Name: 海藻酸钠微胶囊作为一个人类胚胎干细胞（胚胎干细胞）的繁殖和分化的3D平台，以不同的谱系 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-03-09T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 1 s
Description: 学习利用海藻酸钠微胶囊技术，在三维环境中培养人类胚胎干细胞并诱导其分化为多巴胺能神经元。该方法通过优化细胞间相互作用，显著提高分化效率，为神经退行性疾病治疗提供新策略。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

本工作由澳大利亚国家健康与医学研究委员会项目资助（NHMRC Program Grant #568969，PSS）以及新南威尔士大学医学院干细胞计划（KSS）资助。

以下所有操作均在 II 级生物安全柜内采用无菌技术进行。所用试剂和设备列于下表中。
1. 1.1% 海藻酸钠溶液（w/v）的制备
<ol>
	<li>取0.275 g纯化的海藻酸钠（高甘露糖醛酸含量≥60%，黏度&gt;200 mPa·s，内毒素≤100 EU/g）加入无菌50 ml离心管中，再加入25 ml先前配制的无菌0.1%明胶溶液（0.5 g明胶溶于500 ml Milli-Q H2O，经高压灭菌溶解）。</li>
	<li>涡旋振荡管子约30秒以初步溶解海藻酸钠粉末，随后将管子置于轨道混合器上，10 × g条件下过夜孵育（室温）。</li>
	<li>向25 ml海藻酸钠溶液中加入2.778 ml无菌9% NaCl溶液（4.5 g NaCl溶于50 ml Milli-Q H2O）。涡旋振荡约30秒后，于95 × g离心5分钟。</li>
	<li>海藻酸钠溶液可短期储存于4 °C（1–2个月），或长期储存于-20 °C（约一年）。</li>
</ol>
2. CaCl₂的制备2 沉淀浴
<ol>
	<li>将14.7 g的CaCl2.2H2O和2.38 g HEPES溶解于1升milli-Q H2O中。</li>
	<li>调节pH值至7.4。</li>
	<li>使用0.22 μm滤器对溶液进行除菌。</li>
	<li>沉淀浴可在室温下保存（6–12个月）。</li>
</ol>
3. 脱壳溶液的制备
<ol>
	<li>在500 ml杜氏磷酸盐缓冲液（D-PBS）中，加入50 ml 0.5 M EDTA和5 ml 1 M HEPES。</li>
	<li>使用0.22 μm滤器过滤灭菌，或在121 °C下高压灭菌20分钟。</li>
	<li>将去囊溶液在室温下保存（6–12个月）。</li>
</ol>
4. 血清替代物（SR）培养基的制备
<ol>
	<li>在包封之前，按照特定试剂和设备表中的说明预先准备SR培养基。</li>
</ol>
5. ROCK抑制剂（Y-27632）的配制
<ol>
	<li>将Y-27632粉末用含0.1%人血清白蛋白（HSA）的D-PBS稀释，配制成5 mM的溶液。</li>
</ol>
6. 胚胎干细胞封装前的准备
<ol>
	<li>在 37 °C 条件下，用添加了 10 μM ROCK 抑制剂（RI）的培养基对细胞进行预处理，持续两小时（避光）。</li>
	<li>RI 处理后，用 D-PBS 洗涤细胞两次，并在 37 °C 下使用 accutase 酶解 10 分钟，使细胞从培养皿上脱离。</li>
	<li>用移液管或细胞刮轻轻刮下细胞，收集至 15 ml 离心管中，并以 1:1 的比例加入 SR 培养基中和 accutase 的作用。</li>
	<li>为制备单细胞悬液，使用 40 μm 滤膜过滤中和后的细胞，收集至新的 50 ml 离心管中。</li>
	<li>使用血细胞计数板计算溶液中细胞的总数。</li>
	<li>将细胞悬液以 95 × g 离心 5 分钟，小心弃去上清液；用预热的 0.9% NaCl 洗涤细胞，再以 95 × g 离心 5 分钟，弃去上清液。</li>
</ol>
7. 细胞包封
<ol>
	<li>准备一个连接有14G × 2英寸静脉导管软塑料管的1 ml注射器。该装置用于吸取细胞悬液，并将其装载到注射泵上，如图1所示。</li>
	<li>用预热的海藻酸钠溶液重悬细胞，细胞密度为每毫升海藻酸钠溶液含125万个细胞。使用注射器轻轻混匀，避免产生气泡。</li>
	<li>按照图1所示设置微珠生成器、注射泵和空气流量计。这些设备的详细信息见“特定试剂与设备”表格。</li>
	<li>将吸入细胞的注射器取下静脉导管的塑料管部分，并将注射器连接至包封装置。确保包封装置末端与收集点之间保持10 cm的距离，如图1所示。</li>
	<li>通过设定注射泵流速为20 ml/hr、空气流速为8 L/min、压力为100 kPa进行细胞包封（可通过调节空气流速改变微胶囊的大小）。</li>
	<li>将包封后的细胞收集至盛有20 ml预热沉淀液的培养皿（100 × 15 mm）中，静置7分钟以稳定微胶囊。</li>
	<li>轻柔吸取包封后的细胞，转移至装有20 ml 0.9% NaCl溶液的50 ml离心管中。</li>
	<li>待微胶囊沉降至管底后，小心弃去上清液，并用0.9% NaCl溶液重复洗涤一次。</li>
	<li>将包封后的细胞重悬于预热的培养基中，培养基中添加RI（10 μM），转移至培养瓶中，在37 °C、5% CO2条件下孵育。</li>
</ol>
8. 包封人胚胎干细胞向多巴胺能神经元的分化
在分化前，将包裹的hESC用RI处理3天。
<ol>
	<li>以 1.0 × 10 的密度接种小鼠基质细胞系 PA6 细胞4 每厘米2 在T75培养瓶中预先用0.1%明胶包被，并在分化前24小时用DA神经分化培养基（见材料表）对PA6细胞进行预处理。</li>
	<li>将胶囊转移至50 ml离心管中，静置使其沉降至管底。</li>
	<li>弃去上清液，将胶囊重悬于PA6细胞条件化的DA神经分化培养基中。</li>
	<li>将包封的人胚胎干细胞（hESC）与PA6细胞单层共培养（9 x 10⁵）6 每 7.5 x 10 的 hESCs5 PA6细胞培养28天，第4天换液，之后每隔一天换液一次（每次仅更换一半培养基）。</li>
	<li>在与PA6细胞共培养3周后，在剩余的1周内向多巴胺能神经分化培养基中添加100 ng/ml SHH和100 ng/ml FGF8a。</li>
</ol>
9. 人胚胎干细胞包封体的去包封
<ol>
	<li>将胶囊吸入15 ml离心管中，静置使其沉降至管底，然后小心弃去上清液。</li>
	<li>用D-PBS洗涤胶囊两次，待胶囊沉降至管底后，移除上清液。</li>
	<li>向胶囊中加入5 ml去囊溶液，通过反复吸打充分混匀悬浮液，随后在室温下孵育4-5分钟。</li>
	<li>将去囊后的细胞以95 × g离心3分钟，并弃去上清液。</li>
	<li>用D-PBS洗涤细胞沉淀，随后以95 × g离心3分钟，重复一次。</li>
	<li>去囊后的细胞可进一步作为单层细胞培养，或用于后续分析。</li>
</ol>
10. 代表性结果
海藻酸盐微胶囊的直径为 400–500 μm。通过将总细胞数除以每轮实验的微胶囊总数，估算每个胶囊内的细胞数量。因此，估计每个胶囊中约含有 5.0 × 104 个细胞。据此推断，该胶囊最多可容纳的细胞数约为 1.0 × 105。利用羧基荧光素二乙酸琥珀酰亚胺酯（CFDA）/碘化丙啶（PI）染色法测定，包封的人胚胎干细胞（hESC）存活率&gt;80%（图2）。我们通过将海藻酸盐浓度从 2.2% 降低至 1.1%，并将沉淀浴由氯化钡更换为氯化钙，优化了 hESC 的包封条件。在这些条件下，我们发现只有以 1.1% 海藻酸钙包封的细胞能够存活、增殖并体外形成拟胚体（EBs）in vitro1。为进一步优化条件，我们考察了培养基和ROCK抑制剂 Y-27632（RI）的影响。图2和图3所示数据表明，RI 可防止解离诱导的细胞凋亡，维持细胞存活率，并促进细胞聚集成簇1,6。此外，在含 RI 的人成纤维细胞条件培养基（hFF-CM + RI）中培养的包封 hESC，其存活率显著高于未添加 RI 的各组；但与在无血清培养基（SR + RI）中培养的包封 hESC 相比，差异无统计学意义。同样，通过 BrdU 检测发现，随着单个细胞逐渐聚集成簇，细胞增殖率从 25% 上升至 75%（图3）。TUNEL 凋亡检测显示，在 SR 培养基中培养的微胶囊内单个细胞发生凋亡（数据未显示），而从 hFF-CM 中回收的细胞簇大多 TUNEL 染色阴性。在一定程度上，添加 bFGF 的 hFF-CM 即使在不使用 Y-27632 的情况下，也能促进包封 hESC 的存活与增殖。然而，在包封前（2 小时）及包封后（额外 4 天）使用 Y-27632 处理，可显著提高在 1.1% 海藻酸钙微胶囊中包封的 hESC 的存活率、增殖能力及聚集成簇能力。
此前我们已证明，包封的人胚胎干细胞（hESC）可成功分化为定型内胚层1。在此，我们探讨了细胞包封作为一种三维平台，用于将包封的hESC分化为多巴胺能（DA）神经元的应用。在胶囊中形成拟胚体（EB）的hESC在所述条件下直接分化，并在去包封后表现出渐进的神经元形态（图4），培养2-3天后细胞存活率超过90%。基因表达分析显示，分化7天后，多能性标志物OCT4表达下调，而神经前体细胞标志物PAX6和DA神经元标志物TH表达上调（图5A）。免疫荧光染色显示，分化7天后，hESC呈PAX6阳性（&gt;80%），OCT4阴性。进一步分化至21天时，hESC产生TH阳性（&gt;90%）的神经元（图5B）。Western blot分析也显示，TH表达自第14天起上调（图5C），而PAX6表达在第21天后下调。相比之下，在类似条件下的二维（2D）培养环境中（例如，分化前进行2小时RI预处理和3天RI后处理），在整个分化期间PAX6阳性细胞比例仍维持较高水平（&gt;80%），但向TH阳性细胞的分化效率低于包封所提供的3D环境（&lt;60%）（图5A和C）。

<ol><li>Chayosumrit, M., Tuch, B., Sidhu, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alginate+microcapsule+for+propagation+and+directed+differentiation+of+hESCs+to+definitive+endoderm%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Alginate microcapsule for propagation and directed differentiation of hESCs to definitive endoderm.</a> Biomaterials. 31, 505-514 (2010).</li>
<li>Dean, S. K., Yulyana, Y., Williams, G., Sidhu, K. S., Tuch, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+encapsulated+embryonic+stem+cells+after+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Differentiation of encapsulated embryonic stem cells after transplantation.</a> Transplantation. 82, 1175-1184 (2006).</li>
<li>Siti-Ismail, N., Bishop, A. E., Polak, J. M., Mantalaris, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+benefit+of+human+embryonic+stem+cell+encapsulation+for+prolonged+feeder-free+maintenance%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The benefit of human embryonic stem cell encapsulation for prolonged feeder-free maintenance.</a> Biomaterials. 29, 3946-3952 (2008).</li>
<li>Dawson, E., Mapili, G., Erickson, K., Taqvi, S., Roy, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomaterials+for+stem+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Drug+Deliv.+Rev%22%5BJournal%5D)">Biomaterials for stem cell differentiation.</a> Adv. Drug Deliv. Rev. 60, 215-228 (2008).</li>
<li>Cell encapsulation: promise and progress. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Nat.+Med%22">Nat. Med</a>. Orive, G. 9, 104-107 (2003).</li>
<li>Watanabe, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+ROCK+inhibitor+permits+survival+of+dissociated+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells.</a> Nat. Biotechnol. 25, 681-686 (2007).</li>
<li>Dang, S. M., Gerecht-Nir, S., Chen, J., Itskovitz-Eldor, J., Zandstra, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlled%2C+scalable+embryonic+stem+cell+differentiation+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Controlled, scalable embryonic stem cell differentiation culture.</a> Stem Cells. 22, 275-282 (2004).</li>
<li>Drukker, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+expression+of+MHC+proteins+in+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Characterization of the expression of MHC proteins in human embryonic stem cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 99, 9864-9869 (2002).</li>
<li>Calafiore, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Standard+Technical+Procedures+for+Microencapsulation+of+Human+Islets+for+Graft+into+Nonimmunosuppressed+Patients+With+Type+1+Diabetes+Mellitus%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation+Proceedings%22%5BJournal%5D)">Standard Technical Procedures for Microencapsulation of Human Islets for Graft into Nonimmunosuppressed Patients With Type 1 Diabetes Mellitus.</a> Transplantation Proceedings. 38, 1156-1157 (2006).</li>
<li>Cho, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+and+large-scale+generation+of+functional+dopamine+neurons+from+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Highly efficient and large-scale generation of functional dopamine neurons from human embryonic stem cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 3392-3397 (2008).</li>
<li>Vazin, T., Chen, J., Lee, C. T., Amable, R., Freed, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+stromal-derived+inducing+activity+in+the+generation+of+dopaminergic+neurons+from+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Assessment of stromal-derived inducing activity in the generation of dopaminergic neurons from human embryonic stem cells.</a> Stem Cells. 26, 1517-1525 (2008).</li>
</ol>

我们无任何利益冲突需要披露。

多项利用小鼠胚胎干细胞和人胚胎干细胞的研究已证明，三维培养系统在生物材料和组织工程中的优势2,3我们采用海藻酸钙微胶囊作为合适的三维平台，以研究人胚胎干细胞（hESC）的扩增和分化，相较于海藻酸钡微胶囊，因为hESC在海藻酸钙中封装后表现出显著更高的存活率。该培养系统还支持高密度细胞培养，并允许营养物质和氧气通过膜进行有效交换。7在胶囊内已观察到自发性分化现象，推测未分化的hESC在胶囊内持续增殖后，最终会突破胶囊形成畸胎瘤。1另一种包封技术的临床应用是为移植细胞提供免疫保护，使其免受宿主免疫系统的攻击。预计人胚胎干细胞（hESC）及其分化衍生物在移植后可能引发免疫排斥反应，因为未分化hESC的MHC I类抗原表达水平较低，而在分化后其表达水平会升高8. 据报道，移植通常使用较高浓度的海藻酸盐，以避免免疫排斥反应2,9. 本研究采用较低浓度的海藻酸盐（1.1%），更适用于 体外 hESC 的培养与分化。目前尚不确定，我们所使用的较低浓度海藻酸盐是否会在这些包封的 hESC 移植到免疫活性宿主时，引发与先前报道相...

<table><tbody><tr><td>海藻酸钠（Pronova UP MVG） </td><td>NovaMatrix</td><td>4200101</td><td>高葡萄糖醛酸含量 &amp;#8805;60%，黏度 &amp;gt;200 mPa s，和内毒素 &lt;u&gt;&amp;lt;&lt;/u&gt;100 EU/g</td></tr><tr><td>明胶</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1890-100G</td><td></td></tr><tr><td>0.9% NaCl</td><td>Baxter Internationl Inc.</td><td>AHF7123</td><td></td></tr><tr><td>J1型微珠发生器 </td><td>Nisco Engineering Inc</td><td>SPA-0447</td><td></td></tr><tr><td>多通道注射泵</td><td>新时代</td><td>Model NE-1000</td><td></td></tr><tr><td>Ezi-Flow Medical 流量计</td><td>Gascon Systems</td><td>G0149</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632</td><td>默克 &amp;amp; Co., Inc.</td><td>688000</td><td></td></tr><tr><td>人血清白蛋白</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4327-1G</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>EMD Millipore</td><td>SCR005</td><td></td></tr><tr><td>14G × 2&amp;#8221; 静脉导管</td><td>Terumo Medical Corp.</td><td>SR-OX1451C</td><td></td></tr><tr><td>Knockout-DMEM</td><td>Invitrogen</td><td>10829-018</td><td>用于SR培养基（基础）</td></tr><tr><td>GlutaMAX -I </td><td>Invitrogen</td><td>35050-061</td><td>对于SR培养基（2 mM）</td></tr><tr><td>无血清替代物 </td><td>Invitrogen</td><td>10828-028</td><td>对于SR培养基（20%）</td></tr><tr><td>青霉素-链霉素</td><td>Invitrogen</td><td>15070063</td><td>对于SR培养基（2.5 U/ml）</td></tr><tr><td>胰岛素-转铁蛋白-硒（ITS）</td><td>Invitrogen</td><td>41400045</td><td>对于SR培养基（1x）</td></tr><tr><td>&amp;#946;巯基&amp;#8211;乙醇</td><td>Invitrogen</td><td>21985-023</td><td>对于SR培养基（0.1 mM）</td></tr><tr><td>MEM NEAA 溶液</td><td>Invitrogen</td><td>11140-050</td><td>对于SR培养基（5 mM）</td></tr><tr><td>格拉斯哥最低必需培养基</td><td>Invitrogen</td><td>11710035</td><td>用于多巴胺能神经元分化培养基（基础）</td></tr><tr><td>无血清替代物 </td><td>Invitrogen</td><td>10828-028</td><td>用于多巴胺能神经分化培养基（10%）</td></tr><tr><td>丙酮酸钠</td><td>Invitrogen</td><td>11360070</td><td>用于多巴胺能神经分化培养基（1 mM）</td></tr><tr><td>MEM非必需氨基酸溶液</td><td>Invitrogen</td><td>11140-050</td><td>用于多巴胺能神经分化培养基（0.1 mM）</td></tr><tr><td>&amp;#946;巯基&amp;#8211;乙醇</td><td>Invitrogen</td><td>21985-023</td><td>用于多巴胺能神经分化培养基（0.1 mM）</td></tr><tr><td>音猬因子（SHH）</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>1314-SH-025/CF</td><td>用于多巴胺能神经元分化（100 ng/ml）</td></tr><tr><td>成纤维细胞生长因子8a（FGF8a） </td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>4745-F8-050</td><td>用于多巴胺能神经分化（100 ng/ml）</td></tr></tbody></table>

海藻酸盐微胶囊作为人胚胎干细胞（hesc）向不同谱系扩增与分化的三维平台

Alginate Microcapsule as a 3D Platform for Propagation and Differentiation of Human Embryonic Stem Cells (hESC) to Different Lineages

人类胚胎干细胞（hESC）作为一种极具吸引力的细胞替代疗法来源正在兴起，因为它们可以在体外培养中无限扩增，并分化为体内任何类型的细胞。在干细胞培养中，多种类型的生物材料也被用于构建模拟干细胞微环境的体系1-3。后者对于促进细胞间的相互作用、细胞增殖以及向特定谱系分化和组织结构形成具有重要意义，其机制在于提供一种三维（3D）环境4，例如细胞封装技术。细胞封装的基本原理是将活细胞包埋于半透膜内，在三维培养体系中实现物理限制2。这些半透膜允许营养物质、氧气和信号分子自由通过，而宿主中大于微胶囊孔径的抗体和免疫细胞则被阻隔在外5。本文介绍了一种利用海藻酸盐微胶囊在三维微环境中培养并诱导hESC分化为多巴胺能（DA）神经元的方法。我们已对培养条件2进行了优化，以提高封装后hESC的存活率。我们先前的研究表明，在该三维培养平台上添加p160-Rho相关卷曲螺旋激酶（ROCK）抑制剂Y-27632以及人胎儿成纤维细胞条件培养的血清替代物（hFF-CM），可显著提升封装hESC的存活率，且这些细胞表达了定型内胚层标志基因1。目前，我们已将该三维平台应用于hESC的扩增及其向DA神经元的高效分化。在完成DA神经元分化的最终阶段后，蛋白和基因表达分析显示，多巴胺能神经元标志物——酪氨酸羟化酶（TH）的表达水平在两周内提高了&gt;100倍。我们推测，基于海藻酸盐微胶囊构建的这一三维培养平台可能有助于研究hESC向多种谱系的增殖与定向分化过程。此外，该三维系统可在分化过程中实现饲养层细胞与hESC的物理分离，并在未来移植应用中具备免疫隔离的潜力。

我们优化了一种微胶囊化技术，作为胚胎干细胞向内胚层和多巴胺能（DA）神经元增殖与分化的有效三维平台。该技术还可在细胞移植过程中实现细胞与宿主之间的免疫隔离。此平台也可适用于其他类型的细胞。

海藻酸盐微胶囊作为人胚胎干细胞（hESC）向不同谱系扩增与分化的三维平台

人类胚胎干细胞（hESC）作为一种有吸引力的细胞替代疗法替代来源正受到关注，因为它们可以在培养中扩增……

本方案经过优化，可将多能性人类胚胎干细胞包封，并在三维系统中将其分化为多巴胺能神经元。首先，用ROCK抑制剂（RI）处理细胞集落，使其解离为单细胞，并与海藻酸钠混合后通过包封装置进行包封。继续使用RI处理三天，随后将包封的细胞转移至PA六孔板中，并进行为期28天的分化。最终，基因和蛋白质表达分析表明，该方法在生成多巴胺能神经元方面具有更高的效率。与现有的二维分化方案相比，该技术的主要优势在于，我们尝试在三维环境中进行这些细胞的扩增和分化，而三维环境使细胞能够以高密度的方式进行扩增，同时为细胞间的相互作用提供了更佳条件，从而促进分化。第三，还能提高后续分化过程的效率。此外，需要补充的是，该特定技术也可适用于其他可在三维环境中培养的细胞类型。需要注意的是，该技术的优化基于使用一种特定的 ROCK 抑制剂，以防止细胞凋亡以及细胞从培养皿上脱落。通常，初次接触该方法的研究人员在初期会遇到一定困难，因为该技术在组织培养中并不常见。以下包封技术是基于 Dean 博士和 Chad 博士关于 R 抑制剂型海藻酸盐的应用、海藻酸盐浓度以及包封装置参数的总结研究而优化的。我们实验室的博士生 Jamie 和 Kim 将演示本实验方案。在无菌的50毫升离心管中，将25毫升无菌0.1%明胶溶液加入275毫克纯化的海藻酸钠中，涡旋混匀以使海藻酸钠粉末部分溶解。然后将离心管置于10×g的轨道摇床上过夜。接下来，向海藻酸钠溶液中加入9%无菌氯化钠溶液。涡旋30秒，然后以95 × g离心5分钟。将海藻酸溶液在4°C下避光保存。首先在黑暗环境中，用添加了10 µM ROCK抑制剂的培养基对人胚胎干细胞进行预处理。在37摄氏度下孵育两小时。随后用DPBS洗涤细胞两次，以酶法解离细胞。加入accutase，孵育10分钟。在 37 摄氏度下，使用细胞刮轻轻收集细胞，并转移至 15 毫升离心管中。用等体积的 SL 培养基中和 Accutase。然后将中和后的细胞通过 40 微米滤膜，收集到新的 50 毫升离心管中。现在使用血细胞计数板对细胞进行计数。通过离心沉淀细胞，小心弃去上清液，然后用预温的缓冲液洗涤细胞一次。0.9%氯化钠。离心收集细胞并弃去上清液。为了包封人胚胎干细胞，首先用预热的海藻酸盐溶液重悬细胞。为此，将一个 20 毫升注射器连接到软质塑料管上，并用注射器吸取海藻酸盐。然后使用注射器轻柔地混匀细胞悬液，避免产生气泡。接着将细胞吸回注射器中。丢弃塑料管，然后将注射器连接到包封机上。接着安装微珠发生器、注射泵、气流计和氯化钙沉淀浴等仪器。确认包封机末端与培养皿收集点之间保持10厘米的间距。接下来，将注射泵设置为每小时10毫升。气流速率为每分钟8升，压力为100千帕。将包封的细胞收集到预热的沉淀浴中，持续7分钟。然后通过轻柔吸移将它们转移至含有20毫升0.9%氯化钠溶液的50毫升离心管中，让胶囊沉降到管底，轻轻弃去上清液，再用0.9%氯化钠溶液洗涤一次。接着将包封的细胞重悬于添加了ROCK抑制剂的预温培养基中，转移至培养瓶，并培养三天。将小鼠基质细胞系 PA six 细胞接种于经 0.1% 明胶包被的 T75 培养瓶中，并用多巴胺能神经分化诱导培养基预处理 24 小时。将胶囊转移至 50 毫升离心管中，静置使其沉降至管底。弃去上清液，将胶囊重悬于 PA six 细胞条件化多巴胺能神经分化培养基中。培养基培养。将包封的人胚胎干细胞与PA六细胞单层共培养21天。更换培养基时进行换液。每次仅更换一半培养基，继续培养PA6细胞以诱导其多巴胺能神经分化。加入诱导因子的培养基孵育一周。首先用移液器吸取胶囊并转移至15毫升离心管中。当胶囊沉降至底部后，弃去上清液。用DPBS洗涤两次，每次均弃去上清液。然后加入5 mL去头裂解液，并充分混匀悬浮液。在室温下孵育五分钟。离心收集沉淀后，去除上清液，用DPBS洗涤两次，随后将去上清的细胞用于单层培养或立即进行后续分析。在典型制备条件下，海藻酸盐微胶囊的直径介于400至500微米之间。此处采用 C-F-D-A-P-I 检测法。通过对不同时间点的人包封胚胎干细胞的活力、增殖和凋亡进行分析，结果显示包封细胞的绿色活细胞比例达到 80%，可用于优化培养条件。有趣的是，ROCK 抑制剂具有防止解离诱导的细胞凋亡的作用，并能维持细胞活力，提示在 H-F-F-C-M 培养基中添加 ri 培养的包封人胚胎干细胞表现出更优的生长状态。本示例采用细胞封装技术作为三维平台，将封装的人胚胎干细胞分化为多巴胺能神经元。与预期一致，随着培养时间的延长，胚胎体的尺寸逐渐增大；在培养两到三天后，去封装的细胞表现出渐进的神经元形态，细胞存活率超过90%。基因表达分析显示多能性标志物OCT4的表达下调。重要的是，经过七天分化后，神经前体细胞标志物PAC six和多巴胺能神经元标志物TH仍持续呈上调状态。进一步分化21天后的人胚胎干细胞显示，超过90%的神经元为TH阳性。Western blot分析证实，在三维（3D）与二维（2D）细胞培养系统相比，TH和PAC six的表达模式更为理想。掌握该技术后，可在两小时内高效完成操作。请记住在包封前后均需用 ROCK 抑制剂处理细胞。不同的诱导剂或抑制剂可用于调整三维分化方案，以适用于未来的实验。这种特定的技术可将人类ESL细胞进行包封，并在三维环境中诱导其分化，具有用于多种疾病、尤其是帕金森病的细胞治疗潜力。

alginate-microcapsule-as-3d-platform-for-propagation-differentiation

Research

科研

JoVE Journal

Bioengineering

生物工程

海藻酸钠微胶囊作为一个人类胚胎干细胞（胚胎干细胞）的繁殖和分化的3D平台，以不同的谱系

本视频展示了人类神经干细胞在三维支架内的发育与分化过程。支架表面的层粘连蛋白涂层可促进细胞黏附，而无生长因子的神经培养基则诱导细胞分化为神经前体细胞。这些细胞在多孔结构中向多个方向延伸其突起，形成三维培养体系。...

利用多孔支架将人神经干细胞分化为三维培养

本视频展示了将人类胚胎干细胞诱导为神经类器官的逐步操作方案。该方法包括诱导神经玫瑰花环结构的形成，随后进行可控的成熟过程，最后在疏水性膜上培养，以获得完全发育的神经类器官。...

人胚胎干细胞向神经类器官的分化与成熟

用于再生研究的谐波纳米颗粒

为了表征miRNA在分化的人类神经干细胞（hNSCs）中的变化，本文描述了在三维系统中进行hNSC分化的方法、通过miRNA...

三维培养条件下人神经干细胞系的分化、microRNA及潜在靶基因分析

我们建立了一种利用同轴喷嘴将多能干细胞（PS细胞）包封于海藻酸盐水凝胶微胶囊中的方法。该方法可防止细胞过度聚集，并降低悬浮培养过程中细胞所受的剪切应力。该技术适用于多能干细胞的大规模生产以及干细胞微环境的研究。...

使用同轴喷嘴进行多能干细胞的海藻酸盐封装

人类多能干细胞（hPSCs）具有分化并自组织形成特定组织结构的内在能力；然而这一过程需要空间环境梯度的引导。本文介绍了一种简单且可靠的模板微图形化技术，可用于构建生化和力学梯度，从而调控hPSCs的分化模式。...

用于研究分化命运空间组织的人类多能干细胞模板微图形化技术

本方案描述了一种利用定义明确的培养系统和细胞自组装方法，从人多能干细胞生成肝细胞球的策略。该方案在多种细胞系中具有可重复性，成本效益高，并可实现用于生物医学应用的稳定人肝细胞球的制备。...

从多能干细胞无血清生成三维人肝细胞球

可将细胞外基质配体图案化修饰到聚丙烯酰胺水凝胶上，从而在柔性的基底上实现人胚胎干细胞在限定区域内的克隆培养。该方法可与牵引力显微镜技术及生物化学检测相结合，用于研究组织几何形态、细胞自身产生的力学力与细胞命运决定之间的相互作用。...

在可变形基底上调控人胚胎干细胞集落几何形状以控制组织尺度力学特性

本文介绍了一种人类胚胎干细胞单细胞培养及其后续分化为神经前体细胞的实验方案。该方案操作简便、稳定可靠、可扩展性强，适用于药物筛选和再生医学应用。...

利用人胚胎干细胞单细胞培养实现高效神经分化

本文描述了一种将人类胚胎干细胞（hESCs）分化为功能性肝细胞样细胞（HLCs）的详细方案，该方法在hESCs向定型内胚层（DE）分化过程中持续添加Activin...

一种高效诱导人胚胎干细胞定向分化为肝细胞样细胞的方法

本文介绍了利用同轴流动聚焦装置包封人多能干细胞（hPSCs）的方法。我们证明，该微流控包封技术可高效生成hPSC细胞球。...

微流控法制备负载人多能干细胞球体的核-壳微胶囊

学习利用海藻酸钠微胶囊技术，在三维环境中培养人类胚胎干细胞并诱导其分化为多巴胺能神经元。该方法通过优化细胞间相互作用，显著提高分化效率，为神经退行性疾病治疗提供新策略。

海藻酸盐微胶囊作为人胚胎干细胞（hESC）向不同谱系扩增与分化的三维平台

探索更多视频