Name: 组织芯片，免疫组织化学染色和数字化生产在人类蛋白质图集 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-05-31T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 8 s
Description: 了解组织芯片技术用于高通量蛋白质表达分析的方法。该技术通过将多个组织核心组装到单一石蜡块中，进行免疫组织化学染色和数字化成像，为神经科学和组织学研究提供高效、可重复的实验方案。

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本工作得到了克努特和爱丽丝·瓦伦伯格基金会资助项目的资助。特此感谢人类蛋白质图谱中心位于乌普萨拉、斯德哥尔摩和印度的全体工作人员为创建人类蛋白质图谱所付出的努力。作者特别感谢弗兰克·哈马尔（Frank Hammar）和索菲·古斯塔夫松（Sofie Gustafsson）在拍摄照片方面提供的协助，以及埃莱内·卡尔贝里（Elené Karlberg）在组织芯片（TMA）制备方面的协助。

1. 如何准备组织微阵列制作所需的组织（动画 1）
<ol>
 <li>选择相关的福尔马林固定石蜡包埋材料（组织或细胞样本），并包括相应的苏木精染色组织切片。</li>
 <li>在组织切片上标记相关区域。建议使用与石蜡块对应的 freshly cut 苏木精染色切片。</li>
 <li>设计用于组织微阵列（TMA）制备的模板。在模板内对样本进行随机排列，以避免因技术问题（如抗体在整个 TMA 切片上的覆盖不均或切片问题）导致的假象。在模板中添加额外的定位标记以辅助定位。</li>
 <li>根据模板排列组织样本。</li>
</ol>
2. 手动组织芯片制备（拍摄必需）
<ol>
<li> 为获得标准化的组织芯长度，需在套针上标记特定长度，例如 4.5 mm（图 2）。样本中心间距的参考标准如下： 
芯直径 0.6 mm – 间距 0.8-1.0 mm 
芯直径 1.0 mm – 间距 1.8-2.0 mm 
芯直径 1.5 mm – 间距 2.0-3.0 mm 
芯直径 2.0 mm – 间距 2.5-4.0 mm 
建议在石蜡包埋块的每侧保留 2.5-3.0 mm 的边缘，以防止石蜡开裂。 
</li>
<li>
 <ol class="lalpha">
 <li> 安装选定的穿孔针。首先松开固定穿孔针的内六角螺丝。当穿孔针轮毂上的凹槽牢固地抵住塑料 V 型块中的金属杆时，穿孔针即处于正确位置。拧紧螺丝，并确保金属夹片边缘保持水平。</li>
 <li> 受体穿孔针（以绿色和红色标记，具体取决于供应商）应放置在左侧。供体穿孔针（以绿色和蓝色标记，具体取决于供应商），其直径略大，应放置在右侧（图 3）。</li>
 </ol>
</li>
<li>
 <ol class="lalpha">
 <li> 通过使用 XY 调节旋钮移动穿孔针，沿 x 轴和 y 轴进行调整。右侧调节旋钮控制穿孔针沿 x 轴移动，左侧调节旋钮控制沿 y 轴移动。 
 两个调节旋钮均配有数字千分尺读数显示，旋转时自动激活。 </li>
 <li> 复位 → 按 ZERO/ABS 按钮。 
 在英寸与毫米之间切换 → 按 IN/mm 按钮。 
 使用 1 mm 穿孔针制作 9×8 模板时，孔中心之间的间距应为 2.0 mm（以孔中心间距离测量）。</li>
 </ol>
</li>
<li>
 <ol class="lalpha">
 <li> 为防止穿孔针插入过深，撞击包埋盒并损坏穿孔针，将一个不含石蜡的包埋盒放入夹持器中，并通过调节 Z 向导轨左上角的深度限位螺丝，将受体穿孔针的底部位置设定在包埋盒底部上方 1 mm 处（图 3）。</li>
 <li> 将受体包埋块放入夹持器中，并使用最小的螺丝刀拧紧固定螺丝。注意不要过度拧紧，以免石蜡从包埋盒中脱落。</li>
 <li> 将受体穿孔针向下推入受体包埋块约 5 mm，并使用穿孔针上的手柄前后旋转一次（图 3）。当穿孔针尽可能深入包埋块时，所形成的孔深为 5 mm。</li>
 <li> 缓慢释放向下的压力，使弹簧将穿孔针向上弹回。使用套针将穿孔针内的石蜡芯推出并弃去。</li>
 </ol>
</li>
<li> 转动转塔，切换至供体穿孔针（图 3）。</li>
<li> 将带有供体包埋块的供体桥架放置在受体包埋块夹持器上方（图 3）。</li>
<li>
 <ol class="lalpha">
 <li> 将供体穿孔针插入供体包埋块的选定区域。使用相应的苏木精-伊红染色切片，其中已标记出感兴趣区域，以定位待取样的组织。用左手手动固定供体包埋块位置，右手推动穿孔针。注意：不应在套针上施加推力。深度限位装置在供体包埋块的适当位置不会阻止穿孔针运动，因此当套针上的第二个标记可见时，必须停止推进。</li>
 <li> 将穿孔针手柄旋转一次（图 3）。在仍用手固定供体包埋块于供体桥架上的同时，缓慢释放向下的压力。</li>
 <li> 供体组织的穿孔深度建议比受体芯短 0.5 mm。此操作可确保组织芯在受体包埋块表面实现可调节的对齐，避免代表性组织的丢失。</li>
 </ol>
</li>
<li> 移除桥架和供体包埋块。确保供体穿孔针与先前制作的孔对齐（第 4 步）。若供体穿孔针与受体包埋块中的孔未对齐，必须使用调节螺丝调整穿孔针位置。</li>
<li> 小心地将穿孔针向下推动，直至其尖端到达受体包埋块孔的顶部。在此位置保持稳定，使用套针将组织芯推入孔中。组织芯表面应与包埋块表面齐平。</li>
<li> 将转塔移回至受体穿孔针。</li>
<li> 使用 XY 调节旋钮移动至下一个位置。</li>
<li> 从上述第 4c 步开始重复操作，直至完成整个组织微阵列。</li>
<li> 完成整个受体包埋块后，松开夹持器中的固定螺丝。将包埋块在 42 °C 下烘烤 40 分钟。将包埋块的切面朝下放置于载玻片上。将载玻片连同包埋块置于试管架（或其他合适的支撑装置）上，并放入烘箱。烘烤结束后，从烘箱中取出试管架，轻轻滑动载玻片以压平包埋块表面。</li>
<li> 将载有包埋块的载玻片置于冷却板上冷却 10 分钟。 
 为确保组织微阵列（TMA）中组织的代表性，需对每第 50th 个切片进行质量控制。</li>
</ol>
3. 如何切片组织芯片（动画 2）
<ol>
 <li>使用带有切片转移系统的切片机（HM 355S, Microm）切割4 μm厚的切片。该系统可与所有现有的旋转式切片机配合使用。系统由集成转移桥的刀片架、加热的水浴槽和控制单元组成。切片从刀片经由转移桥滑过湿润的转移表面进入水浴槽。</li>
 <li>切片在水中充分展开后应立即从水浴中取出，以避免敏感组织区域（例如富含脂质的组织，如乳腺和脑组织）发生融化。将切片置于防脱玻片（superfrost玻璃片）上。切片在水中停留的时间取决于所使用的石蜡类型和水温。本实验室使用HistoLab Products AB生产的石蜡，其熔点为56–58 °C，建议水浴温度为37–39 °C。</li>
 <li>将玻片放入玻片架中，在室温（RT）下过夜干燥。</li>
 <li>将玻片在50 °C下烘烤12–24小时。若使用无STS系统的切片机，则需借助毛刷等工具手动将切片从刀片转移至水浴中。</li>
</ol>
4. 免疫组织化学检测与滴定程序（动画 3）
每种抗体均采用专门设计的组织芯片（TMA）进行标准化测试，这些芯片包含多种组织和不同类型的细胞。目的是为每种抗体评估个体化且优化的免疫染色方案。首先根据一抗的储存浓度选择一个稀释比例进行测试。该初步染色结果将用于指导后续的稀释梯度及实验方案的优化。
<ol>
 <li>免疫染色前，需使用二甲苯和梯度乙醇对组织切片进行脱蜡和水化处理，直至蒸馏水。</li>
 <li>使用含0.3% H2O2的95%乙醇溶液孵育5分钟，以阻断内源性过氧化物酶活性。</li>
 <li>采用pH 6的抗原修复缓冲液进行热诱导表位修复（HIER），以压力锅（Decloaking chamber, Biocare Medical）作为热源，在125 °C下处理4分钟。煮沸结束后，载玻片保留在压力锅中自然冷却至90 °C。HIER全过程总时长约45分钟。</li>
 <li>若初次检测未能获得明确结果，可根据观察到的染色模式进一步开展其他检测5 6。人类蛋白质图谱计划（HPA）高通量实验体系中的一项预实验表明，最有效的抗原修复方法为HIER pH 6，但当然也可采用其他修复方式，如蛋白酶预孵育、微波处理或在pH值更高或更低的缓冲液中煮沸。通过调整免疫组化条件，例如改变一抗孵育时间、抗体稀释比例以及二氨基联苯胺（DAB）显色时间，可获得更具诊断意义的染色结果。</li>
</ol>
5. 染色程序，Autostainer 480（Thermo Fisher Scientific）
所有孵育步骤均在室温下进行，本方案也可使用相同试剂手动操作。
<ol>
 <li>用洗涤缓冲液冲洗。</li>
 <li>加入Ultra V封闭液，孵育5分钟。</li>
 <li>用洗涤缓冲液冲洗。</li>
 <li>加入一抗，孵育30分钟。</li>
 <li>用洗涤缓冲液冲洗（重复两次）。</li>
 <li>加入标记的辣根过氧化物酶聚合物，孵育30分钟。</li>
 <li>用洗涤缓冲液冲洗（重复两次）。</li>
 <li>用DAB溶液显色10分钟。</li>
 <li>用洗涤缓冲液冲洗（重复两次）。</li>
 <li>用Mayers苏木精复染5分钟*。当使用渐进性染色法（如Mayers苏木精）时，染色强度取决于时间，无需进行分化处理。而使用退行性染色法（如Harris苏木精）时，则需进行分化处理，以去除组织中多余的染料，从而突出目标结构。</li>
 <li>用自来水冲洗*。</li>
 <li>用饱和溶液按1:5稀释的碳酸锂水溶液冲洗1分钟*。</li>
 <li>用自来水冲洗5分钟*。</li>
 <li>切片经梯度乙醇脱水，并用封片剂封片（PERTEX, Histolab）。</li>
</ol>
所有试剂的加样量均为每张载玻片300 μl。 
* 步骤10-14在组织染色仪（Autostainer XL, Leica）中进行，封片步骤 additionally 在封片系统（Automated glass coverslipper CV5030, Leica）中完成。
6. 如何扫描载玻片
扫描玻片的方法取决于所使用的数字扫描仪，本方案仅定义如何使用Aperio XT（Aperio Technologies）自动扫描系统扫描玻片。在人类蛋白质图谱的设置中，组织采用20倍放大，细胞采用40倍放大。由于组织的异质性以及组织微阵列（TMA）中包含的不同组织数量较多，自动扫描可能会遇到聚焦问题。
<ol>
 <li>用玻璃片清洁剂去除污垢和胶水，并检查盖玻片与切片之间是否存在气泡。若出现气泡，需重新封片。</li>
 <li>将玻片放入玻片架中，并将玻片架置于数字扫描仪内。以20倍放大倍率扫描一张组织芯片（TMA）所需时间约为6分钟。使用Aperio公司的软件选择感兴趣区域。软件将自动完成对焦点的选择，也可手动选择扫描区域和对焦点。</li>
 <li>图像生成后，可用于评估和标注免疫组化（IHC）染色结果。图像作为实验结果文件予以保存，可供分享给同事进行讨论，并可用于后续数据发表。图像可通过Aperio公司提供的免费软件进行查看。</li>
</ol>
7. 如何在人类蛋白质图谱中搜索您感兴趣的蛋白质
<ol>
 <li>访问 <a href="http://www.proteinatlas.org." target="_blank">www.proteinatlas.org.</a></li>
 <li>输入您感兴趣的蛋白质名称、Ensembl ID、UniProt 登录号或 HGNC 名称，例如胰岛素（insulin）。</li>
 <li>进入摘要页面并向下滚动至正常组织与器官摘要部分。该概览显示该蛋白质在胰腺中的表达情况。</li>
 <li>点击“更多组织数据”，进入正常组织视图，在此可查看按器官分类的所有包含的组织。</li>
 <li>点击胰腺以查看针对同一蛋白质的三种抗体的免疫组化（IHC）结果。如需查看胰腺的高分辨率图像，请点击相应图像。</li>
 <li>有关该蛋白质在癌症组织、细胞中的表达情况以及人类蛋白质图谱中的进一步验证数据，可通过浏览人类蛋白质图谱网站获取。</li>
</ol>
8. 代表性结果
动画 1. 组织芯片制作的组织样本制备方法。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3620/3620_animation_1_Web.mov" target="_blank">点击此处查看动画 1</a>。
动画 2. 如何切片组织微阵列（TMA）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3620/3620_animation_2_Web.mov" target="_blank">点击此处查看动画 2</a>。
动画 3. 此处介绍了免疫组织化学技术。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3620/3620_animation_3_Web.mov" target="_blank">点击此处查看动画 3</a>。
<img alt="组织微阵列流程图、数字切片分析、使用人类蛋白质图谱进行的抗体染色。" src="/files/ftp_upload/3620/3620fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 1"> 
图 1. 人类蛋白质图谱乌普萨拉中心内整个流程的总体示意图。
<img alt="静态平衡；黄铜摆组件；标有长度；示意图；物理实验。" src="/files/ftp_upload/3620/3620fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 2"> 
图 2. 供体穿刺针芯标记出组织芯的标准长度（例如 4.5 mm）。
<img alt="用于样本分析的组织芯片设置示意图，显示供体和受体打孔装置。" src="/files/ftp_upload/3620/3620fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 3"> 
图 3. 手动组织芯片仪。
<img alt="点印迹实验结果；蛋白质检测；三个膜样本显示出不同的结合模式。" src="/files/ftp_upload/3620/3620fig4.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 4"> 
图 4. 不同质量的组织微阵列（TMA）制备示例。（A）一个笔直且正确对齐的TMA，行与列之间以及与石蜡边缘之间均有足够的空间。（B）一个部分芯样过于靠近边缘的TMA，可能导致切片时出现困难。（C）一个烘烤时间过长的TMA，导致结构塌陷，失去正确的模板形态。
<img alt="点印迹检测结果，显示膜上标记为 A、B、C 的蛋白质检测情况" src="/files/ftp_upload/3620/3620fig5.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 5"> 
图 5. 苏木精和伊红染色的组织微阵列。（A）切面良好的切片，行列整齐笔直；使用劣质或不洁刀片可能导致切片分裂（B）或压缩（C）。
<img alt="免疫组织化学分析；组织切片中蛋白质表达比较，包含方法示意图。" src="/files/ftp_upload/3620/3620fig6.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图6"> 
图6. 抗体滴定。（A）淋巴结中的生发中心细胞显示经优化滴定的抗体，产生特异性的胞质染色（呈棕色），无背景染色。（B）该组织切片显示染色较弱。当一抗浓度过低，或目标蛋白在免疫染色组织中不存在时，会出现阴性或弱染色。（C）由于使用了一抗过高浓度，导致组织切片过度染色。深色染色因溢出、交叉反应和假阳性而难以判断蛋白质的亚细胞定位。

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</ol>

我们没有需要披露的内容。

免疫组织化学是目前组织芯片（TMA）应用最为广泛的技术。将免疫组织化学与组织芯片相结合，可用于多种不同场景，例如对组织7 8和细胞9 10中蛋白质表达模式的高通量筛选、基于大样本量患者队列组织样本的生物标志物发现研究11 12，以及更基础的肿瘤生物学研究，包括不同表型/基因型、分化阶段、进展过程及转移机制等13。使用组织芯片的一个优势在于，可同时分析来自大样本队列的组织材料，既节省了宝贵的生物样本，又提高了实验的可重复性。此外，组织芯片技术还能显著降低试剂成本和实验室处理时间。由于组织芯片所含组织量有限，组织异质性成为一个需要关注的问题。根据组织类型及研究目的的不同，可能需要从同一标本中取多个样本。对于肿瘤组织，建议每个标本取2至4个组织芯，因为已有研究表明，这种做法能够高度准确地代表整张组织切片的特征13 14。根据组织构成的不同，打孔直径（范围从0.6 mm到2 mm）可作相应调整。组织结构复杂，包含多种不同类型的细胞、结构以及细胞外基质。每种不同类型组织的组成成分（如脂肪、血管、结缔组织、软骨等含量各异）会影响打孔和获取独立组织芯所需的压力。因此，在利用具有明确研究目的的组织制备正式的组织芯片之前，务必先使用无研究价值的材料对操作流程中的各个步骤进行充分练习。
在同一个组织芯片（TMA）蜡块中包埋多种不同组织时，蜡块的组成可能会影响获得高质量切片的能力。某些组织（如皮肤、骨髓、脂肪、脑和乳腺）由于质地差异，会影响切片在水浴中展开的程度以及刀片切割时的难易程度，从而导致TMA蜡块切片困难。因此，建议在可行的情况下，将具有相似特征的组织（例如富含脂质的组织）归入同一个TMA中。大多数癌组织在此方面具有较高的均一性，有利于癌症TMA的切片。当处理包含多种异质性组织类型的TMA时，可采用一种替代切片方法以稳定芯片中的组织微柱。使用粘附胶带有助于防止组织微柱丢失或脱落。但使用胶带时需谨慎，因为胶带可能影响切片微柱的厚度，进而影响免疫组化（IHC）染色的结果15。在人类蛋白质图谱（Human Protein Atlas）的实验设置中，采用9×8（不含标记位点）的TMA排列模板。为获得尽可能多的切片并确保蜡块中所有组织在整个切片过程中均被保留，通常在一张玻片上放置两个切片，从而实现最大9×8的排列模板，以节省试剂和扫描时间。
蛋白质信息的主要数据库——通用蛋白质资源16包含约20,300条经过审阅的人类蛋白质条目，其中仅有约66%具有蛋白质水平的实验证据。此外，对于大多数在蛋白质水平上已有存在证据的基因，其蛋白质功能及表达分布的信息仍十分有限或缺失。未来的一个重要挑战是分析这些未知蛋白质在各类人体组织中的分布模式和相对丰度。可利用Uniprot、ENSEMBL等数据库以及PubMed中已发表的数据作为指导，判断针对未知蛋白质的抗体在免疫组织化学染色中所呈现的染色模式是否真实反映了目标蛋白质的实际表达谱。此外，还需采用多种其他验证策略以确保抗体的功能性，例如在蛋白质芯片、Western印迹、免疫荧光、免疫沉淀和下拉实验中验证抗体的功能性。其中，验证抗体功能性的最重要工具之一可能是使用配对抗体，即针对同一目标蛋白质上两个不同且不重叠的表位所产生的两种不同抗体，比较其在特定检测中的结果一致性17。
根据汇总的信息，抗体的检测和滴定遵循免疫组化（IHC）标准，并结合了人类蛋白质图谱项目中对超过35,000种抗体进行测试与验证的经验。对于超过20%的具有蛋白质表达谱的基因，已采用成对抗体（即针对同一蛋白质上非重叠表位的两种或多种抗体）的数据，以确定相应蛋白质表达模式的最佳估计值。成对抗体为验证基于免疫组化的特异性蛋白质表达模式提供了最可靠的策略。该策略具有重要价值，因为在基础筛选中包含大量不同组织，增加了交叉反应的风险。还应注意，某些组织通常更容易出现背景染色，例如巨噬细胞、平滑肌、肾脏的远端小管以及肝脏中的肝细胞。其他需要考虑的问题包括：对来自存档材料的组织，其组织处理技术随时间可能发生的变化，这可能导致免疫组化出现假阴性或不适当的阳性染色结果。这一现象在大组织切片分析中同样存在。阴性对照和阳性对照均至关重要，应尽可能使用。对于包含功能分析的深入研究，可利用相应转录本强制表达或特异性敲低（siRNA技术）的细胞系来构建对照。为了在免疫组化中获得最佳结果，测试并使用抗原修复系统十分关键，因为甲醛固定会引发多种化学修饰，例如交联反应以及席夫碱的水解，从而掩盖抗原表位18。
综上所述，采用组织微阵列（TMA）技术和免疫组化（IHC）的基于抗体的蛋白质组学是一种大规模生成蛋白质表达数据的强大策略。人类蛋白质图谱计划旨在建立正常人体组织和癌症中人类蛋白质表达的图谱。该计划的目标是在2015年前发布综合性人类蛋白质图谱的初步草图。除了提供正常器官和组织中的蛋白质表达谱外，这一工作还为包括临床生物标志物发现在内的生物医学研究项目提供了起点。最终目标是在人类基因组序列的基础上增加一层新的信息，这对于深入理解各种疾病状态背后的生物学机制至关重要，并为开发新型诊断和治疗工具奠定基础。

<table><tbody><tr><td>洗涤缓冲液</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>TA-999-TT</td><td></td></tr><tr><td>柠檬酸盐缓冲液 pH6</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>TA-250-Pm1X</td><td></td></tr><tr><td>抗体稀释液</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>TA-125-UD</td><td></td></tr><tr><td>UltraVision LP HRP 聚合物</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>TL-125-HL</td><td></td></tr><tr><td>DAB Plus 底物系统</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>TA-125-HDX</td><td></td></tr><tr><td>Ultra V 封闭剂</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>TA-125-UB</td><td></td></tr><tr><td>一抗增强剂</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>TL-125-PB</td><td></td></tr><tr><td>迈耶苏木精</td><td>Histolab</td><td>01820</td><td></td></tr><tr><td>PERTEX</td><td>Histolab</td><td>00871.0500</td><td></td></tr><tr><td>手动组织芯片仪</td><td>Estigen, Beecher Instrument</td><td>MTA-1</td><td></td></tr><tr><td>瀑布式切片机</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>Microm HM 355S</td><td></td></tr><tr><td>全自动图像扫描仪</td><td>Aperio Technologies</td><td>XT</td><td></td></tr><tr><td>全自动切片染色系统</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>Autostainer 480S-2D</td><td></td></tr><tr><td>用于脱蜡和脱水的全自动切片染色系统</td><td>Leica Microsystems</td><td>Autostainer XL</td><td></td></tr><tr><td>全自动玻片封片机</td><td>Leica Microsystems</td><td>CV5030</td><td></td></tr><tr><td>去封闭室</td><td>Biocare Medical</td><td>DC2008INTEL</td><td></td></tr></tbody></table>

人类蛋白质图谱中组织微阵列的制备、免疫组织化学染色及数字化

Production of Tissue Microarrays, Immunohistochemistry Staining and Digitalization Within the Human Protein Atlas

组织微阵列（TMA）技术为多种组织和细胞的高通量分析提供了手段。该技术被用于“人类蛋白质图谱”项目中，以对正常人体组织、癌症及细胞系中的蛋白质表达模式进行全局分析。本文介绍了将从显微镜下挑选的代表性组织中获取的1毫米组织芯，组装至单个受体TMA蜡块的过程。一个TMA蜡块中包含的组织芯数量和大小可灵活调整，范围大约从40个2毫米的组织芯到数百个0.6毫米的组织芯。使用TMA技术的优势在于，仅需一次免疫染色实验即可快速获得大量数据，从而避免实验间的变异性。更重要的是，该方法仅需极少量珍贵的组织样本，因而能够对大规模的患者队列进行分析1 2。一个TMA蜡块可连续切出约250张切片（厚度为4 μm），用于免疫组织化学染色，以检测250种不同抗体的特异性蛋白质表达模式。在“人类蛋白质图谱”项目中，研究人员针对所有人源蛋白质生成抗体，并利用这些抗体获取来自144名个体的正常人体组织以及来自216名不同患者的癌症组织（涵盖20种最常见的人类癌症类型）中的相应蛋白质表达谱。经免疫组织化学染色的TMA切片被置于载玻片上并进行扫描，生成高分辨率图像，供病理学家解读并标注免疫组织化学结果。这些图像及其相应的基于病理学的注释数据，通过“人类蛋白质图谱”门户网站（<a href="http://www.proteinatlas.org" target="_blank">www.proteinatlas.org</a>）向科研界公开发布（图1）3 4。“人类蛋白质图谱”提供了一幅图谱，展示蛋白质在人体内的分布及相对丰度。当前版本包含超过1100万张图像，涵盖了12,238种独特蛋白质的表达数据，对应人类基因组所编码蛋白质总数的61%以上。

组织芯片提供了一种高效的方法，可同时获取大量组织的并行信息。将代表性组织区域组装到一个石蜡块中，从该石蜡块切片后用于免疫组织化学染色及蛋白质表达模式分析。通过数字扫描生成相应的图像，用于数据的分发与共享。

组织芯片（TMA）技术为多种组织和细胞的高通量分析提供了手段。该技术广泛应用于……

本实验的总体目标是采用一种高效的方法，在人类蛋白质图谱等高通量项目中，同时从多种组织中获取蛋白质表达的相关信息。该目标首先通过选取福尔马林固定、石蜡包埋组织的代表性区域来实现；随后对标记区域进行打孔，将所选组织芯排列并整合至同一个石蜡块中，从而构建组织微阵列。然后从组织芯片中切片并进行免疫组织化学染色。最后分析蛋白质表达模式，并将数据发布在人类蛋白质图谱上。最终，可通过组织微阵列和免疫组织化学技术获得显示蛋白质在组织和细胞中表达情况的结果。与现有方法（如对单个组织石蜡块进行免疫组织化学染色）相比，该技术的主要优势在于能够节省宝贵的生物材料，并且实验的可重复性更高。该技术的另一优势在于可降低耳鼻喉科（ENT）相关成本以及实验室处理时间。我实验室的技术员 Ian Call Bay 将演示该操作流程，以获取标准化长度的组织芯。标记套针。建议在石蜡块的每侧预留 2.5 至 3.0 毫米的边缘，以避免石蜡破裂，从而正确安装打孔针。松开固定打孔针的内六角螺钉，并调整打孔针的位置，使打孔针轴上的凹槽紧贴塑料 V 型块中的金属杆。拧紧螺丝，确保金属夹片的边缘保持水平。将受体冲孔器插入左侧，供体冲孔器插入右侧。使用 XY 调节旋钮及其数字千分尺读数，沿 X 轴和 Y 轴方向移动冲孔器。重置设备时，按下“zero a BS”按钮以在英寸和毫米之间切换，请按英寸/毫米按钮。当使用直径为1毫米的穿孔针配合9×8模板时，孔中心之间的间距应为2毫米；为防止将受体穿孔针推入过深而损坏穿孔针，需通过将一个空盒放入夹持器中，并调节位于Z向导轨左上角的深度限位螺钉，将受体穿孔针的最低位置设定为比盒底高1毫米处。在组织切片上选定并标记相关区域，并设计好组织芯片制备模板后，将受体蜡块放入夹持器中，并使用最小的螺丝刀拧紧固定螺丝。避免过度拧紧螺丝，以防石蜡从包埋盒中松脱。将受体打孔针向下推入受体蜡块约五毫米，然后使用打孔针上的手柄来回旋转打孔针。随后，缓慢释放向下的压力，使弹簧将打孔针向上顶回。使用该工具将穿孔针清空，并丢弃石蜡芯。然后转动转塔，切换至供体穿孔针。接着，将带有供体组织块的供体块桥放置在受体块架上方。使用相应的苏木精和伊红染色切片，其中已标记出目标区域，以定位待取样的组织。用左手手动固定供体蜡块，右手推动穿孔针。切勿推动针芯。深度限位器无法在供体蜡块的适当位置阻止穿孔针的运动，因此当针芯上出现第二个标记时，应立即停止推动。缓慢旋转打孔器手柄一周。在仍握住供体组织块及其支撑桥时，释放向下的压力。取下支撑桥和供体组织块。确保供体打孔针与先前制作的孔对齐。使用调节螺钉调整打孔针的位置。如果供体打孔针与受体包埋块中的孔未对齐，请小心地将打孔针向下推动，直至其尖端到达受体包埋块中孔的顶部。保持此位置的同时，使用套管针将组织芯排入孔中。组织芯的表面应与包埋块表面齐平。将转塔移回受体打孔针位置。使用 XY 调节旋钮移动到下一个位置，然后通过从受体块中打孔取样重复此过程，直至完成整个阵列。要取下受体块，需先松开固定架上的螺丝。将受体块正面朝下放置在置于合适支架上的玻片上，并在 42 °C 下烘烤 40 分钟。从烘箱中取出载玻片和包埋块，用载玻片轻轻刮擦包埋块表面以使其平整。将带有载玻片的包埋块置于冷却板上冷却10分钟。从包埋块上取下载玻片。组织块现已制备完成，可进行切片。切片后，使用针对目标蛋白的抗体对组织微阵列进行染色并数字化。通过访问网站 www.proteinatlas.org，在人类蛋白图谱中搜索该蛋白。输入感兴趣的蛋白质的集合 ID、UniProt 登录号或 HGNC 名称，例如 insulin。点击感兴趣的蛋白质，然后向下滚动至正常组织和器官摘要。该概览显示了胰腺中的蛋白质表达情况。点击该标签页。更多组织数据将显示出来。按器官排序的正常组织视图将会呈现。点击胰腺以查看针对同一蛋白质的三种抗体的免疫组化结果。点击图像可查看胰腺的高分辨率图像。本图展示了组织微阵列质量的示例：阵列排列笔直且对齐良好，行与列之间以及阵列与石蜡边缘之间留有充足的空间。而在此处，部分核心过于靠近边缘，可能导致切片过程中出现问题。此组织芯片因烘烤时间过长，且未使用正确的模板，导致结构塌陷。此处显示的是切面良好、排列整齐的直行组织切片，经苏木精、伊红染色。刀片质量不佳或不洁净可能导致切片出现此处所示的裂隙，或类似这样的压缩切片。淋巴结中的生发中心细胞显示出经最佳滴定的抗体，从而产生特异性的胞质染色，且无背景染色，如此处所示。当一抗浓度过低，或靶蛋白在免疫染色组织中不存在时，会出现阴性或弱染色。该组织切片因一抗浓度过高而出现过度染色。深色会导致溢出、交叉反应和假阳性等问题，从而难以确定亚细胞定位。观看本视频后，您应充分了解如何制备组织标记物阵列，以及在进行免疫组织化学分析蛋白质表达时如何使用该阵列。您还应充分掌握如何浏览人类蛋白质图谱，以查询人类组织和细胞中的蛋白质表达情况。

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Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

组织芯片，​​免疫组织化学染色和数字化生产在人类蛋白质图集

本方案旨在优化组织微阵列的构建与质量，以用于生物标志物研究。内容涵盖规划与设计、数字病理学、虚拟切片标注以及自动化组织阵列化等方面。...

一种用于生物标志物研究的下一代组织微阵列（ngTMA）实验方案

免疫组织化学是一种用于评估组织内蛋白质定位和表达的强有力实验技术。目前用于定量的半自动化方法往往引入主观性，并常导致结果不可重复。本文中，我们描述了多重免疫组织化学的方法，以及利用多光谱成像对蛋白质表达和共定位进行客观定量的技术。...

使用多重免疫组织化学染色与多光谱成像定量蛋白质表达及共定位

本研究优化并实施了一种六重标志物多重免疫荧光检测方案，采用自动化染色仪以获得更一致的结果并缩短操作时间。该方法可被任何实验室直接应用于免疫肿瘤学研究。...

用于福尔马林固定癌组织样本免疫肿瘤学研究的自动化多重免疫荧光检测 panel

ZW10 相互作用蛋白（ZWINT）参与有丝分裂纺锤体检查点及癌症的发病机制。本文介绍一种对人肺癌组织中 ZWINT...

人类肺组织中ZW10相互作用蛋白免疫染色的数字化分析

本文介绍一种简单且易于实施的策略，用于对福尔马林固定石蜡包埋的肿瘤组织切片中的免疫细胞进行可视化、定量和定位分析。该方法结合了现有的成像技术和数字分析手段，旨在拓展成像检测的多重检测能力和多参数分析水平。...

肿瘤微环境中免疫细胞群体的可视化、定量与定位分析

本文介绍了一种针对空间组学技术中感兴趣区域（ROIs）进行精细优化的实验方案，以更准确地表征肿瘤微环境并鉴定特定的细胞群体。对于蛋白质组学检测，可采用自动化的定制化流程来指导ROIs的选择；而在转录组学检测中，则可利用小至50...

组织中蛋白质与RNA表达的空间分析：优化虚拟显微切割的一种方法

本方案概述了使用不同深度的福尔马林固定石蜡包埋供体组织块，通过胶带法手动构建组织微阵列的方法。...

使用胶带法和手持式微阵列仪手动构建组织微阵列

在癌症免疫治疗时代，人们对阐明肿瘤微环境动态的研究兴趣显著增加。本方案详细介绍了质谱成像技术的染色和成像步骤，可实现高度多重的空间分析。...

利用质谱成像技术分析福尔马林固定石蜡包埋组织样本以拓展对肿瘤微环境的理解

本文介绍了一种手动酪胺信号放大（TSA）多重免疫荧光（mIF）染色结合图像分析与空间分析的实验方案。该方案可用于福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）组织切片，每张切片可检测两至六种抗原，具体数量取决于实验室所配备的切片扫描仪。...

多重免疫荧光结合空间图像分析用于肿瘤微环境的临床与生物学评估

多重免疫荧光技术可在单个组织切片中实现多种抗体标记物的序贯标记，从而支持对组织结构和细胞群体的空间分析。本文介绍了一种针对衰老相关、结构及免疫标记物的多重检测工作流程，包括手动和自动化载玻片制备、迭代成像，以及利用数字病理学软件进行单细胞分析。...

多重免疫荧光检测法用于衰老标志物的空间评估 体内

了解组织芯片技术用于高通量蛋白质表达分析的方法。该技术通过将多个组织核心组装到单一石蜡块中，进行免疫组织化学染色和数字化成像，为神经科学和组织学研究提供高效、可重复的实验方案。

人类蛋白质图谱中组织微阵列的制备、免疫组织化学染色及数字化

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