人类蛋白质图谱中组织微阵列的制备、免疫组织化学染色及数字化

本实验的总体目标是采用一种高效的方法，在人类蛋白质图谱等高通量项目中，同时获取多种组织的蛋白质表达信息。该目标首先通过选择福尔马林固定、石蜡包埋组织的代表性区域来实现；随后对标记区域进行打孔，将所选组织芯排列并整合至同一个石蜡包埋块中，制成组织微阵列。

然后从组织芯片中切片并进行免疫组织化学染色。最后分析蛋白质表达模式，并将数据发布在人类蛋白质图谱上。最终，可通过组织微阵列和免疫组织化学技术获得显示蛋白质在组织和细胞中表达情况的结果。

与现有的单个组织石蜡块进行免疫组织化学相比，该技术的主要优势在于可以节省宝贵的生物材料，并且实验的可重复性更高。该技术的另一个优势是能够降低耳鼻喉科（ENT）相关成本以及实验室处理时间。接下来由我实验室的技术员 Ian Call Bay 演示如何获取标准化长度的组织芯。

标记套针。建议在石蜡块的每侧留出 2.5 至 3.0 毫米的边缘，以避免石蜡破裂，从而正确安装打孔针。松开固定打孔针的内六角螺钉，并调整打孔针的位置，使打孔针轴上的凹槽紧贴塑料 V 型块中的金属杆。

拧紧螺丝，确保金属夹片的边缘保持水平。将受体冲孔器插入左侧，供体冲孔器插入右侧。使用 XY 调节旋钮及其数字千分尺读数，沿 X 轴和 Y 轴方向移动冲孔器。

重置设备时，按下归零按钮，然后按英寸与毫米切换按钮以在英寸和毫米之间切换。当使用直径为1毫米的穿孔针配合9×8模板时，孔中心之间的间距应为2毫米。为防止将受体穿孔针推入过深而损坏穿孔针，需通过将一个空胶带盒放入夹持器中，并调节位于Z向导轨左上角的深度限位螺钉，将受体穿孔针的下限位置设置为比胶带盒底部高1毫米处。在组织切片上选定并标记出相关区域，并设计好组织芯片制备模板后，将受体蜡块放入夹持器中，并使用最小的螺丝刀拧紧固定螺丝。

避免过度拧紧螺丝，以防石蜡从包埋盒中松脱。将受体打孔针向下推入受体蜡块约五毫米，然后使用打孔针上的手柄来回旋转打孔针。随后，缓慢释放向下的压力，使弹簧将打孔针向上顶回。

使用该工具清空穿孔针并丢弃石蜡芯。然后转动转塔，切换至供体穿孔针。接着，将带有供体组织块的供体块桥放置在受体块架上方。

使用相应的苏木精和伊红染色切片，其中已标记出目标区域，以定位待取样的组织。用左手手动固定供体蜡块，右手推动穿孔针。切勿推动针芯。深度限位器无法在供体蜡块的适当位置阻止穿孔针的运动，因此当针芯上出现第二个标记时，应立即停止推动。

缓慢旋转打孔器手柄一周。在仍握住供体组织块及其支撑桥时，松开向下的压力。取下支撑桥和供体组织块。

确保供体打孔针与先前制备的孔对齐。使用调节螺钉调整打孔针的位置。如果供体打孔针与受体包埋块中的孔未对齐，请小心地将打孔针向下推动，直至其尖端到达受体包埋块中孔的顶部。

保持此位置的同时，使用套管针将组织芯排入孔中。组织芯的表面应与包埋块表面齐平。将转塔移回受体打孔针位置。

使用 XY 调节旋钮移动到下一个位置，并通过从受体块中 punching 一个样本重复此过程，直至完成整个阵列。要取下受体块，需松开固定夹上的螺丝。将受体块正面朝下放置在置于合适支架上的玻片上，并在 42 °C 下烘烤 40 分钟。

从烘箱中取出载玻片和包埋块，用载玻片轻轻刮擦包埋块表面以使其平整。将带有载玻片的包埋块置于冷却板上冷却10分钟。从包埋块上取下载玻片。

组织块现已制备完成，可进行切片。切片后，使用针对目标蛋白的抗体对组织微阵列进行染色并数字化。通过访问网站 www.proteinatlas.org，在人类蛋白图谱中搜索该蛋白。

输入感兴趣的蛋白质的集合 ID、UniProt 登录号或 HGNC 名称，例如 insulin。点击感兴趣的蛋白质，然后向下滚动至正常组织和器官摘要。该概览显示了胰腺中的蛋白质表达情况。

点击该标签页。将显示更多组织数据。按器官排序的正常组织视图将会呈现。

单击胰腺以查看针对同一蛋白质的三种抗体的免疫组化（IHC）结果。单击图像可查看胰腺的高分辨率图像。本图展示了组织微阵列质量的示例：阵列排列笔直且对齐良好，行与列之间以及阵列与石蜡边缘之间留有充足的空间。而在此处，部分核心过于靠近边缘，可能导致切片过程中出现问题。

此组织芯片因烘烤时间过长，且未使用正确的模板，导致结构塌陷。此处显示的是切面良好、排列整齐的直行组织切片，经苏木精、曙红染色。刀片质量不佳或不洁净可能导致切片出现此处所示的裂隙，或类似这样的压缩切片。

淋巴结中的生发中心细胞显示出经优化滴定的抗体，从而产生特异性的胞质染色，且无背景染色，如此处所示。当一抗浓度过低，或靶蛋白在免疫染色组织中不存在时，会出现阴性或弱染色结果。本组织切片因一抗浓度过高而出现过度染色。

深色会导致溢出、交叉反应和假阳性等问题，从而难以确定亚细胞定位。观看本视频后，您应能充分了解如何制备组织标记物阵列，以及在进行免疫组化分析蛋白质表达时如何使用该阵列。您还应能充分掌握如何浏览人类蛋白质图谱，以查询蛋白质在人体组织和细胞中的表达情况。