱导合成一种新型的C-1 7-deoxypancratistatin的类似物在人类乳癌细胞和神经母细胞瘤与他莫昔芬

开发了基于B型明胶的工程化纳米载体系统（GENS），用于胰腺癌治疗中的全身性基因递送和转染。通过在纳米颗粒表面修饰表皮生长因子受体（EGFR）特异性肽段，该系统可靶向EGFR受体，并在还原性环境（如细胞内高浓度谷胱甘肽）下释放质粒。...

靶向表皮生长因子受体的明胶纳米颗粒在人胰腺癌细胞中的治疗性基因递送与转染

自噬是一种普遍存在的过程，使细胞能够降解并回收蛋白质和细胞器。我们采用先进的荧光显微技术，对自噬诱导过程中发生的微小但关键的物理变化进行可视化和定量分析，包括自噬体和溶酶体的形成与分布，以及它们融合形成自噬溶酶体的过程。...

利用先进的三维荧光显微镜对自噬进行定量分析

通过活细胞共聚焦成像，实时记录了菲啶类化合物PJ-34在有丝分裂过程中对癌细胞的细胞毒性作用。PJ-34可清除含有额外中心体的有丝分裂期人乳腺癌MDA-MB-231细胞。与正常的双极有丝分裂不同，在PJ-34存在下，额外的中心体未能聚集到两个纺锤体极。...

活体癌细胞中通过共聚焦成像观察到的异常有丝分裂相关的细胞死亡

在重建基底膜上进行乳腺上皮细胞的三维培养是一种有效模拟 体内...

三维培养：研究乳腺细胞正常腺泡结构与恶性转化的工具

本文介绍了一种适用于生物专业本科生的可行实验课程模块，该模块利用动物细胞培养技术探讨高级的细胞与分子生物学概念。学生通过化疗药物处理，培养、鉴定并操控一种乳腺癌细胞模型。通过传统和新型两种方法进行细胞计数，以检测细胞活力。...

利用小鼠乳腺肿瘤细胞讲授核心生物学概念：一个简单的实验模块

本文介绍了一种长期延时显微镜方法，用于纵向追踪单个细胞对抗癌治疗药物的反应。...

透过表象：利用延时显微镜与单细胞纵向追踪研究抗癌治疗药物

本实验将展示我们如何合成并表征阿司匹林-富马酸前药的抗NFκB及抗肿瘤干细胞活性。...

合成与表征一种抑制NF-κB活性及乳腺癌干细胞的阿司匹林-富马酸前药

本文介绍了一种通过荧光激活细胞分选技术分离凋亡乳腺癌细胞的实验方案，并进一步利用流式细胞术检测乳腺非干细胞样癌细胞在凋亡逆转后向乳腺癌干细胞样细胞转变的过程。...

流式细胞术检测乳腺癌干细胞样细胞在凋亡逆转后的新形成

本实验方案的目的是通过LC3免疫荧光染色及LC3点状结构定量分析，检测胰腺癌细胞和胰腺腺泡细胞中的自噬水平。...

利用LC3免疫荧光评估两种不同胰腺细胞模型中的自噬水平

本实验方案描述了一种全面的策略，用于评估红景天苷在抑制MCF-7细胞增殖和迁移方面的药理作用及其作用机制。...

探究红景天苷抑制MCF-7细胞增殖与迁移的药理作用及分子机制

了解JCTH-4与他莫昔芬联合诱导人类乳腺癌和神经母细胞瘤细胞凋亡与自噬的机制。该方法通过监测线粒体膜电位和活性氧产生，评估选择性细胞毒性，为开发安全有效的抗癌联合疗法提供重要依据。

一种新型合成的7-去氧水仙环素C-1类似物联合他莫昔芬增强人乳腺腺癌和神经母细胞瘤细胞的凋亡与自噬诱导

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