重复性小鼠坐骨神经挤压和再生的后续评估整装肌肉分析
2012年2月22日
在这份报告中，我们描述了一种方法来粉碎小鼠坐骨神经。这种方法使用现成的止血钳和轻松，重现产生完整的坐骨神经。此外，我们描述了一种方法来准备适合分析坐骨神经后神经再生肌肉整个坐骑。
该程序的总体目标是展示一种简单的可重复的坐骨神经挤压方法和坐骨神经挤压后肌肉神经再支配的整架分析。这是通过首先暴露坐骨神经来实现的，包括正确安排手术牵开器以确保良好的神经通路。接下来，用止血钳压碎神经，并用木炭标记神经。
然后从后肢去除由坐骨神经支配的单个肌肉。最后一步是在免疫染色后解剖单个肌肉以进行整片分析。最终，结果表明可以简单地进行可重复的坐骨神经挤压，并且可以使用肌肉孔安装来分析随后的再生。
该程序的主要优点是它提供了一种简单可重复的技术来粉碎坐骨神经并随后对轴突再生进行评分。通过腹膜内注射使用每公斤氯胺酮 100 毫克和每公斤甲苯噻嗪 10 毫克的混合物麻醉小鼠进行手术，以减轻术后疼痛，从而开始此过程。小鼠还接受每公斤 10 毫克美洛昔康的皮下注射。
接下来，使用手术剪刀小心地剃掉两个后躯。然后涂抹 nare 脱毛霜以完全消耗。使用无菌棉签涂抹器和 Betadine 手术磨砂膏清洁皮肤。
之后，用无菌棉签涂抹器将眼药膏涂抹在眼睛上。将鼠标放在干净的不锈钢板上，盖在预热的顺势主题毯上，并将动物的温度保持在 37 摄氏度。然后用胶带把所有的肢体都用胶带固定下来。
小心地对称地放置后肢，使膝关节与身体成直角。随后，在显微镜下用无菌窗帘覆盖手术区域。在中线上做一个半圆形切口。
轻轻地将皮肤与下面的肌肉组织分开，并不时折叠起来。在手术过程中涂抹约 0.1 毫升无菌生理盐水以保持手术部位湿润。接下来，打开臀大肌和股二头肌前头之间的筋膜平面。
揭示坐骨神经以进行手术控制。对侧坐骨神经应暴露和活动，但保持完整。然后休息并缝合臀肌组织。
用牵开器以相同的方式暴露实验性坐骨神经。为了便于可视化。使用一把虹膜切除术剪刀轻轻地将坐骨神经从周围的结缔组织中释放出来。
然后使用细 5 45 镊子将神经置于超细止血钳的下颌，将三个筋膜相邻对齐，而不是彼此重叠。止血钳在距尖端 1.5 毫米处刻有标记。在挤压之前，将坐骨神经的最外层与该标记对齐。
这确保了均匀宽度的挤压，并且当由于挤压力而被压平时，神经不会延伸到止血钳的钳口之外。如果神经延伸到镊子尖端之外，神经只会被部分压碎。使用第二对预先浸渍并撒有碳粉的止血钳来标记挤压部位。
点击三下，在同一挤压部位挤压神经 15 秒。任何碳标记都不应超出初始压碎的边界。如果需要精确标记挤压部位以将镊子预先浸入碳中并防止手术部位的广泛碳，这一点尤其重要。
打开碳粉中的镊子。然后轻轻合上它们。使用无菌纱布擦去止血钳外部的碳
。在至少 3 倍放大倍率下检查镊子，以验证粉碎表面是否均匀地涂有碳粉。如有必要，它们被重新浸入并擦拭休息，并以与对侧相同的方式缝合臀肌组织。最后，使用 9 毫米反射夹闭合皮肤切口。
如果发现 9 毫米反射夹限制运动，可以使用较小的反射夹或 6 根自动缝合线。相反，在牺牲鼠标后，去除四块肌肉。后肢的胫骨前趾长伸肌、腓骨长肌和比目鱼肌小心翼翼地穿过它们的结缔组织固定在黑色沙条涂层的盘子上。
然后用 PBS 冲洗它们。随后，将它们在 4% 多聚甲醛中固定 30 分钟。要在黑色 sard 涂层培养皿上解剖每块肌肉，请使用虹膜切除术剪刀从中取出肌腱。
之后，通过剥离内部肌肉纤维来使肌肉变薄 小心保护肌肉的外表面，包括终板带。然后，用矢量护罩和 22 x 40 毫米的玻璃盖玻片将所得肌肉安装在载玻片上，用透明指甲油密封两侧。当它们正确安装在载玻片上时，nplate 条带应与盖玻片接触。
这是一个左后肢原位挤压部位的示例。粉碎部位用黑碳表示。星号标志着胫神经的一个分支，支配大腿肌肉组织，是一个有用的标志。
在挤压手术中，坐骨神经的胫骨支用蓝色、腓骨和绿色以及 srel 和黄色勾勒。这个半薄切片展示了使用止血钳进行的完全挤压。箭头在此处表示压碎的纤维。
使用斜镊子进行的不完全挤压在另一个半鳍截面中指示。箭头再次表示压碎的纤维，而箭头表示保存的轴突。这些是整个坐骑肌肉的渲染图像。
去除结缔组织并随后变薄后，在每块肌肉上勾勒出 nplate 带。这里显示的是 sous whole mount 肌肉。坐骨神经挤压后 14 天。
箭头表示神经肌肉接头中被轴突重新支配的区域。这是去神经支配神经肌肉接头的演示。间隙 43 个阳性 schwan 细胞突由箭头表示。
在这个去神经支配的神经肌肉接头中没有看到轴突。看完这个视频，你应该对如何可重复地粉碎静态神经和准备肌肉激素支架进行再生分析有一个很好的了解。
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概述
本报告描述了一种简单且可重复的方法用于压迫小鼠坐骨神经并分析肌肉再神经支配。该技术利用现成的止血钳实现完全神经压迫，并包括肌肉全部安装的制备以便进行再生分析。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 再生医学
- 肌肉生理学
背景
- 坐骨神经损伤可导致显著的运动功能缺损。
- 理解神经再生对于开发治疗策略至关重要。
- 全部安装分析提供了对肌肉再神经支配的见解。
- 现有方法可能缺乏可重复性和可及性。
研究目的
- 展示一种可重复的坐骨神经压迫方法。
- 为随后的神经再生分析准备肌肉全部安装。
- 提供一个简单易行的协议，可供研究人员轻松采用。
所用方法
- 使用外科牵引器暴露坐骨神经。
- 用止血钳压迫神经并用炭黑标记。
- 从后肢中取出由坐骨神经支配的单个肌肉。
- 免疫染色后进行肌肉全部安装分析解剖。
主要结果
- 该方法允许一致且完整的坐骨神经压迫。
- 肌肉全部安装可以有效分析再生。
- 结果证明了该方法在研究神经修复方面的可行性。
- 研究结果有助于理解肌肉再神经支配过程。
结论
- 该方法为研究神经损伤的研究人员提供了一个可靠的工具。
- 全部安装分析是评估肌肉再神经支配的有价值的技术。
- 该协议可以轻松实施在各种研究环境中。
常见问题
Executive Industry Relevance
This method provides a reproducible model for studying peripheral nerve regeneration, enabling mechanistic de-risking of therapeutic targets in preclinical neuroscience programs. By standardizing sciatic nerve crush and quantifying reinnervation via whole mount muscle analysis, it supports target validation and assay development for neuroprotective or neuroregenerative candidates. The approach enhances predictive confidence in early discovery by linking axonal growth to functional reinnervation readouts.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses on axonal regeneration and Schwann cell interactions in a genetically tractable model.
- Operational Value: Uses widely available transgenic mouse lines to dissect molecular mechanisms of nerve repair with high reproducibility.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative, imaging-ready outputs (e.g., neuromuscular junction reinnervation) for high-content screening of compound libraries.
- Operational Value: Standardizes crush site marking and muscle preparation to ensure assay consistency across laboratories and timepoints.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Bridges discovery to preclinical validation by modeling axonotmesis, a clinically relevant peripheral nerve injury.
- Operational Value: Supports risk-adjusted advancement decisions through longitudinal, structure-function correlation of regeneration.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target hypothesis testing to lead identification, providing a disease-relevant system for evaluating biologics or small molecules aimed at enhancing nerve repair.
- Discovery Biology: Supports pathway clarification and functional target validation by enabling precise measurement of axonal regeneration kinetics.
- Screening: Delivers assay-ready tissue preparations with quantifiable dependent variables (e.g., reinnervated endplate bands) for compound effect assessment.
- Analytics: Generates statistical outputs from whole mount imaging that allow comparison of regeneration efficacy across experimental conditions.
- Translational Research: Aligns with preclinical continuity by using a rodent model predictive of human peripheral nerve lesion responses.
- Enterprise Reuse: Establishes a standardized, scalable platform for repeated use in target de-risking and lead optimization campaigns.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in target validation through direct visualization of axonal-Schwann cell-basal lamina interactions.
- Operational Value: Ensures reproducibility via standardized crush force, site marking, and muscle whole mount protocol.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing objective, histology-based regeneration metrics early in the pipeline.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of neuroregenerative candidates based on functional reinnervation data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microsurgery, tissue dissection, and immunofluorescence staining.
- Depends on access to stereomicroscopes, hemostatic forceps, and imaging systems for whole mount analysis.
- Necessitates cross-team standardization of crush duration, marking technique, and muscle fixation timing.
- Involves adaptation considerations when applying the model to different mouse strains or genetic backgrounds.
- Limited by the need for terminal procedures and skilled handling to maintain crush consistency and marking fidelity.
