体外 组装半人工分子机器及其在DNA损伤检测中的应用

本实验的总体目标是演示如何组装和使用一种双标记DNA损伤传感器，该传感器可对组织切片中两种主要类型的DNA断裂进行标记。该传感器由一条30端肿瘤DNA寡核苷酸组成，该寡核苷酸同时标记有ZI和Rumine，并与一种酶——痘苗病毒拓扑异构酶I（vaccinia topo isomerase I，简称vac topo）——自组装而成。当VAC topo结合到30端肿瘤时，机器开始运作：拓扑异构酶在识别序列的3'端切割寡核苷酸，产生一个被fitzy标记且激活的vac topo单元，以及一个带有胺基标记的游离发夹结构。

由于具有末端三磷酸羟基，这些单元的寿命较短，会迅速重新组装回原始结构，随后被切割。在没有额外分子外DNA断裂的情况下，这两个单元会以循环方式持续分离并重新结合。当将该分子传感器应用于存在DNA损伤的组织切片时，带有Fitz标记的检测单元会选择性地结合到具有五磷酸羟基的平末端DNA断裂处。

R domine 标记的检测单元将连接至一个带有五端磷酸基的平末端断裂。如果存在 T4 DNA 连接酶，则可通过荧光显微镜观察到结果，从而显示细胞内 DNA 单链断裂和双链断裂的存在及分布情况。该技术相较于现有的 HESIs 检测方法（如 TUNEL 法）主要优势在于其更高的特异性，并可通过标记凋亡过程中的自噬相和吞噬相，提供额外的信息。

从纳米技术的角度来看，该传感器体现了一种基于生物的方法，即利用真实的生物结构和构型来构建无毒的分子级装置。通常，初次接触该方法的研究人员可能会遇到困难，因为其实验成功依赖于使用高活性的Toro SOM制备物，并正确处理切片以避免蛋白酶K过度消化。该实验所用的组织切片应在分子装置组装之前制备完成，切片厚度为5至6微米，由多聚甲醛固定的组织切取而成。

建议使用固定石蜡包埋的组织块。将带有组织切片的载玻片放入载玻片架中，用二甲苯脱蜡15分钟。15分钟后，转移至新鲜的二甲苯溶液中再脱蜡5分钟。

通过将切片依次浸入梯度乙醇溶液中进行复水。先在96%乙醇中处理两次，每次五分钟；然后在80%乙醇中处理五分钟，最后用清水冲洗。

每次五分钟，共两次。复水后，用蛋白酶K进行消化。每张切片加入100微升浓度为50微克/毫升的溶液，在湿盒中室温孵育15分钟。根据组织类型不同，消化时间可能需要调整，但需注意避免过度消化，否则会导致信号消失及切片结构破坏。

将载玻片用蒸馏水冲洗两次，每次10分钟。加入2% BSA进行封闭，于湿润孵育盒中室温孵育15分钟。在此期间，按照本视频接下来的演示组装分子机器。

组装分子机器的所有试剂按总体积25微升进行配制，足以用于一个平均大小组织切片的单次检测。可根据需要在小型塑料管中按比例放大体积。按以下顺序使用蒸馏水配制各试剂。

将15%聚乙二醇8,000、T4 DNA连接酶缓冲液、双标记寡核苷酸痘苗病毒拓扑异构酶1和T4 DNA连接酶通过移液轻轻混合。该分子结构在此溶液中几乎会立即自组装，并可在室温下立即使用。开始进行DNA断裂标记实验时，从载玻片上吸除预封闭溶液。

将25微升完整反应混合液加至每个切片上。在切片上覆盖塑料盖玻片，并将载玻片放入湿化 chamber 中。用铝箔包裹 chamber 以避光，于室温孵育一小时。

尽管在孵育一小时后可同时观察到连接酶和拓扑异构酶的信号，但在许多情况下，连接酶信号还可进一步增强。为增强信号，重新加入反应混合物，其中不含vac topo和寡核苷酸一，但含有寡核苷酸三和T4 DNA连接酶，将塑料盖玻片覆盖于切片上，置于湿盒中，在室温下孵育18小时。次日在室温条件下，将载玻片垂直轻轻浸入盛有室温水的染色缸中，以去除盖玻片。

然后用蒸馏水洗涤切片，每次10分钟，共洗涤三次。用碳酸氢钠缓冲液冲洗切片。此碱性溶液冲洗可增强fitzy荧光，该荧光具有pH敏感性，在pH低于7时会显著减弱。

最后，用含有DPI的防褪色溶液覆盖切片，该溶液用于计数并染色细胞核，并加盖盖玻片。切片现已准备好进行荧光显微镜观察。本图显示的是经地塞米松处理的胸腺组织切片，其中分子装置检测到DNA断裂类型一和类型二的平末端DNA断裂，这些断裂位于正在发生凋亡的胸腺皮质区域；绿色的细胞质荧光指示DNA类型二断裂，马氏皮质巨噬细胞正在消化凋亡胸腺细胞的核物质。

该信号由 vac topo 产生，并定位于含有五端羟基 DNA 的 FGA 溶酶体。双链断裂的红色荧光指示 DNA 的一种断裂类型，标记未被巨噬细胞吞噬的凋亡胸腺细胞的细胞核。大量胸腺细胞同时发生凋亡。

伴随由基于连接酶的标记所显示的5'磷酸双链断裂的产生，这些断裂位于细胞核边缘并形成环状模式。所有细胞核均通过dpi复染显示为蓝色。

在进行该操作时，重要的是要始终注意，切勿让切片在添加不同溶液的间隔过程中变干。此外，在加入切片前，应将所有酶制剂置于冰上保存，并在标记反应完成后避免荧光探针暴露于光照下。该技术实现了对异型细胞解体全过程的可视化观察。

这种传感器本身即是纳米颗粒、探针和机器设计中绿色纳米技术方法的一个范例。该方法将人工组分与天然存在的分子机器部件相结合，旨在消除这些高度分散的纳米材料的毒性和不良生物反应性。