海藻酸盐微胶囊作为人胚胎干细胞（hESC）向不同谱系扩增与分化的三维平台

本方案经过优化，可将多能性人类胚胎干细胞包封并在三维系统中将其分化为多巴胺能神经元。首先，用ROCK抑制剂（RI）处理细胞集落，并使用混有海藻酸钠的胰蛋白酶将其消化为单细胞，随后通过包封装置进行包封。继续使用RI处理三天，然后将包封的细胞转移至PA6细胞上，并分化28天。

最终，基因和蛋白质表达分析显示，该方法在生成多巴胺能神经元方面具有更高的效率。与现有的二维分化方案相比，这种特定技术的主要优势在于，我们尝试在三维环境中进行这些细胞的扩增和分化，而三维环境使细胞能够以高密度的方式进行扩增。同时，它还为细胞间的相互作用提供了更有利的条件，从而促进更有效的分化。

第三，还能提高后续分化过程的效率。此外，需要补充的是，该特定技术也可适用于其他可在三维环境中培养的细胞类型。需要注意的是，该技术的优化基于使用一种特定的ROCK抑制剂，该抑制剂可防止细胞凋亡，并防止细胞从培养皿上脱落。

通常，初次接触该方法的研究人员在初期会遇到困难，因为该技术在组织培养中并不常被使用。以下的包封技术已根据 Dean 博士和 Chad 博士关于 R 型抑制剂海藻酸盐的应用、海藻酸盐浓度以及包封装置参数的总结研究进行了优化。我们实验室的博士生 Jamie 和 Kim 现将演示该实验方案。

在无菌50毫升离心管中，将25毫升无菌0.1%明胶溶液加入275毫克纯化的海藻酸钠中，涡旋混匀以使海藻酸钠粉末部分溶解。然后将离心管置于10×g的轨道摇床上过夜。接下来，向海藻酸钠溶液中加入9%无菌氯化钠溶液。

涡旋30秒，然后在95 × g下离心5分钟。将海藻酸钠溶液于4 °C避光保存。首先在避光环境中，用添加了10 µM ROCK抑制剂的培养基对人胚胎干细胞进行预处理。

在 37 摄氏度下孵育两小时。随后用 DPBS 洗涤细胞两次，以酶法解离细胞。加入阿曲汀（accutane），孵育 10 分钟。

在 37 摄氏度下，使用细胞刮轻轻收集细胞，并转移至 15 毫升离心管中。用等体积的 SL 培养基中和 Accutase。然后将中和后的细胞通过 40 微米滤膜，收集到新的 50 毫升离心管中。

现在使用血细胞计数板对细胞进行计数。通过离心收集细胞沉淀，小心弃去上清液。然后用预热的缓冲液洗涤细胞一次。

0.9%氯化钠。离心收集细胞并弃去上清液。为了包封人胚胎干细胞，首先用预热的海藻酸盐溶液重悬细胞。

为此，将一个 20 毫升注射器连接到软质塑料管上，并用注射器吸取海藻酸盐。然后使用注射器轻轻混合细胞悬液，避免产生气泡。接着将细胞吸回注射器中。

丢弃塑料管，然后将注射器连接到包封机上。接着设置微珠生成装置、注射泵、气流计和氯化钙沉淀浴等仪器。确认包封机末端与培养皿收集点之间保持10厘米的间距。

接下来，将注射泵设置为每小时10毫升。气流速率为每分钟8升，压力为100千帕。将包封的细胞收集到预热的沉淀浴中，持续7分钟。

然后用轻柔的吸液方式将它们转移至含有20毫升0.9%氯化钠溶液的50毫升离心管中，让胶囊沉降到管底，轻轻弃去上清液，再用0.9%氯化钠溶液洗涤一次。接着将包封的细胞重悬于添加了ROCK抑制剂的预温培养基中，转移至培养瓶，并在培养箱中孵育三天。

将小鼠基质细胞系 PA six 细胞接种于经 0.1% 明胶包被的 T75 培养瓶中，并用多巴胺能神经分化培养基预处理 24 小时。将胶囊转移至 50 毫升离心管中，静置使其沉降至管底。弃去上清液，将胶囊重悬于 PA six 细胞条件化多巴胺能神经分化培养基中。

培养基培养。将包封的人胚胎干细胞与PA6细胞单层共培养21天。更换培养基时进行换液。

每次仅更换一半的培养基，继续培养PA6细胞以进行多巴胺能神经分化。加入诱导因子的培养基孵育一周。首先用吸管吸出胶囊，并将其转移至15毫升离心管中。

当胶囊沉降至底部后，弃去上清液。用DPBS洗涤两次，每次均弃去上清液。然后加入5 mL去头裂解液，并充分混匀悬浮液。

在室温下孵育五分钟。离心收集沉淀后，去除上清液，用DPBS洗涤两次，随后将去上清的细胞用于单层培养或立即进行后续分析。在典型制备条件下，海藻酸盐微胶囊的直径介于400至500微米之间。

在此，采用 C-F-D-A-P-I 检测方法。通过对不同时间点包封的人胚胎干细胞的活力、增殖和凋亡进行分析，结果显示 80% 的包封细胞为绿色且具有活性，可用于优化培养条件。有趣的是，ROCK 抑制剂可防止解离诱导的细胞凋亡，维持细胞活力，并表明在 H-F-F-C-M 培养基中添加 ri 后，包封的人胚胎干细胞表现出更优的生长状态。

本示例采用细胞包封技术作为三维平台，将包封的人胚胎干细胞分化为多巴胺能神经元。与预期一致，随着培养时间的延长，类胚体的尺寸逐渐增大；包封细胞在培养两到三天后表现出渐进的神经元形态，存活率超过90%。基因表达分析显示多能性标志物OCT4的表达下调。

重要的是，神经前体细胞标志物PAC six和多巴胺能神经元标志物th在分化七天后仍持续上调。进一步分化的人类胚胎干细胞在21天后显示超过90%的TH阳性神经元。Western印迹分析证实，在三维（3D）与二维（2D）细胞培养系统相比，TH和PAC six的表达模式更为有利。

掌握该技术后，可在两小时内高效完成操作。请务必在包封前后用ROCK抑制剂处理细胞。在后续实验中，可使用不同的诱导剂或抑制剂来调整三维分化方案。

这种特定技术可将人类ESL进行包封，并在三维环境中诱导其分化，具有用于多种疾病尤其是帕金森病的细胞治疗潜力。