Name: 扩大目标，脐血细胞毒性T淋巴细胞，巨细胞病毒，EB病毒，腺病毒 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-05-07T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 18 s
Description: 了解从脐带血制备多病毒特异性细胞毒性T淋巴细胞的标准化方法。本方案通过树突状细胞和EB病毒淋巴母细胞系刺激，实现GMP合规的CTL扩增与特异性验证。

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本工作得到了丹·L·邓肯合作研究基金（C.M.B 和 E.J.S）、美国国家心肺血液研究所（US4HL081007）、白血病与淋巴瘤学会临床研究学者奖（C.M.B）以及美国国家癌症研究所（RO1 CA06150816；E.J.S）的支持。

1. 单个核细胞分离（第0天）
 <ol>
 <li>将雌性鲁尔接头的插头插入脐带血单位20%组分的出口端口，连接注射器并抽出血液。将解冻后的血液转移至含有20 mL预热RPMI的50 mL离心管中。用5 mL RPMI冲洗脐带血袋，并将冲洗液转移至同一离心管中。</li>
 <li>以400 × g离心10分钟。吸除上清液。</li>
 <li>用20 mL温热RPMI重悬细胞。将细胞层加至含15 mL Lymphoprep的50 mL离心管中。以400 × g离心40分钟。</li>
 <li>收集含有单个核细胞的界面层，并用20 mL RPMI洗涤。以450 × g离心10分钟。</li>
 <li>吸除上清液，再用20 mL RPMI洗涤。计数细胞后，以400 × g离心5分钟。</li>
 <li>吸除上清液，将细胞重悬于Cellgenix DC培养基（无血清）中，浓度为5 × 106 个单个核细胞/mL。取出1 mL用于EBV-LCL的制备，转移至15 mL离心管中。</li>
 </ol>
2. 树突状细胞的生成（从第0天开始）
 <ol>
 <li>将2 mL细胞（浓度已为5 × 106 个细胞/mL DC培养基）接种至6孔板的每个孔中，放入培养箱孵育1–2小时。</li>
 <li>孵育1–2小时后，用PBS洗涤3–4次以去除未贴壁细胞。收集未贴壁细胞并冻存。每孔加入2 mL含1000 U/mL IL-4和800 U/mL GM-CSF的DC培养基。</li>
 <li>树突状细胞（DC）诱导后第3–4天，通过每孔加入100 μL培养基补充细胞因子，使IL-4终浓度为1000 U/mL，GM-CSF终浓度为800 U/mL。</li>
 <li>第5–6天，用移液管刮取孔内细胞以收获DC。计数大细胞，以400 × g离心5分钟。吸除上清液，将DC重悬于DC培养基中，调整细胞密度为2 × 106 个细胞/mL，每孔加入0.5 mL至24孔板。</li>
 <li>使用Ad5f35pp65载体以每个细胞10个感染单位的MOI转导DC。将载体加入24孔板的各孔中，孵育细胞1.5小时。1.5小时后，每孔加入1.5 mL含以下成分的DC培养基：1000 U/mL IL-4、800 U/mL GM-CSF、10 ng/mL TNF-α、1 μg/mL PGE-1、100 ng/mL IL-6和10 ng/mL IL-1β。这些细胞因子可诱导DC成熟。</li>
</ol>
3. EBV-LCL 的制备（从第 0 天开始）
 <ol>
 <li>离心含有5 × 106个单个核细胞的离心管。加入200 μL浓缩的EBV B95.8上清液和1.8 mL含环孢素（1 μg/mL）的完全培养基（RPMI + 10% FBS + 2 mM L-谷氨酰胺）。</li>
 <li>将细胞以每孔100 μL分装至96孔板中的10个孔，每孔200 μL分装至5个孔。向仅含有100 μL细胞的孔中加入100 μL完全培养基+环孢素。其余孔中加入无菌水。</li>
 <li>每周更换LCL培养基，并在约2周后将细胞从96孔板扩增至24孔板。再过一周后转移至T25培养瓶，随后一周转移至T75培养瓶。在此阶段建议冻存LCL的分装样品。通常需要1个月时间获得足够数量的LCL。</li>
</ol>
4. CTL 启动——树突状细胞启动后第7天
 <ol>
 <li>收集DC细胞，并以30 Gy剂量照射。洗涤4次后计数。将DC细胞重悬于含人血清的T细胞培养基中（45% RPMI，45% CLICK's，10%人血清，2 mM L-谷氨酰胺），浓度为1 × 105 个DC细胞/mL。</li>
 <li>解冻步骤2.2中获得的非贴壁细胞。洗涤细胞并计数。将非贴壁细胞以2 × 106 个细胞/mL的浓度重悬于含人血清的T细胞培养基中，加入10 ng/mL IL-7和IL-12，以及5 ng/mL IL-15。每孔加入1 mL细胞悬液至24孔板中，每孔再加入1 mL DC细胞。将24孔板中未使用的孔加入无菌水填充。</li>
 <li>T细胞培养启动7天后，用含人血清的T细胞培养基对细胞进行换液和/或传代。</li>
 <li>T细胞培养启动后9–12天，将T细胞冻存，直至LCL细胞准备就绪。</li>
 <li>当LCL细胞扩增并在T75培养瓶中传代后，通过以400 × g离心5分钟收集LCL细胞。将病毒载体以每细胞100个感染单位的MOI加入细胞沉淀中，孵育1.5小时。1.5小时后，将细胞重悬于完全培养基中，浓度为5 × 105 个LCL/mL，每孔加入2 mL至24孔板中。12</li>
 <li>2天后，收集LCL细胞并以40 Gy剂量照射。洗涤4次后计数。将LCL细胞以2.5 × 105 个细胞/mL的浓度重悬于含人血清的T细胞培养基中，每孔加入1 mL至24孔板。同时，将5 × 106 个LCL细胞加入Grex40培养装置，并加入5 ng/mL IL-15。13</li>
 <li>收集T细胞，以400 × g离心5分钟，吸除上清液，将T细胞重悬于含人血清的T细胞培养基中，浓度为1 × 106 个T细胞/mL。加入5 ng/mL IL-15，每孔加入1 mL T细胞悬液（共1 × 106 个T细胞）至已置于24孔板中的LCL细胞中。在Grex40装置中，将培养基总体积补至30 mL。</li>
 <li>刺激后第3–4天，若细胞已汇合，则按1:1比例在培养板中传代，并加入含50 U/mL IL-2的新鲜培养基；若未汇合，则吸除一半培养基，更换为含50 U/mL IL-2的新鲜培养基。在Grex40装置中，吸除一半培养基，补充新鲜培养基，并加入50 U/mL IL-2。</li>
 <li>第7天重复步骤4.6的操作，但在刺激当天使用IL-2，而非IL-15。</li>
 </ol>
5. 代表性结果
符合药品生产质量管理规范（GMP）且经美国食品药品监督管理局（FDA）批准的生产工艺流程示意图见图1。该过程大约需要50天。生成病毒特异性T细胞的常规方法是扩增体内已存在的记忆T细胞；然而，脐带血中缺乏接触过病毒的T细胞，因此我们需要在体外激活初始T细胞。为此，我们使用树突状细胞以及白细胞介素IL-7、IL-12和IL-15，这些细胞因子对于诱导病毒特异性至关重要。
经过3次刺激后，细胞产量应超过100×106个。如果细胞数量不足，可进行额外的刺激，直至获得所需数量的CTL细胞。这些细胞中大多数应为CD3+，并含有CD4+和CD8+ T细胞的混合群体。NK细胞（CD3-/CD56+）比例应低于15%，CD19+ B细胞比例应低于1%（图2）。
扩增后的CTL应能识别来自CMV的pp65抗原、来自腺病毒的六邻体（hexon）和五邻体（penton），以及在EBV-LCL上表达的多种EBV抗原。在ELISPOT实验中，CTL对这些抗原刺激产生的IFN-?分泌量应高于对无关抗原的反应（图3）。
CTL 还应裂解病毒肽段致敏的靶细胞，例如 PHA 激活的淋巴细胞。在 51Cr 释放实验中，CTL 应裂解 LCL 细胞、CMVpp65 致敏的靶细胞以及腺病毒六邻体和/或五邻体致敏的靶细胞，但不应裂解致敏了无关肽段的靶细胞（图 4）。
<img src="/files/ftp_upload/3627/3627fig1.jpg" alt="显示PBMC分离、细胞因子诱导和LCL建立的DC成熟过程示意图。" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图1。"> 图1. 从脐带血中生成多病毒特异性CTL。示意图展示了从脐带血制备CTL的整个过程。首先，从经分离的脐带血单元的20%组分中分离脐带血单个核细胞。除保留5×106个细胞用于LCL生成外，其余细胞均接种于树突状细胞培养基中，培养1-2小时后收集非贴壁细胞并冻存。随后，向树突状细胞（DC）中加入含有IL-4和GM-CSF的DC培养基。经过5天培养后，DC成熟，并用携带免疫优势CMV抗原pp65的腺病毒载体进行转导。在初始刺激时，这些DC与非贴壁细胞以及细胞因子IL-7、IL-12和IL-15共同培养。在后续的刺激中，使用相同的腺病毒载体转导EBV-LCL，作为抗原呈递细胞。第二次刺激时使用IL-15，之后则使用IL-2。
<img src="/files/ftp_upload/3627/3627fig2.jpg" alt="CD3、CD4、CD8、CD19、CD56 标记物的流式细胞术散点图，显示细胞群体百分比。" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 2。"> 图 2。 所得 T 细胞的表型。图中显示被纳入淋巴细胞门的活细胞所占百分比。细胞毒性 T 淋巴细胞（CTL）为 CD3+ 且 CD4+ 或 CD8+，但主要为 CD3-/CD56- 和 CD19-。
<img src="/files/ftp_upload/3627/3627fig3.jpg" alt="柱状图显示每10^5个CTL中的IFN-γ斑点数；CTL、IE-1、Ad Hexon、CMV pp65、EBV LCL的免疫应答检测结果。" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图3。"> 图3。 T细胞功能。通过IFN-γ ELISPOT检测T细胞特异性。T细胞用覆盖六邻体（hexon）、五邻体（penton）、pp65以及无关抗原IE-1全长蛋白的重叠肽段进行刺激。CTL alone表示仅含培养基。自体LCL经照射后以每孔1×105个细胞加入。图中显示的是三复孔的平均斑点形成细胞数。
<img src="/files/ftp_upload/3627/3627fig4.jpg" alt="效应细胞与靶细胞比例对细胞裂解的影响；折线图；IE-1、Ad Hexon、CMV pp65、EBV LCL 比较。" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 4。"> 图 4. CTL 的细胞毒活性。通过51Cr 释放实验检测所获得的 CTL 裂解表达病毒抗原靶细胞的能力。将重叠肽段（覆盖整个抗原序列）刺激的51Cr 标记自体 PHA 活化淋巴母细胞，或51Cr 标记的自体 LCL 与 CTL 共同培养。培养 4 小时后，使用γ计数器测定释放的放射性。

<ol><li>Kennedy-Nasser, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparable+outcome+of+alternative+donor+and+matched+sibling+donor+hematopoietic+stem+cell+transplant+for+children+with+acute+lymphoblastic+leukemia+in+first+or+second+remission+using+alemtuzumab+in+a+myeloablative+conditioning+regimen%5BTitle%5D)+AND+%22Biol.+Blood+Marrow+Transplant%22%5BJournal%5D)">Comparable outcome of alternative donor and matched sibling donor hematopoietic stem cell transplant for children with acute lymphoblastic leukemia in first or second remission using alemtuzumab in a myeloablative conditioning regimen.</a> Biol. Blood Marrow Transplant. 14, 1245-1245 (2008).</li>
<li>Hanley, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+clinical+outcomes+using+adoptively+transferred+immune+cells+from+umbilical+cord+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotherapy%22%5BJournal%5D)">Improving clinical outcomes using adoptively transferred immune cells from umbilical cord blood.</a> Cytotherapy. 12, 713(2010).</li>
<li>Szabolcs, P., Cairo, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unrelated+umbilical+cord+blood+transplantation+and+immune+reconstitution%5BTitle%5D)+AND+%22Semin.+Hematol%22%5BJournal%5D)">Unrelated umbilical cord blood transplantation and immune reconstitution.</a> Semin. Hematol. 47, 22(2010).</li>
<li>Canto, E., Rodriguez-Sanchez, J. L., Vidal, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinctive+response+of+naive+lymphocytes+from+cord+blood+to+primary+activation+via+TCR%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Leukoc.+Biol%22%5BJournal%5D)">Distinctive response of naive lymphocytes from cord blood to primary activation via TCR.</a> J. Leukoc. Biol. 74, 998-998 (2003).</li>
<li>Leen, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monoculture-derived+T+lymphocytes+specific+for+multiple+viruses+expand+and+produce+clinically+relevant+effects+in+immunocompromised+individuals%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">Monoculture-derived T lymphocytes specific for multiple viruses expand and produce clinically relevant effects in immunocompromised individuals.</a> Nat. Med. 12, 1160-1160 (2006).</li>
<li>Riddell, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Restoration+of+viral+immunity+in+immunodeficient+humans+by+the+adoptive+transfer+of+T+cell+clones%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Restoration of viral immunity in immunodeficient humans by the adoptive transfer of T cell clones.</a> Science. 257, 238(1992).</li>
<li>O'Reilly, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adoptive+transfer+of+antigen-specific+T-cells+of+donor+type+for+immunotherapy+of+viral+infections+following+allogeneic+hematopoietic+cell+transplants%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol.+Res%22%5BJournal%5D)">Adoptive transfer of antigen-specific T-cells of donor type for immunotherapy of viral infections following allogeneic hematopoietic cell transplants.</a> Immunol. Res. 38, 237-237 (2007).</li>
<li>Peggs, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adoptive+cellular+therapy+for+early+cytomegalovirus+infection+after+allogeneic+stem-cell+transplantation+with+virus-specific+T-cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Adoptive cellular therapy for early cytomegalovirus infection after allogeneic stem-cell transplantation with virus-specific T-cell lines.</a> Lancet. 362, 1375-1375 (2003).</li>
<li>Sili, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+expansion+of+dendritic+cell-primed+polyclonal+human+cytotoxic+T-lymphocyte+lines+using+lymphoblastoid+cell+lines+for+adoptive+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunother%22%5BJournal%5D)">Large-scale expansion of dendritic cell-primed polyclonal human cytotoxic T-lymphocyte lines using lymphoblastoid cell lines for adoptive immunotherapy.</a> J. Immunother. 26, 241(2003).</li>
<li>Bollard, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Good+manufacturing+practice-grade+cytotoxic+T+lymphocytes+specific+for+latent+membrane+proteins+%28LMP%29-1+and+LMP2+for+patients+with+Epstein-Barr+virus-associated+lymphoma%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotherapy%22%5BJournal%5D)">Good manufacturing practice-grade cytotoxic T lymphocytes specific for latent membrane proteins (LMP)-1 and LMP2 for patients with Epstein-Barr virus-associated lymphoma.</a> Cytotherapy. 13, 518(2011).</li>
<li>Hanley, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functionally+active+virus-specific+T+cells+that+target+CMV%2C+adenovirus%2C+and+EBV+can+be+expanded+from+naive+T-cell+populations+in+cord+blood+and+will+target+a+range+of+viral+epitopes%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Functionally active virus-specific T cells that target CMV, adenovirus, and EBV can be expanded from naive T-cell populations in cord blood and will target a range of viral epitopes.</a> Blood. 114, 1958(1958).</li>
<li>Hanley, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expansion+of+T+cells+targeting+multiple+antigens+of+cytomegalovirus%2C+Epstein-Barr+virus+and+adenovirus+to+provide+broad+antiviral+specificity+after+stem+cell+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotherapy%22%5BJournal%5D)">Expansion of T cells targeting multiple antigens of cytomegalovirus, Epstein-Barr virus and adenovirus to provide broad antiviral specificity after stem cell transplantation.</a> Cytotherapy. , (2011).</li>
<li>Gerdemann, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+Multivirus-specific+T+Cells+to+Prevent%2Ftreat+Viral+Infections+after+Allogeneic+Hematopoietic+Stem+Cell+Transplant%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Generation of Multivirus-specific T Cells to Prevent/treat Viral Infections after Allogeneic Hematopoietic Stem Cell Transplant.</a> J. Vis. Exp. (51), e2736(2011).</li>
<li>Mori, T., Kato, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytomegalovirus+infection%2Fdisease+after+hematopoietic+stem+cell+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Hematol%22%5BJournal%5D)">Cytomegalovirus infection/disease after hematopoietic stem cell transplantation.</a> Int. J. Hematol. 91, 588(2010).</li>
<li>Einsele, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Infusion+of+cytomegalovirus+%28CMV%29-specific+T+cells+for+the+treatment+of+CMV+infection+not+responding+to+antiviral+chemotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Infusion of cytomegalovirus (CMV)-specific T cells for the treatment of CMV infection not responding to antiviral chemotherapy.</a> Blood. 99, 3916(2002).</li>
<li>Bao, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expansion+of+cytomegalovirus+pp65+and+IE-1+specific+cytotoxic+T+lymphocytes+for+cytomegalovirus-specific+immunotherapy+following+allogeneic+stem+cell+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Biol.+Blood+Marrow+Transplant%22%5BJournal%5D)">Expansion of cytomegalovirus pp65 and IE-1 specific cytotoxic T lymphocytes for cytomegalovirus-specific immunotherapy following allogeneic stem cell transplantation.</a> Biol. Blood Marrow Transplant. 14, 1156(2008).</li>
<li>Shpall, E. J., Bollard, C. M., Brunstein, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+cord+blood+transplant+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Biol.+Blood+Marrow+Transplant%22%5BJournal%5D)">Novel cord blood transplant therapies.</a> Biol. Blood Marrow Transplant. 17, Suppl 1. S39-S45 (2011).</li>
<li>Vera, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accelerated+production+of+antigen-specific+T+cells+for+preclinical+and+clinical+applications+using+gas-permeable+rapid+expansion+cultureware+%28G-Rex%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunother%22%5BJournal%5D)">Accelerated production of antigen-specific T cells for preclinical and clinical applications using gas-permeable rapid expansion cultureware (G-Rex.</a> J. Immunother. 33, 305(2010).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

目前旨在控制脐带血移植（CBT）后病毒感染的策略可能有效，但常伴随显著的毒性，费用昂贵，且无法提供针对后续感染的长期保护。事实上，某些抗病毒药物的使用可能会限制原本具有保护作用的病毒特异性T细胞的扩增。14 另一种选择是输注供体来源的病毒特异性T细胞。我们及其他研究团队已证实，这类T细胞具有良好的安全性、有效性且成本效益较高。15-17 本文中，我们证明该方法也可拓展应用于脐带血。
培养人原代细胞时，必须使用无菌技术。由于T细胞具有初始状态的特性，因此在所有需要血清的培养基中都应使用人血清。根据我们的经验，含胎牛血清（FBS）的产品会导致T细胞大量扩增，这些T细胞靶向识别由FBS衍生的蛋白质。
使用Ficoll梯度分离单个核细胞时，常常难以完全去除红细胞，因为许多红细胞含有细胞核，且不会被红细胞裂解缓冲液裂解。如果红细胞数量过多，可对产物重新进行Ficoll梯度离心。
尽管本方法目前仅限于扩增病毒特异性T细胞——即巨细胞病毒（C...

<table><tbody><tr><td>RPMI 1640</td><td>Invitrogen</td><td>21870-076</td><td></td></tr><tr><td>DC 培养基</td><td>CellGenix</td><td>20801-0500</td><td></td></tr><tr><td>EHAA（点击&amp;rsquo;s 培养基)</td><td>Irvine Scientific</td><td>9195</td><td></td></tr><tr><td>人血清</td><td>杰明尼生物产品</td><td>&lt;强&gt;100-110&lt;/strong&gt;&lt;强&gt; &lt;/strong&gt;</td><td></td></tr><tr><td>透气性培养器具&lt;sup&gt;18&lt;/sup&gt; </td><td>Wilson Wolf Manufacturing</td><td>80040S</td><td></td></tr><tr><td>IL-2</td><td>奇龙（TCH 药房）</td><td></td><td></td></tr><tr><td>IL-12</td><td>美国国家癌症研究所</td><td></td><td></td></tr><tr><td>IL-15</td><td>CellGenix</td><td>1013-050</td><td></td></tr><tr><td>IL-7</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>AFL207</td><td></td></tr><tr><td>IL-1β</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>AFL201</td><td></td></tr><tr><td>IL-6</td><td>CellGenix</td><td>1004-050</td><td></td></tr><tr><td>GM-CSF</td><td>TCH 药房</td><td></td><td></td></tr><tr><td>IL-4</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.rndsystems.com/pdf/AFL204.pdf&quot; 目标=&quot;_blank&quot;&gt;AFL204&lt;/a&gt;</td><td></td></tr><tr><td>TNF-α</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>AFL210</td><td></td></tr><tr><td>Ad5f35pp65</td><td>BCM CAGT 载体生产设施</td><td></td><td></td></tr><tr><td>带雌性鲁尔接头适配器的血浆转移套装</td><td>查特医疗</td><td>89-550-66j</td><td></td></tr><tr><td>Lymphoprep</td><td>Nycomed</td><td>1114550</td><td></td></tr></tbody></table>

扩增靶向巨细胞病毒、eb病毒和腺病毒的脐带血细胞毒性t淋巴细胞

Expanding Cytotoxic T Lymphocytes from Umbilical Cord Blood that Target Cytomegalovirus, Epstein-Barr Virus, and Adenovirus

干细胞移植后发生的病毒感染是导致死亡的最常见原因之一，尤其是在脐带血（CB）移植（CBT）后，因为脐带血中不含有足够数量的具有抗病毒经验的T细胞，无法保护受者免于感染。1-4 我们及其他研究者已证实，从血清学阳性供者体内产生的病毒特异性细胞毒性T淋巴细胞（CTL）输注给受者是安全且具有保护作用的。5-8 然而，直到最近，人们仍无法从脐带血中生成病毒特异性的T细胞，这很可能是因为脐带血中缺乏病毒特异性的记忆T细胞。
为了更好地模拟 体内 为促进初始T细胞的活化条件，我们建立了一种方法，该方法使用经携带免疫优势CMV抗原pp65的腺病毒载体（Ad5f35pp65）转导的脐带血来源的树突状细胞（DC），从而引导T细胞特异性靶向CMV和腺病毒。9 在启动阶段，我们使用这些成熟的树突状细胞以及脐带血来源的T细胞，并在细胞因子IL-7、IL-12和IL-15存在的情况下进行培养。10 在第二次刺激时，我们使用表达潜伏期和裂解期EBV抗原的EBV转化B细胞（EBV-LCL）。第二次刺激时，采用经Ad5f35pp65转导的EBV-LCL在IL-15存在下刺激T细胞。后续刺激则使用经Ad5f35pp65转导的EBV-LCL和IL-2。 
从50×106个脐带血单个核细胞出发，我们能够扩增出超过150×106个病毒特异性T细胞，这些细胞可在抗原刺激下裂解抗原致敏的靶细胞并释放细胞因子11。这些细胞按照符合GMP标准的工艺制备，仅使用了一份经分离的脐带血单位的20%组分，并已成功转化用于临床应用。

本文描述了首个符合药品生产质量管理规范（GMP）的从脐带血中制备病毒特异性细胞毒性T淋巴细胞（CTL）的方法，脐带血是主要含有初始T细胞的来源。

扩增靶向巨细胞病毒、EB病毒和腺病毒的脐带血细胞毒性T淋巴细胞

干细胞移植后的病毒感染是导致死亡的最常见原因之一，尤其是在脐带血（CB）移植（CBT）后……

本实验的总体目标是生成可识别多种病毒抗原的脐带血来源的细胞毒性T淋巴细胞（CTL）。首先从脐带血单元的20%组分中分离脐带血单个核细胞，以完成第一步。第二步是利用这些单个核细胞生成树突状细胞、EB病毒淋巴母细胞样细胞系（EBV-LCL）以及病毒特异性的CTL。含有T细胞的单个核细胞经由转导了A五F 35 PP 65载体的细胞进行刺激。最后一步是确认多病毒特异性CTL的特异性，并将CTL冻存。最终，可通过Elie SPA分析和细胞毒性实验评估CTL对至少一种病毒抗原扩增的特异性。通常，初次接触该方法的研究人员会遇到困难，因为20%组分中可用的核心血液体积非常小，这意味着可用于操作的细胞数量极少。该操作过程也相当复杂，需要从这些有限的细胞数量中诱导生成至少三种不同的细胞类型。我们最初产生这一方法的想法，是在分析一项临床试验数据之后，该试验中我们为骨髓移植后的患者制备了多病毒特异性T细胞。在该研究中，我们发现T细胞不仅对这些患者是安全的，而且具有显著疗效，能够预防和治疗病毒感染。然而，最需要此类疗法的患者群体是脐带血移植受者，而对于这些患者，我们无法回访供体以获取血液来制备T细胞。因此，我们必须开发一种新策略，利用脐带血中那20%不用于移植过程的组分，从中生成针对多种病毒的特异性T细胞。首先，将20毫升RPMI加入50毫升离心管中并预热，同时解冻脐带血的20%组分。然后，将雌性鲁尔接头的插针插入20%组分的出口端口，并连接一个注射器。接着，抽出血液并将其转移至已准备好的离心管中。用 5 毫升 RPMI 冲洗脐血袋，然后将洗涤液转移至同一试管中。现在将细胞在室温下以 400 × g 离心 10 分钟，吸除上清后，将细胞重悬于 20 毫升预温的 RPMI 中。将 15 毫升淋巴细胞分离液转移至 50 毫升离心管中，将重悬的细胞液小心铺加在其液面上方，在 400 × g 条件下离心 40 分钟以分离细胞。收集界面层细胞。随后，将单个核细胞在20毫升RPMI中洗涤，450 ×g、4°C离心10分钟，吸去上清液；将细胞沉淀重悬于20毫升RPMI中，计数细胞。再次以400 ×g离心5分钟，吸去上清液后，将细胞重悬于无血清CellGenix树突状细胞培养基中，浓度为每毫升5×10⁶个单个核细胞。最后，将1毫升细胞悬液转移至15毫升锥形管中用于EBV-LCL的制备；将刚制备的单个核细胞以每孔2毫升接种于6孔板中，于37°C孵育1至2小时。用 PBS 洗去未贴壁的细胞，重复 3 到 4 次，每次将悬浮细胞收集至 50 毫升离心管中。然后以每分钟 1 摄氏度的受控速率冷冻收集的细胞，并在 -80 摄氏度冰箱中过夜保存。次日，将细胞转移至液氮中储存，直至树突状细胞（DC）准备好使用。现在向6孔板的每个孔中加入2毫升树突状细胞培养基，培养基中需添加IL-4和G-M-CS-F。在树突状细胞

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Research

科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

扩大目标，脐血细胞毒性T淋巴细胞，巨细胞病毒，EB病毒，腺病毒

一种快速、简便且经济高效的方案，用于制备供体来源的多病毒特异性细胞毒性T淋巴细胞（rCTL），以输注给存在CMV、Adv或EBV感染风险的异基因造血干细胞移植（HSCT）受者。该制备工艺符合GMP标准，有助于推动T细胞免疫治疗在专科中心以外的更广泛应用。...

多病毒特异性T细胞的制备用于预防和治疗异基因造血干细胞移植后病毒感染

介绍了一种新的无需树突状细胞的抗原特异性T细胞诱导与扩增方法。基于HLA...

基于HLA-Ig的人工抗原呈递细胞用于高效 离体 人类CTL的扩增

该视频展示了一项利用人诱导性多能干细胞（iPSC）来源的CD8+...

利用病毒抗原特异性T细胞抑制乙型肝炎病毒复制

CD4+调节性T细胞是强大的免疫调节因子，在免疫稳态中发挥重要作用。由于外周血中这类细胞数量稀少，使其功能研究具有挑战性，特别是在HIV-1感染的背景下。本文介绍一种从HIV-1感染者外周血中分离并扩增功能性CD4+...

从HIV-1感染者体内扩增调节性T细胞的新工具

新型功能性检测方法，如γ干扰素（IFN-γ）ELISpot，可在单细胞水平检测细胞因子的产生，同时对T细胞应答进行定量和定性表征，可用于评估针对水痘-带状疱疹病毒（VZV）的细胞介导免疫应答。...

开发干扰素-γ ELISpot检测法评估脐带血移植后水痘-带状疱疹病毒特异性细胞免疫反应

本方案的目的是利用一种台式、自动化、第二代细胞富集装置，制备针对病原体的临床级T细胞。该装置采用封闭式细胞因子捕获系统，无需专业人员操作，也无需使用GMP设施。所生成的巨细胞病毒pp65特异性T细胞可直接用于患者治疗。...

使用细胞因子捕获系统实现巨细胞病毒特异性T细胞的自动化富集及其临床应用

本文展示了如何通过密度梯度离心法从人抗凝全血中分离外周血单个核细胞，再利用磁珠分选技术从中分离单核细胞。经过5天的培养后，人单核细胞可分化为未成熟树突状细胞，可用于非临床实验操作。...

从全血中生成人单核细胞来源的树突状细胞

本文介绍了一种标准免疫学技术（CFSE标记的OT-I增殖）的应用，旨在快速监测佐剂介导的细胞毒性T淋巴细胞（CTL）在体内的生成。in...

快速 体内 评估佐剂在疫苗开发中诱导细胞毒性T淋巴细胞的能力

本文介绍了一种通过过继性细胞转移（ACT）将干细胞来源的病毒抗原（Ag）特异性T淋巴细胞移植到小鼠体内，从而有效抑制乙型肝炎病毒（HBV）复制的实验方案。该方法可进一步优化，用于HBV感染的潜在ACT免疫治疗研究。...

干细胞来源的病毒抗原特异性T淋巴细胞抑制小鼠中乙型肝炎病毒复制

我们概述了一项为期9天的实验方案，用于转导并扩增恒河猴外周血单个核细胞，可获得数量充足、目的基因共表达效果优良的细胞，适用于细胞疗效输注研究。...

九天内实现原代T细胞的转导与扩增并维持中央记忆表型

本文介绍了一种用于扩增伽马-德尔塔（γδ）T细胞药物产品的实验方案。通过离心淘析法分离淋巴细胞，并使用唑来膦酸和白细胞介素-2富集γδ T细胞。采用临床级磁性分离装置去除αβ T细胞。将富集的γδ...

从单采人类产品中扩增与富集γδ（gamma-delta）T细胞

了解从脐带血制备多病毒特异性细胞毒性T淋巴细胞的标准化方法。本方案通过树突状细胞和EB病毒淋巴母细胞系刺激，实现GMP合规的CTL扩增与特异性验证。

扩增靶向巨细胞病毒、EB病毒和腺病毒的脐带血细胞毒性T淋巴细胞

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