使用串联亲和纯化鉴定蛋白质相互作用伙伴

本实验的总体目标是采用一种称为串联亲和纯化的方法来分离蛋白质的结合伴侣。大家好，我是来自伦敦帝国理工学院病毒学系的dLAN Bailey。在我们的实验室中，我们致力于研究病毒家族不同成员与宿主之间的相互作用。

鉴定与细胞内其他蛋白或病毒蛋白相互作用的蛋白质，是研究病毒感染过程中病毒与宿主之间相互作用关系的良好起点。在本视频中，我将介绍我们实验室常用的一种方法——串联亲和纯化（tandem affinity purification，TAP）标记技术。本研究中使用的TAP标签是一种N端标签，由两个蛋白G单元和一个链霉亲和素结合肽组成。

这些由TEV蛋白酶切割序列分隔，该序列可实现对诱饵蛋白的特异性洗脱。在此示例中，小鼠的EIF4E位于该融合构建体的C末端。TAP标签技术的实验流程共分为六个步骤。

转染并建立细胞系后，诱导细胞表达标签化的诱饵蛋白，然后将细胞裂解于温和的裂解缓冲液中。通过两个亲和纯化步骤和两种特异性溶液，纯化诱饵蛋白及其潜在的相互作用蛋白，从而生成细胞系。应将编码P-met4表达载体转染至HEC 293细胞中。

用含100微克/毫升潮霉素B的培养基筛选带有TAP标签的诱饵蛋白细胞。由于质粒以附加体形式维持，无需分离特定克隆。取10个汇合的细胞培养瓶，加入10微摩尔氯化镉处理16小时以诱导表达，随后用培养基刮下细胞。将悬浮细胞转移至15毫升离心管中，通过离心收集细胞沉淀。

将这些细胞用预冷的 PBS 洗涤三次，然后最终离心收集。第二步为细胞裂解：将细胞加入 5 mL 冷裂解缓冲液中，通过反复吹打进行裂解，随后在冰上静置 5 分钟。为确保裂解充分，再将细胞悬液用细口径钝头针反复抽吸，并进行冻融处理。

将所得裂解液分装至1.5 mL离心管中，通过离心去除未裂解的细胞和碎片。值得注意的是，此离心步骤后沉淀物的体积明显减小。然后将裂解上清液合并至一个15 mL Falcon管中，并通过0.45 μm滤膜过滤，以去除任何残留的碎片。

应取50微升该裂解液用于后续分析。此样品称为样品一。步骤三：与兔IgG凝胶结合。

在该实验步骤中，蛋白G标签通过兔IgG aros进行免疫沉淀。为分配aros磁珠，请剪去ape吸头的尖端，以避免损伤磁珠。

在将磁珠转移至15 mL离心管之前，轻轻旋转瓶身，使兔IgG磁珠溶液温和重悬。使用预冷的裂解缓冲液，通过低速离心洗涤磁珠三次，每次洗涤后离心以澄清磁珠。离心后，应可见兔IgG磁珠沉淀。

每一步操作后，需小心移除缓冲液，避免扰动珠子。最后一次洗涤完成后，将过滤并澄清的裂解液加入压紧的珠子中，于4°C在旋转混合仪上孵育三小时或过夜。

免疫沉淀后，离心沉淀琼脂糖珠，并移除上清液用于后续分析。如有需要，可使用细尖吸头去除试管中残留的液体。此上清液为第二步第四样本，用于TEV蛋白酶切割。

在此步骤中，将诱饵蛋白从蛋白G标签上切割下来。该步骤可实现对诱饵蛋白的特异性切割，实际上是将蛋白从兔IgG aros免疫沉淀中洗脱出来的步骤。配制TEV切割反应混合液，使用去除了末端的移液枪头将其加入到aros磁珠中，然后将该混合物转移至经硅化处理的微量离心管中，轻轻颠倒混匀使aros磁珠悬浮，随后在4°C条件下过夜孵育。取少量该TEV切割反应产物用于后续分析。

这是第三个样本。在旋转混合器上过夜孵育应能使TEV反应接近完全。第五步，结合到固定化链霉亲和素珠上。

在此步骤中，从溶液中亲和纯化 Cleve 捕获物及任何潜在的结合伴侣。首先，离心含有兔 IgG aros 珠的 TEV 切割反应液。为沉淀 aros，移除部分澄清上清液用于分析。

这是第四步。小心地将含有目标蛋白的全部剩余上清液转移至新的离心管中。再次使用精细操作。

用枪头轻轻挤压沉淀，以去除所有可能的上清液。保留兔IgG琼脂糖珠用于后续分析。此为样品五。

为防止对链霉亲和素磁珠造成损伤，取下移液枪头的末端。轻轻重悬磁珠，并将一定量转移至经硅化处理的离心管中。用 S 缓冲液洗涤链霉亲和素磁珠，通过低速离心澄清。

每次洗涤后。每次洗涤后，小心移除缓冲液。链霉亲和素珠体积微小，即使使用精细操作，也容易发生移位。

制备宠物提示。在链霉亲和素珠洗涤后，将TEV切割反应的上清液加入这些珠子中，并在4°C下使用旋转混合器孵育三小时或过夜。

孵育后，离心并收集链霉亲和素磁珠，弃去上清液。此为样品六。需要注意。

Beit 蛋白现在与管中剩余的珠粒结合。用裂解缓冲液洗涤含有诱饵蛋白的链霉亲和素珠粒。为了去除任何额外的污染蛋白，移除珠粒中剩余的洗涤液，并将珠粒置于冰上。

第六步，生物素洗脱。在此步骤中，将生物素加入链霉亲和素珠中。生物素与链霉亲和素珠的相互作用会置换诱饵蛋白，使其重新进入溶液。

将生物素溶液直接加入珠子中，颠倒混匀。在4°C下孵育反应液三小时或过夜，使用旋转混合离心机，生物素气溶胶混合物，并小心将混合物收集至新的离心管中。此即为最终的EIT，称为样品七。

剩余的链霉亲和素磁珠为样品八。由于其蛋白浓度较低，该最终洗脱液在分析前需要浓缩。可通过使用低分子量截留的离心柱，经离心并定期监测过程来实现体积的减少。

该浓缩样品可通过考马斯亮蓝染色和银染在SDS-PAGE凝胶上进行分样分析。若样品需进行质谱分析，我们建议使用预制的商用凝胶。随后可切取单独的条带，并通过质谱鉴定蛋白质。

在此情况下，诱饵为小鼠来源的E蛋白EIF。TAP系统的优势在于，您能够在特定细胞系中表达目标蛋白，且根据您感兴趣的细胞系不同，该系统还能让您以相对较低的水平表达该蛋白。您可以自行决定表达条件，同时保留所有的翻译后修饰和定位信息，因此通常能够纯化得到天然状态的蛋白复合物。