神经元形态的研究方法:体外 RNAi技术在胚胎小鼠大脑皮质的电穿孔
2012年5月18日
我们描述涉及的方法进行快速评估的功能基因在大脑皮层的发展，体外电质粒共表达抑制核糖核酸（RNA干扰）和绿色荧光蛋白在小鼠胚胎皮层。该协议是适合研究神经发育的各个方面，如神经，神经细胞迁移和神经元的形态，包括树突和轴突生长。
以下实验的总体目标是使用器官型切片对大脑皮层发育中的基因功能进行快速评估。这是通过将质粒、共分泌、表达和抑制 RNA 以及 A GFP 标志物引入大脑皮层来实现的。将短时间电爆发施加到大脑，使质粒 DNA 能够转染神经元祖细胞。
接下来，解剖、包埋和切片大脑以产生可以在体外进行神经元形态发生的器官型切片。通过直接观察 GFP 标记的细胞，可以搜索具有迁移或形态缺陷的皮质神经元亚群的器官型切片。嗨，欢迎来到我今天在布朗大学分子生物学系的实验室，Liza 博士和两名学生 Kat Zer 和 Mark Seba 将演示离体电穿孔技术和器官型切片培养，这是神经发育研究中非常有用的技术。
这种方法可以帮助回答神经发育各个方面的关键问题，包括神经发生、神经元迁移和神经元形态发生。因为这种分析是在接近 IBU 环境中完成的，所以它为为未知功能的基因生成转基因或敲除动物提供了一种低成本和快速的替代方案。最后，与体内电作技术相比，这些体内电作实验的成功不取决于熟练的手术、技能发展，可以通过更短的培训时间和技能进行。
对怀孕的雌性小鼠实施安乐死后，将胚胎解剖成冰冷、完整的 HBSS，将它们保存在各自的胎盘袋中。接下来，在冷的 HBSS 溶液中，从袋子中取出胚胎，并在注射第一块椎骨后切下其头部，使用定制的 Hamilton 注射器将头部放在培养皿顶部的一张多成型纸上。通过第三脑室注射 6 至 8 μL DNA Fast Green 混合物。
从那里，混合物将充满皮质囊泡中的两个侧脑室。对于电穿孔，使用 BTX 镊子铂电极。将正极朝向将要电穿孔的皮层一侧。
例如，电极应该在头顶 对于背侧皮层。为了获得高转染效率，请始终将 DNA 浓度调整至 1 μg/μL，并使用从 Maxi 制备物中分离的 DNA。如有必要，在电穿孔后使用无内毒素试剂盒纯化 DNA。
在解剖之前，将头部在冰上孵育至少五分钟。在进行电穿孔时，使用适量的电脉冲和电流非常重要，以避免损坏年轻的胚胎大脑。电穿孔后，组织变得非常脆弱。
非常小心地进行解剖很重要，因为皮肤和学校会拉扯皮质囊泡的脑膜，从颅骨中取出时可能会损坏皮质囊泡。五分钟后，用冷液解剖大脑。HBSS 首先在头部侧面做一个小切口，然后剥掉头部两侧的皮肤。
接下来，用细镊子轻轻地从大脑中剥下软脑膜。从颅骨中取出完整的大脑。完成后，将大脑保持在冰冷的 HBSS 中并准备包埋组织。
开始用 3% 的低熔点填充模具。阿格罗斯。将模具放在冰上，这样 agros 就会在模具底部附近凝固。首先，确保大脑保持支撑和居中。
现在用细镊子轻轻地从 HBSS 中取出一个大脑，用 kim 擦或滤纸吸收多余的缓冲液，然后将大脑置于低熔点。阿格罗斯。然后使用移液器吸头在模具内旋转大脑，以最大限度地增加 agros 和组织之间的接触。转移所有大脑后，将每个大脑放置在其模具中大致相同的方向和深度。
aros 将在大约五分钟内凝固。所以快点工作。通过在冰上再孵育 5 分钟，让 aros 完全凝固。
在安装块之前修剪多余的 aros。然后使用快速粘合的塑料粘合剂将 agros 块相互连接，堆栈中的每个大脑都应将其嗅球向上放置。连接积木后，修剪 aros 以确保每个大脑都被颤音切成薄片。
然后立即将它们浸入冰冷的 HBSS 中。要对块进行切片，请将颤音速度设置为低速，大约是最大值的一半，并将刀片振动频率设置为最高设置。然后生成 250 微米厚的冠状切片，使用弯曲的细刮刀取出切片，并用细刷或镊子将它们转移到组织孔中。
如果组织从组织中取出，则组织 agros 接触在组织培养罩中未充分形成，准备一个每孔 1.8 毫升切片培养基的六孔板，并在每个板中放置层粘连蛋白赖氨酸的器官型插入片段代码。将 500 微升切片培养基添加到器官型切片插入物的顶部。然后将最多 5 片转移到每个插入物中。
接下来，从切片顶部去除任何多余的培养基，以确保切片尽可能保持其形态并最大限度地减少细胞死亡。保持健康的液态空气界面并且切片不会漂浮在介质中，这一点很重要。最后，将切片在 37 摄氏度的加湿培养箱中孵育。
每隔一天更换膜下一半体积的培养基。切片不应漂浮在培养基上表达电穿孔构建体的神经元最早可以在电穿孔后 8 小时在所需的培养天数后可视化。固定膜中的切片以进行分析。
用温热的 PBS 洗涤每个有机典型小分子 5 分钟。总共进行 3 次 PBS 洗涤，然后在 4 摄氏度下用 4% 多聚甲醛固定组织 1 小时。固定后，可以用细胞标志物分析组织，或者简单地用钩状染色染色一小时后，在一个 XPBS 中用 3 次 10 分钟的洗涤来洗涤切片。
然后在室温下在一个 XPBS 中的 10% 山羊血清溶液中渗透切片 2 小时，轻轻摇晃。然后用钩子在室温下轻轻摇动组织染色 1 小时。在一次 XPBS 中洗涤 3 次 10 分钟，同时轻轻摇晃，去除污渍。
将磨砂载玻片放入足够深的水室中，以便在将组织放在载玻片上后对其进行沐浴。挂载切片。首先，用手术刀将膜切开。
其次，使用细镊子将最多 5 个膜结合切片转移到浸入水中的每张载玻片上。第三，去除每张载玻片上多余的水。第四，在每个脑切片上滴一滴落地式溶液。
最后，轻轻地将盖玻片放在切片上并去除任何气泡。然后，根据电穿孔的 DNA 量和胚胎阶段，将切片准备好进行显微镜检查。在电穿孔时，发现转染效率不同。
用 P 沉默器转染 8 小时后，GFP 载体细胞开始表达 GFP。在较长的培养期内，细胞会经历一系列正常的神经源性事件，包括增殖、迁移和早期神经元分化。这些切片保持其形态五天，前提是在尝试此过程时媒体空气界面得到良好维护。
从动物被安乐死的那一刻到切片被放入膜插入物的那一刻，在两小时内进行整个实验非常重要，以尽量减少此程序后的细胞死亡。可以进行其他类似向器官型裂解中添加外源因子来回答以下问题，例如，不同的生长因子或药物在各种神经发育机制中的作用是什么？
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概述
本研究提出了一种通过体外电穿孔评估大脑皮层发育过程中基因功能的方法。通过使用共表达抑制RNA和GFP的质粒，研究人员可以研究神经发育过程，如神经发生和神经元迁移。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 神经发育
- 遗传学
背景
- 大脑皮层对于各种脑功能至关重要。
- 理解基因功能对于洞察神经发育至关重要。
- 体外技术允许对神经元行为进行详细研究。
- 电穿孔是一种用于将DNA引入细胞的方法。
研究目的
- 快速评估大脑皮层发育中的基因功能。
- 探索神经发生、神经元迁移和形态发生。
- 利用类器官切片观察神经元变化。
使用的方法
- 小鼠胚胎皮层的体外电穿孔质粒。
- 应用短时电脉冲促进转染。
- 进行脑部解剖和包埋以创建类器官切片。
- 观察GFP标记的细胞以识别神经元缺陷。
主要结果
- 成功转染神经元前体细胞中的质粒。
- 识别出皮层神经元亚群缺陷。
- 展示了体外技术在神经发育中的实用性。
- 通过GFP标记视觉确认神经元形态发生。
结论
- 该方法提供了一种快速研究基因功能的方法。
- 体外电穿孔对神经发育研究有效。
- 获得的见解可以帮助理解皮层发育。
常见问题
Executive Industry Relevance
Rapid ex vivo RNAi electroporation in embryonic murine cerebral cortex enables functional interrogation of gene candidates implicated in neuronal morphogenesis and migration. This approach provides a scalable, low-cost alternative to generating transgenic or knockout models, accelerating early discovery and target validation in neurodevelopmental research. Its mosaic analysis capability supports predictive confidence in gene function assessment, informing portfolio triage and risk-adjusted advancement.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables rapid functional screening of candidate genes in a near-physiological tissue context.
- Supports biological de-risking by clarifying gene roles in neuronal morphogenesis and migration.
- Facilitates predictive confidence in target selection for neurodevelopmental disorders.
- Allows mosaic analysis to distinguish cell-autonomous effects from broader tissue responses.
Screening & Assay Development
- Prepares validated organotypic slice systems for downstream phenotypic screening workflows.
- Delivers reproducible, quantitative readouts via GFP labeling of transfected neuronal populations.
- Enables assay standardization and scalability for gene function studies.
- Supports reliable evaluation of gene knockdown effects on neuronal morphology.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant neurodevelopmental mechanisms by preserving tissue architecture.
- Provides continuity from gene discovery to preclinical validation in complex tissue environments.
- Reduces reliance on whole-animal models for initial functional assessment.
- Offers mechanistic de-risking for genes of unknown cortical function.
Pipeline & Workflow Integration
This ex vivo RNAi electroporation method fits at the interface of early discovery and lead identification, bridging in vitro gene function studies and in vivo validation. It streamlines hypothesis testing and supports rapid iteration in neurodevelopmental target pipelines.
- Discovery Biology: Enables hypothesis-driven interrogation of gene function in neuronal morphogenesis and migration.
- Screening: Provides assay-ready organotypic slices with quantitative, reproducible outputs.
- Analytics: Supports direct measurement of morphological and migratory phenotypes in GFP-labeled neurons.
- Translational Research: Maintains tissue context for alignment with disease-relevant neurodevelopmental processes.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable platform for rapid gene function assessment across multiple candidates.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in neurodevelopmental gene function studies.
- Operational Value: Delivers standardized, reproducible, and scalable workflows for gene knockdown analysis.
- Strategic Value: Accelerates go/no-go decisions and improves capital efficiency by reducing reliance on transgenic models.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of neurodevelopmental targets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in embryonic brain dissection and organotypic slice culture.
- Needs access to electroporation equipment and fluorescence microscopy for GFP detection.
- Demands careful standardization of DNA concentration and electroporation parameters for reproducibility.
- Adaptable to various gene constructs and embryonic stages, but tissue fragility and timing are critical.
- Limited to early postnatal developmental windows and may not capture long-term phenotypes.
