Name: 在检测DNA损伤的体外半人工分子机器，其使用的大会 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-01-11T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 56 s
Description: 学习利用牛痘病毒拓扑异构酶组装双标记DNA损伤传感器，用于检测组织切片中的平末端DNA断裂。该方法通过荧光标记实现DNA损伤的可视化，为癌症研究和DNA修复机制研究提供新工具。

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本研究获得了美国国立神经疾病与卒中研究所、美国国立卫生研究院（V.V.D.）的R01NS062842资助，以及通过美国复苏与再投资法案（ARRA）获得的美国国立神经疾病与卒中研究所、美国国立卫生研究院R21 NS064403资助（V.V.D.），同时还获得了美国国立生物医学成像与生物工程研究所、美国国立卫生研究院R21 EB006301的资助（V.V.D.）。

应首先制备基于分子机器检测的组织切片，因为其制备所需时间长于分子装置的组装。该构建方法适用于由多聚甲醛固定、石蜡包埋的组织块切取的5-6μm厚切片。建议使用对切片附着效果良好的载玻片品牌，例如ProbeOn Plus带电且预清洁载玻片（Fisher Scientific）或类似产品。我们建议初次实验时采用DNA损伤模式明确且同时含有DNase I型和DNase II型断裂的组织，例如经地塞米松处理的凋亡大鼠胸腺13,14。
1. 切片制备
<ol>
	<li>将切片置于载玻片架中，于二甲苯中脱蜡15分钟，随后转移至新鲜的二甲苯溶液中再处理5分钟。</li>
	<li>通过梯度乙醇溶液进行水化：96%乙醇，2次×5分钟；80%乙醇，5分钟；蒸馏水，2次×5分钟。</li>
	<li>用蛋白酶K消化切片。每张切片使用100μL浓度为50μg/mL的蛋白酶K溶液。在湿盒中室温（23°C）孵育15分钟。孵育时间可能需根据组织类型进行调整，硬组织可能需要更长的消化时间，通常使用15–25分钟。消化不足可能导致信号减弱，而过度消化则会导致信号消失及切片破坏。</li>
	<li>用蒸馏水冲洗2次，每次10分钟。</li>
	<li>每张切片加入100 μL的2% BSA溶液进行预封闭，室温（23°C）孵育15分钟。在此期间组装分子机器。</li>
</ol>
2. 分子机器的组装
所有试剂的用量均按25 μL的总体积计算，足以用于一个平均尺寸组织切片（10×10 mm）的单次检测。可根据需要按比例放大体积。
<ol>
	<li>按以下顺序在小型塑料管中混合：</li>
</ol>
<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>
			<ol>
				<li>双蒸水；</li>
				<li>15% 聚乙二醇-8000；</li>
				<li>66 mM Tris HCl（pH 7.5）、5 mM MgCl2、0.1 mM 二硫赤藓醇、1 mM ATP 的溶液（即常规 T4 DNA 连接酶缓冲液）；</li>
				<li>70 pmol 寡核苷酸 1；</li>
				<li>215 pmol（1.76–7.1 μg）VACC TOPO；</li>
				<li>10 单位 T4 DNA 连接酶（500 U/mL）</li>
			</ol>
			</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
<ol start="2">
	<li>通过移液轻轻混匀。该分子结构在此溶液中几乎可瞬间自发组装，并可在室温（23°C）下立即使用。将温度升至37°C会阻断基于T4 DNA连接酶的标记组分。</li>
</ol>
3. 在组织切片中利用分子机器对5'OH和5'PO4 DNA断裂进行双重标记
<ol>
	<li>吸去预封闭液，加入25μL完全反应混合液，其中包含70 pmol寡核苷酸1、53–215 pmol（1.76–7.1 μg）VACC TOPO以及10单位T4 DNA连接酶（500 U/mL），溶于以下溶液中：66 mM Tris HCl（pH 7.5）、5 mM MgCl2、0.1 mM二硫赤藓醇、1 mM ATP和15%聚乙二醇-8000。也可使用携带单个FITC标记的相同序列寡核苷酸（寡核苷酸2）替代，用于检测单一类型的DNA断裂。在此情况下，标记反应中应省略连接酶。此外，此时可使用50 mM Tris-HCl（pH 7.4）、15% PEG-8000溶液替代T4 DNA连接酶缓冲液。</li>
	<li>在加湿密闭容器中，以塑料盖玻片覆盖，室温（23°C）孵育1小时，避光。将温度降至16°C会降低基于连接酶的信号；温度升至37°C则完全消除基于连接酶的信号。有时反应体系中会出现连接酶的部分抑制，可能与拓扑异构酶制备物中引入的污染物有关。因此，当存在大量连接酶标记的断裂时，可能需要更长的孵育时间（2–4小时）。尽管在此阶段可同时观察到连接酶和拓扑异构酶信号，但在许多情况下，可通过重新加入不含VACC TOPO和双标记寡核苷酸、但含有发夹结构寡核苷酸（寡核苷酸3）（35 mg/mL）及T4 DNA连接酶（250 U/mL）的反应混合液进一步增强连接酶信号。如需增强信号，请进入步骤3；如需观察未经增强的反应结果，请进入步骤5。</li>
	<li>将载玻片垂直轻轻浸入盛有室温水的考普林罐中，取下盖玻片。吸去多余水分。</li>
	<li>通过加入25 μL反应混合液增强连接酶信号，该混合液不含VACC TOPO和寡核苷酸1，但包含寡核苷酸3：66 mM Tris HCl（pH 7.5）、5 mM MgCl2、0.1 mM二硫赤藓醇、1 mM ATP、15%聚乙二醇-8000、5单位T4 DNA连接酶和35 mg/mL寡核苷酸3（平末端发夹结构）。可根据较大组织切片的需要按比例增加标记溶液的总体积。在加湿密闭容器中，以塑料盖玻片覆盖，室温（23°C）孵育18小时（过夜）。</li>
	<li>将载玻片垂直轻轻浸入盛有室温水的考普林罐中，取下盖玻片。随后用蒸馏水洗涤切片3次，每次10分钟。</li>
	<li>用碳酸氢钠缓冲液漂洗。碱性溶液漂洗可增强FITC荧光，因FITC荧光具有pH敏感性，在pH低于7时显著减弱。</li>
	<li>在切片上覆盖抗荧光淬灭封片剂（含DAPI的Vectashield），加盖盖玻片，并使用荧光显微镜分析信号。具有5'OH的双链DNA断裂呈绿色荧光，具有5'PO4的断裂呈红色荧光（图2）。</li>
</ol>
4. 代表性结果
<img alt="Molecular machine DNA labeling process diagram: self-assembly, activation, DNA breaks detection." src="/files/ftp_upload/3628/3628fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 2."> 
图1。 半人工分子机器可检测两种类型的DNA损伤 原位荧光机器在VACC TOPO结合双发夹结构的32-mer时发生自组装。机器通过在识别序列3'端由拓扑异构酶介导的切割，分裂为两个检测单元，从而启动运行。由此形成一个循环过程：FITC标记单元持续与罗丹明标记单元分离并重新连接。该循环持续进行，直至遇到可检测的DNA断裂。当组织切片中存在替代性受体（即5'OH平末端DNA断裂）时，FITC部分将连接至该断裂位点，而剩余的罗丹明部分则连接至5' PO4 在T4 DNA连接酶的帮助下，检测DNA平末端断裂。因此，可同时检测两种类型的DNA断裂。
<img alt="显示细胞结构的荧光显微镜图像；比例尺 50 µm。" src="/files/ftp_upload/3628/3628fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 1。">
 
图2. 分子机器双重标记地塞米松处理胸腺组织切片中的两种DNA断裂。在发生凋亡的胸腺皮质区域，可检测到DNase I型和DNase II型的平末端DNA断裂。绿色胞质荧光（5'OH DNA断裂）标记正在消化凋亡胸腺细胞核物质的皮质巨噬细胞。该信号由VACC TOPO产生，定位于含有5'OH双链断裂DNA的吞噬溶酶体11,12。红色荧光（5'PO4断裂）标记尚未被巨噬细胞吞噬的凋亡胸腺细胞的细胞核。大量胸腺细胞同时发生凋亡，并伴随产生5'PO4双链断裂，可通过基于连接酶的标记技术可视化。这些断裂位于细胞核边缘，形成环状模式。所有细胞核通过DAPI复染（蓝色荧光）显示。

<ol><li>Meacham, G. C., Patterson, C., Zhang, W., Younger, J. M., Cyr, D. M. Nature. Cell. Biol. 3, 100-105 (2001).</li>
<li>Schuldt, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+Pol+expeditions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Dynamic Pol expeditions.</a> Nature. Cell. Biol. 4, E279-E279 (2002).</li>
<li>Urry, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+machines%3A+how+motion+and+other+functions+of+living+organisms+can+result+from+reversible+chemical+changes%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.+Int.+Ed.+Engl%22%5BJournal%5D)">Molecular machines: how motion and other functions of living organisms can result from reversible chemical changes.</a> Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 32, 819-841 (1993).</li>
<li>Schneider, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Theory+of+molecular+machines+I.+Channel+capacity+of+molecular+machines%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Theor.+Biol%22%5BJournal%5D)">Theory of molecular machines I. Channel capacity of molecular machines.</a> J. Theor. Biol. 148, 83-123 (1991).</li>
<li>McClare, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+machines%2C+Maxwell%27s+demon+and+living+organisms%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Theor.+Biol%22%5BJournal%5D)">Chemical machines, Maxwell's demon and living organisms.</a> J. Theor. Biol. 30, 1-34 (1971).</li>
<li>Spirin, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ribosome+as+a+molecular+machine%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Ribosome as a molecular machine.</a> FEBS Lett. 514, 2-10 (2002).</li>
<li>Fabbrizzi, L., Foti, F., Licchelli, M., Maccarini, P. M., Sacchi, D., Zema, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-emitting+molecular+machines%3A+pH-induced+intramolecular+motions+in+a+fluorescent+nickel%28II%29+scorpionate+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Chemistry%22%5BJournal%5D)">Light-emitting molecular machines: pH-induced intramolecular motions in a fluorescent nickel(II) scorpionate complex.</a> Chemistry. 8, 4965-4972 (2002).</li>
<li>Drexler, K. E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDrexler%2C+KE+%22Nanosystems%3A+Molecular+Machinery%2C+Manufacturing+and+Computation%22">Nanosystems: Molecular Machinery, Manufacturing and Computation</a>. , Wiley. New York. (1992).</li>
<li>Freitas, R. A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFreitas%2C+RA+%22Nanomedicine%3A+basic+capabilities%22">Nanomedicine: basic capabilities</a>. , Landes Bioscience. Austin. (1999).</li>
<li>Didenko, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+probes+using+fluorescence+resonance+energy+transfer+%28FRET%29%3A+designs+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">DNA probes using fluorescence resonance energy transfer (FRET): designs and applications.</a> BioTechniques. 31, 1106-1121 (2001).</li>
<li>Minchew, C. L., Didenko, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+probes+detecting+the+phagocytic+phase+of+apoptosis%3A+enzyme-substrate+complexes+of+topoisomerase+and+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules%22%5BJournal%5D)">Fluorescent probes detecting the phagocytic phase of apoptosis: enzyme-substrate complexes of topoisomerase and DNA.</a> Molecules. 16, 4599-4614 (2011).</li>
<li>Didenko, V. V., Minchew, C. L., Shuman, S., Baskin, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Semi-artificial+fluorescent+molecular+machine+for+DNA+damage+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Nano.+Letters%22%5BJournal%5D)">Semi-artificial fluorescent molecular machine for DNA damage detection.</a> Nano. Letters. 4, 2461-2466 (2004).</li>
<li>Didenko, V. V., Hornsby, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presence+of+double-strand+breaks+with+single-base+3%27+overhangs+in+cells+undergoing+apoptosis+but+not+necrosis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Presence of double-strand breaks with single-base 3' overhangs in cells undergoing apoptosis but not necrosis.</a> J. Cell Biol. 135, 1369-1376 (1996).</li>
<li>Didenko, V. V., Tunstead, J. R., Hornsby, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biotin-labeled+hairpin+oligonucleotides.+Probes+to+detect+double-strand+breaks+in+DNA+in+apoptotic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Biotin-labeled hairpin oligonucleotides. Probes to detect double-strand breaks in DNA in apoptotic cells.</a> Am. J. Pathol. 152, 897-902 (1998).</li>
<li>Jones, R. A. L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aJones%2C+RAL+%22Soft+Machines%3A+Nanotechnology+and+life%22">Soft Machines: Nanotechnology and life</a>. , Oxford University Press. USA. (2007).</li>
<li>Samejima, K., Earnshaw, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trashing+the+genome%3A+Role+of+nucleases+during+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Trashing the genome: Role of nucleases during apoptosis.</a> Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 6, 677-688 (2005).</li>
</ol>

无利益冲突声明。

在本视频中，我们演示如何组装和使用一种双标记DNA损伤传感器。该传感器是一种由生物分子引擎驱动的分子机器，其核心为病毒编码蛋白VACC TOPO，并与人工组件相连接。本项开发展示了一种基于生物赋能的设计方法，主张利用细胞的生物结构、构架以及实际的组成部分，用于构建无毒性的分子级装置。 12,15该方法解决了该领域内固有的两个问题 体内 纳米传感器：1. 使用传统纳米材料难以制备真正均一且可重复的纳米结构；2. 纳米探针、纳米颗粒及其他高度分散的纳米材料可能具有毒性及较高的生物反应性。 
该传感器将天然存在的分子机器与人工组分相结合，使其重新定向执行DNA损伤标记的新功能。这种整合的产物是一种针对新任务设计的半人工分子机器。尽管拓扑异构酶、聚合酶及其他酶类分子机器在生物化学研究中经常被使用，但它们通常并未与工程化组分整合为独立的分子组装体，因此在常规应用中并不作为半人工装置使用。 12. 

	本文展示了如何使用组织切片形式的传感器同时标记DNase I型和DNase II型断裂。目前尚无其他方法可用于实现此类同步双...

体外 组装半人工分子机器及其在dna损伤检测中的应用

In vitro Assembly of Semi-artificial Molecular Machine and its Use for Detection of DNA Damage

天然存在的生物分子机器存在于每一个活细胞中，并展现出多种多样的结构设计1-6。然而，人工分子机器的发展主要集中于能够实现定向运动的装置，即分子马达，以及其微型化的机械部件（如轮子、轴、悬臂等）7-9。这种设计模仿了宏观机器，尽管对于这些装置至关重要的物理特性，如惯性和动量守恒，在纳米尺度环境中并不适用10。相比之下，采用生物分子在进化过程中形成的机制、而非遵循宏观机械装置模式的替代性设计，能够更好地利用纳米世界的特有环境条件。此外，将真实的生物分子用于纳米设计，有助于降低纳米技术产品可能带来的潜在风险。本文中，我们展示了一种此类生物功能化结构的组装及其应用：一种半人工分子装置，它将天然存在的分子机器与人工组分相结合。从酶学角度来看，该结构是一种设计型荧光酶-底物复合物，被构建用于执行特定的有用功能。根据定义，这一组装体属于分子机器，因其包含一个分子机器单元12。然而，通过与工程化部分——荧光双发夹结构——的整合，该分子机器被重新定向，用于标记DNA损伤12。
我们的构建体由一条32-mer DNA和一种酶——痘苗病毒拓扑异构酶I（VACC TOPO）组装而成。该体系随后利用自身材料生成两个带有荧光标记的检测单元（图1）。其中一个单元（绿色荧光）在其3'端共价连接有VACC TOPO，另一个单元（红色荧光）则为带有末端3'OH的游离发夹结构。这些单元寿命较短，会迅速重新组装回原始构建体，并随之再次发生切割。在无DNA断裂的情况下，这两个单元以循环方式持续分离与重新连接。在存在DNA损伤的组织切片中，携带拓扑异构酶的检测单元可选择性地结合于具有5'OH的平末端DNA断裂（DNase II型断裂）。11,12，对其进行荧光标记。第二个在寡核苷酸切割后形成的无酶发夹结构，将连接至一个5'PO4 钝端断裂（DNase I型断裂）11,12，如果溶液中存在T4 DNA连接酶 13,14 当T4 DNA连接酶被添加到组织切片或含有5'磷酸基团DNA的溶液中时4 钝端断裂，连接酶与5'PO反应4 DNA末端形成半稳定的酶-DNA复合物。平末端的发夹结构将与这些复合物相互作用，释放连接酶并将发夹共价连接至DNA，从而标记5'PO4 平末端DNA断裂
这一进展展示了一种设计分子机器的新颖实用方法，并为检测固定细胞和组织中的细胞凋亡与DNA损伤提供了一种有用的传感器。

我们展示了由拓扑异构酶蛋白驱动的分子级装置的组装与应用。该构建体是一种生物分子传感器，通过将两种不同的荧光染料连接到组织切片中两类主要DNA断裂的末端，实现对其标记。

体外 组装半人工分子机器及其在DNA损伤检测中的应用

天然存在的生物分子机器存在于每一个活细胞中，并展现出多种多样的结构设计1-6。然而，人工分子机器的开发……

本实验的总体目标是演示如何组装和使用一种双标记DNA损伤传感器，该传感器可对组织切片中两种主要类型的DNA断裂进行标记。该传感器由一条30端肿瘤DNA寡核苷酸组成，该寡核苷酸同时标记有ZI和Rumine，并与一种酶——痘苗病毒拓扑异构酶I（vaccinia topo isomerase I，简称vac topo）——自组装而成。当VAC topo结合到30端肿瘤时，机器开始运作：拓扑异构酶在识别序列的3'端切割寡核苷酸，产生一个被fitzy标记且激活的vac topo单元，以及一个带有胺基标记的游离发夹结构。由于具有末端三磷酸羟基，这些单元的寿命较短，会迅速重新组装回原始结构，随后被切割。在没有额外分子外DNA断裂的情况下，这两个单元会以循环方式持续分离并重新结合。当将该分子传感器应用于存在DNA损伤的组织切片时，带有Fitz标记的检测单元会选择性地结合到具有五磷酸羟基的平末端DNA断裂处。R domine 标记的检测单元将连接至一个带有五端磷酸基的平末端断裂。如果存在 T4 DNA 连接酶，则可通过荧光显微镜观察到结果，从而显示细胞内 DNA 单链断裂和双链断裂的存在及分布情况。该技术相较于现有的 HESIs 检测方法（如 TUNEL 法）主要优势在于其更高的特异性，并可通过标记凋亡过程中的自噬相和吞噬相，提供额外的信息。从纳米技术的角度来看，该传感器体现了一种基于生物的方法，即利用真实的生物结构和构型来构建无毒的分子级装置。通常，初次接触该方法的研究人员可能会遇到困难，因为其实验成功依赖于使用高活性的Toro SOM制备物，并正确处理切片以避免蛋白酶K过度消化。该实验所用的组织切片应在分子装置组装之前制备完成，切片厚度为5至6微米，由多聚甲醛固定的组织切取而成。建议使用固定石蜡包埋的组织块。将带有组织切片的载玻片放入载玻片架中，用二甲苯脱蜡15分钟。15分钟后，转移至新鲜的二甲苯溶液中再脱蜡5分钟。通过将切片依次浸入梯度乙醇溶液中进行复水。先在96%乙醇中处理两次，每次五分钟；然后在80%乙醇中处理五分钟，最后用清水冲洗。每次五分钟，共两次。复水后，用蛋白酶K进行消化。每张切片加入100微升浓度为50微克/毫升的溶液，在湿盒中室温孵育15分钟。根据组织类型不同，消化时间可能需要调整，但需注意避免过度消化，否则会导致信号消失及切片结构破坏。将载玻片用蒸馏水冲洗两次，每次10分钟。加入2% BSA进行封闭，于湿润孵育盒中室温孵育15分钟。在此期间，按照本视频接下来的演示组装分子机器。组装分子机器的所有试剂按总体积25微升进行配制，足以用于一个平均大小组织切片的单次检测。可根据需要在小型塑料管中按比例放大体积。按以下顺序使用蒸馏水配制各试剂。将15%聚乙二醇8,000、T4 DNA连接酶缓冲液、双标记寡核苷酸痘苗病毒拓扑异构酶1和T4 DNA连接酶通过移液轻轻

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在检测DNA损伤的体外半人工分子机器，其使用的大会

电子能谱成像能够在纳米级分辨率下对核酸与蛋白质进行成像并加以区分。该技术可与miniSOG系统结合使用，后者能够在透射电子显微镜样品中特异性地标记目标蛋白。本文以双链断裂修复灶为例，说明这些技术的应用。...

miniSOG标记的DNA修复蛋白与电子光谱成像（ESI）联合可视化

本文介绍了一种在液体处理机器人上使用模块化克隆DNA组装方法实现模块化DNA“元件”组装的自动化工作流程。该方案采用一种直观的软件工具，用于生成组合式DNA元件文库的液体处理工作站移液清单，并通过两个液体处理平台进行了演示。...

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通过免疫荧光显微镜表征瞬时性和持久性DNA双链断裂中的DNA修复过程

采用高分辨率基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF）结合单核苷酸延伸策略，建立了一种无需标记和放射性同位素的DNA聚合酶校对及DNA修复检测方法。该检测方法在检测长度短于9个核苷酸的校对和修复片段时，表现出高度特异性、操作简便、快速且易于实施的特点。...

使用单核苷酸延伸与基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱分析进行校对与DNA修复检测

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该方法有助于分析纳米颗粒存在下DNA复制动态的变化。可根据感兴趣材料的细胞毒性水平选择不同的方法。此外，还提供了图像分析的描述，以辅助进行DNA纤维分析。...

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基于DNAzyme 10-23的核酸识别纳米机器

我们报道了一种混合的群体与单分子检测方法，可直接成像并定量荧光标记的、完全重建的Cdc45/Mcm2-7/GINS（CMG）解旋酶在由光镊固定的线性DNA分子上的运动。...

杂合组装与单分子检测技术用于成像完全重建的CMG的运动

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