鉴定蛋白质相互作用的合作伙伴使用串联亲和纯化
February 25th, 2012
串联亲和纯化的蛋白结合合作伙伴的标识是稳健的做法。由于概念证明，这种方法的应用以及特色的翻译起始因子eIF4E共沉淀的宿主细胞因子参与翻译起始。这种方法是很容易适应任何细胞或病毒蛋白。
该程序的总体目标是使用一种称为 Tandem 亲和纯化的方法来分离蛋白质结合伴侣。大家好，我是伦敦帝国理工学院病毒学系的 dLAN Bailey。在我们的实验室中，我们研究病毒家族不同成员的病毒宿主相互作用。
鉴定与其他细胞或病毒蛋白相互作用的蛋白质是研究感染期间病毒与其宿主之间相互作用的良好起点。在本视频中，我将介绍我们在实验室中使用的一种方法，即串联和 e 纯化或穿刺标记。本研究中使用的 Tap 标签是一个 N 末端标签，由两个蛋白质 G 单元和一个链球菌 adin 结合肽组成。
这些通过 A TEV 蛋白酶切割序列分离，该序列允许特异性洗脱诱饵蛋白。在这个例子中，小鼠，EIF four E 位于该融合构建体的 C 末端。tap 标记协议是一个六步过程。
转染和生成细胞系后，诱导细胞表达 tag abate 蛋白，然后躺在温和的裂解缓冲液中。使用两个亲和纯化步骤和两种特异性溶液来纯化诱饵和任何潜在的相互作用伴侣以生成细胞系。HEC 2 93 细胞应转染编码 P met 4 表达载体。
然后用 100 μg/mil 潮霉素 B 选择带 tap 标记的诱饵蛋白细胞，由于质粒保持游离状态，因此无需分离特异性克隆。通过用 10 微摩尔氯化镉处理 16 小时诱导 10 个汇合的细胞爆发，然后刮去到培养基中。然后将悬浮的细胞转移至 15 M 管中，并通过离心使细胞沉淀。
然后用冰冷的 PBS 洗涤这些细胞 3 次，最后沉淀。第二步：将细胞裂解细胞置于 5 密耳的冷裂解缓冲液中，重复移液，然后在冰上放置 5 分钟。为确保有效裂解，然后通过窄规格钝针注射细胞并冻融。
将所得物质分配到 1.5 mil 试管中，并通过离心去除 unli 细胞和碎片。值得注意的是，在此离心步骤之后，颗粒大小显着减小。然后将裂解物上清液混合在 15 mil Falcon 管中，并通过 0.45 微米过滤器以去除任何其他碎片。
应取 50 微升等分试样的这种裂解物用于后续分析。此示例称为示例 1。第 3 步，与兔 IgG Aeros 结合。
在方案的这一阶段，蛋白 G 标签被兔 IgG aros 免疫沉淀。要分配 aros 珠子，请去除 ape tip 的末端。这有助于避免损坏珠子。
旋转瓶子，轻轻重悬兔 IgG aro 溶液，然后将 aros 取出到 15 mil 管中。使用低速离心在冷冻裂解缓冲液中洗涤 aros 3 次，以澄清每个步骤中的珠子。离心后，颗粒化的兔 IgG 珠应清晰可见。
每个步骤后，小心地去除缓冲液，不要干扰珠子。最后一次洗涤完成后，将过滤和澄清的裂解物添加到填充的微珠中，并孵育 3 小时或过夜。它更喜欢在 4 摄氏度时使用旋转混合器。
免疫沉淀后，旋转 agros 珠子并去除上清液用于后续分析。如果需要，您可以使用精细的构建尖端去除该管中的任何残留液体。该上清液是样品 2 步骤 4 TEV 蛋白酶切割。
在此步骤中，诱饵从蛋白质 G 标签上裂解。该步骤允许诱饵蛋白的特异性切割，有效地从兔 IgG aros 免疫沉淀中洗脱。准备 TEV 切割混合物，并使用猿尖端将其添加到 aros 珠中，去除其末端，将该混合物转移到硅化微量离心管中并倒置以将 aros 混合成悬浮液，然后在 4 摄氏度下孵育过夜，去除该 TEV 切割反应的 alico 用于分析。
这是示例三。在旋转混合器上孵育过夜应使 TEV 反应进展到接近完成。第 5 步，结合以固定 strept adin 珠子。
在此步骤中，Cleve 诱饵和任何潜在的结合伴侣从溶液中亲和纯化。首先，离心含有兔 IgG aros 珠的 TEV 切割反应。为了沉淀 aros，去除澄清的上清液的 OTT 进行分析。
这是示例 4。小心地将含有诱饵蛋白的所有剩余上清液取出到新试管中。同样，使用 fine。
构建 peppe 尖端以去除所有可能的上清液。保留兔 IgG aros 珠子用于后续分析。这是示例 5。
为防止损坏链球菌 adin 珠子，请从宠物尖端取下末端。轻轻重悬珠子，并将 alico 移到硅化管中。用 S 缓冲液洗涤珠子中的链球菌，通过低速离心澄清。
每次洗涤后。每次洗涤后，小心地去除缓冲液。Strept adin 珠子非常小，即使使用精细也很容易移位。
建立宠物小贴士。洗涤 strept adin 珠子后。将 TEV 裂解反应的上清液加入这些微珠中，并使用旋转混合器在 4 °C 下孵育反应 3 小时或过夜。
孵育后，离心有 strept havein 珠子并去除 sup natum。这是样本 6。值得注意的是。
Beit 蛋白现在与试管中剩余的珠子相关联。用裂解缓冲液洗涤含有诱饵蛋白的链霉亲和素珠子。要去除任何其他污染蛋白，请从磁珠中取出剩余的洗涤液，并将其置于冰上。
第 6 步，生物素洗脱。在此步骤中，将生物素添加到链霉亲和素珠中。生物素和链霉亲和素珠子之间的相互作用取代了诱饵，诱饵又回到溶液中。
将生物素溶液直接添加到珠子中并倒置混合。使用旋转混合离心机、生物素 aeros 混合物在 4 °C 下孵育反应物 3 小时或过夜，然后小心地将混合物收集到新管中。这是您的最终 EIT，称为样本 7。
其余的 strept havein 珠子是样品 8。由于其蛋白质浓度低，最终洗脱液需要在分析前进行浓缩。这是通过使用低分子量、切断离心柱、通过离心来减少体积、定期监测过程来实现的。
这种浓缩样品可以分流，并在 SDS 页面凝胶上通过 kumasi 和银染进行分析。如果要通过质谱分析样品，我们建议使用预制商业凝胶。然后可以提取单个条带，并通过质谱鉴定蛋白质。
在这种情况下，诱饵是小鼠，EIF 代表 E 蛋白。TAP 系统的优势在于，您能够在特定细胞系中表达目标蛋白，并且根据您感兴趣的细胞系，它还使您能够以相对较低的水平表达蛋白。您决定，并保留所有翻译后修饰和定位，因此您通常可以纯化天然复合物。
概览
串联亲和纯化是一种识别蛋白质结合伙伴的强大技术。该方法被应用于翻译起始因子eIF4E，以共沉淀参与翻译起始的宿主细胞因子。
关键研究组成部分
科学领域
- 病毒学
- 蛋白质相互作用研究
- 细胞生物学
背景
- 串联亲和纯化（TAP）是一种用于分离蛋白质复合物的方法。
- TAP标签由蛋白质G和一个链霉亲和素结合肽组成。
- 这种技术允许钩捕蛋白的特异性洗脱。
- 理解蛋白质相互作用对于研究病毒-宿主动态至关重要。
研究目的
- 分离和识别与翻译起始因子eIF4E相互作用的蛋白质。
- 研究感染过程中病毒和宿主蛋白之间的相互作用。
- 展示TAP方法对各种蛋白质的适应性。
使用的方法
- 用TAP标记的表达载体转染HEC 293细胞。
- 使用兔IgG和链霉亲和素珠进行细胞裂解和纯化。
- 使用TEV蛋白酶切割以特异性洗脱钩捕蛋白。
- 多次洗涤和离心步骤以确保样品的纯度。
主要结果
- 成功分离eIF4E及其相互作用的伙伴。
- 展示TAP方法在蛋白质复合物识别中的效率。
- 识别参与翻译起始的潜在宿主因子。
- 验证该方法对其他蛋白质的适应性。
结论
- 串联亲和纯化是研究蛋白质相互作用的有效方法。
- 该方法可以应用于各种细胞和病毒蛋白。
- 理解这些相互作用为病毒致病机制提供了洞见。
常见问题
Executive Industry Relevance
Identifying protein-protein interactions is a foundational step in target validation and mechanistic de-risking for biopharma discovery programs. Tandem affinity purification (TAP) enables the isolation of native protein complexes under near-physiological conditions, supporting confident target engagement and pathway mapping. This approach reduces false positives in early screening and improves predictive confidence for lead identification campaigns.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by isolating direct and indirect binding partners of bait proteins like eIF4E.
- Operational Value: Supports functional target validation through identification of known complex members such as eIF4G, 4EBP-1, eIF4A, and Poly-A binding protein.
- Predictive Value: Enhances portfolio triage by distinguishing specific interactors from background using TAP-tag alone controls.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream workflows by capturing endogenous complexes with preserved post-translational modifications.
- Operational Value: Enables assay standardization and reproducibility through defined elution steps (TEV protease and biotin) and stringent washing protocols.
- Scalability: Supports platform reuse across cell lines via episomal plasmid expression, avoiding clonal line generation.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Maintains disease relevance by studying eIF4E in cap-dependent translation initiation, a pathway dysregulated in cancer and viral infection.
- Preclinical Alignment: Connects discovery findings to mechanistic de-risking by identifying secondary interactors that inform pathway context.
- Risk-Adjusted Advancement: Informs go/no-go decisions by clarifying target mechanism and complex integrity before lead optimization.
Pipeline & Workflow Integration
TAP fits within the discovery continuum from target engagement assays to preclinical validation, particularly for targets where native complex integrity is critical for function.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by isolating eIF4E-associated complexes under inducible expression.
- Screening: Delivers assay readiness through quantitative outputs via mass spectrometry-identifiable bands following SDS-PAGE separation.
- Analytics: Enables comparative condition analysis through specific elution steps that reduce non-specific binding.
- Translational Research: Connects to biomarker alignment by identifying translation initiation factors relevant to oncogenic signaling.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable capability for multiple bait proteins due to modular TAP tag design and episomal expression system.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation, reduction of mechanistic ambiguity, and native complex preservation.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability across cell lines and bait proteins.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions, capital efficiency, and reduced late-stage biological risk through early complex characterization.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization and advancement decisions based on validated interactome data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in molecular cloning, transient transfection, and affinity purification techniques.
- Depends on access to centrifugation, rotating mixers, protease inhibitors, and mass spectrometry infrastructure.
- Necessitates cross-team standardization of tag design, induction protocols, and wash stringency.
- Involves adaptation considerations for different bait proteins, expression levels, and subcellular localization.
- Includes practical limitations such as potential tag interference and the need for optimization of induction timing and lysis conditions.
