Name: CYP2D6动物模型:如何诱导小鼠自身免疫性肝炎 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-02-03T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 3 s
Description: 了解利用腺病毒表达CYP2D6诱导小鼠自身免疫性肝炎的实验方法。该模型通过肝脏灌注和密度梯度离心分离肝淋巴细胞，结合免疫组化和胞内细胞因子染色评估肝损伤，为研究人类2型自身免疫性肝炎的慢性肝脏炎症机制及开发潜在治疗方案提供可靠平台。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

本工作由法兰克福歌德大学医院及德国研究基金会授予 U.C. 的资助项目支持。

1. 将Ad-2D6注射至眶窦静脉
<ol>
	<li>在无菌条件下，用 RPMI 将 Ad-2D6 病毒储备液稀释至浓度为 5 x 109 pfu/ml，并将 Ad-2D6 病毒溶液置于冰上。对 FVB 品系小鼠，先后进行两次 5 x 108 pfu 剂量（静脉和腹腔注射）的注射，已被证实可获得最稳定的小鼠自身免疫性肝炎模型。</li>
	<li>在麻醉舱中使用 4% 异氟烷对小鼠进行麻醉。通过轻捏后肢判断动物是否已进入麻醉状态。</li>
	<li>用手握住小鼠颈部后方，用拇指和中指绷紧眼部周围皮肤。如此操作可使眼球因邻近皮肤受牵拉而轻微突出。</li>
	<li>将针头垂直插入内眦（靠近动物鼻部的眼睑交界处），缓慢注射 100 μl Ad-2D6 病毒溶液。注意避免施加过大压力，以防损伤血管和气管。</li>
	<li>缓慢拔出针头以防止液体溢出，并闭合眼睑。</li>
	<li>若病毒溶液未从鼻腔漏出且眼球恢复至初始位置，则表明注射操作成功。</li>
	<li>静脉注射后立即进行标准腹腔注射，注入第二剂 100 μl 的 Ad-2D6 病毒溶液。</li>
</ol>
或者，也可通过尾静脉进行静脉注射。然而，经眼眶窦注射操作更为简便，并能最大限度减少病毒溶液的损失。已有研究表明，这两种技术可互换使用，且两种途径的效果相当10。
感染小鼠需监测不良反应以及明显的痛苦和疼痛迹象，例如食欲减退、体重减轻、活动能力下降、缺乏理毛行为、毛发粗糙、蜷缩姿态，以及对特定部位（即注射部位）的舔舐、啃咬、抓挠或抖动。尽管在 CYP2D6 模型中小鼠肝脏出现严重损伤，但小鼠外观健康，未表现出痛苦、疼痛或应激的迹象。尽管如此，血清转氨酶等提示严重肝功能衰竭的指标会定期检测，或作为实验内容的一部分进行测定。血清转氨酶水平 >1000 U/l 仅应作为病毒感染的直接结果出现，而不应持续处于该水平。若血清转氨酶水平持续高于 1000 U/l（严重性阈值），则需对小鼠实施安乐死。
2. 小鼠眼出血
<ol>
	<li>在麻醉室中使用4%异氟烷对小鼠进行麻醉。通过捏压后肢确认动物已处于麻醉状态。</li>
	<li>用手抓住小鼠颈背部，用拇指和中指绷紧头部周围松弛的皮肤。如此操作可使眼球因邻近眼周皮肤受到牵拉而轻微突出。</li>
	<li>将毛细管尖端置于眼的下缘或内眼角处，轻柔但稳固地沿眼球滑动至眶静脉窦。静脉毛细血管破裂后，出血会充满眶腔。</li>
	<li>轻微回撤毛细管以释放管尖，使积聚的血液被吸入管内。</li>
	<li>当采集到足够血液后，撤出毛细管并闭合眼睑。撤管后出血停止，随着眼内压恢复正常，眶内静脉复合体亦恢复原有状态。</li>
	<li>将毛细管中的血液转移至Microtainer管中，并在冰上孵育30分钟。</li>
	<li>将Microtainer管在4 °C条件下以7500 × g离心2分钟。</li>
	<li>上清液即为血清，将其转移至新管中，并于-80 °C保存。</li>
	<li>血清可用于ELISA法测定抗体滴度。使用罗氏诊断公司（德国曼海姆）的相应试纸条及Reflotron Plus分析仪（Roche Diagnostics, Mannheim, Germany），可检测反映肝损伤的指标，如血清中丙氨酸氨基转移酶（ALT/GPT）和天冬氨酸氨基转移酶（AST/GOT）的水平。</li>
</ol>
或者，也可通过尾静脉或浅表颞静脉进行采血11。
3. 小鼠肝脏灌注
备注：此步骤对于避免血液淋巴细胞污染分离的肝淋巴ocytes至关重要
<ol>
	<li>通过致死剂量的 CO2 处死小鼠，随后进行颈椎脱位。</li>
	<li>将动物仰卧固定在泡沫板上，使用 23 G 针头固定四肢。</li>
	<li>用 70 % EtOH 润湿并消毒小鼠。</li>
	<li>在距离后肢约 1 cm 处切开皮肤和肌肉层，沿动物两侧向上切至横膈膜。</li>
	<li>到达横膈膜后，可将皮肤向后翻起。</li>
	<li>从肋骨处剪离横膈膜，然后剪开下腔静脉。</li>
	<li>将胃和肠道移向一侧，暴露门静脉。</li>
	<li>在门静脉中插入连接装有冷 PBS 的 5 ml 注射器的 27 G 针头，让 PBS 缓慢冲洗肝脏中的血液。</li>
	<li>通过夹住横膈膜并将其从身体上剪下，分离肝脏。</li>
	<li>将肝脏转移至培养皿中，去除横膈膜、胆囊及任何仍与肝脏相连的其他组织。</li>
	<li>将肝脏转移至冰上装有 10 ml PBS 的 50 ml 离心管中，或包埋于 OCT 包埋剂中。</li>
</ol>
4. 肝脏淋巴细胞的分离
<ol>
	<li>配制以下储存液：
	<ul>
		<li>IV型胶原酶储存液（100 mg/ml）溶于PBS中。（分装成小份，于-20 °C保存）。</li>
		<li>DNase储存液（25 mg/ml）溶于PBS中。（分装成小份，于-20 °C保存）。</li>
		<li>胶原酶缓冲液：含0.2 mg/ml IV型胶原酶、0.02 mg/ml DNase和5% FCS的PBS溶液；每处理一个肝脏，取9.5 ml预冷的PBS，加入20 μl IV型胶原酶（100 mg/ml储存液）、8 μl DNase（25 mg/ml储存液）和500 μl热灭活FCS混合而成。</li>
		<li>35% Percoll溶液：将175 ml Percoll、20 ml 10×PBS储存液和305 ml PBS混合。</li>
		<li>RPMIcomplete = 含10%热灭活FCS、100 μ/ml青霉素、100 μg/ml链霉素和2 mM L-谷氨酰胺的RPMI培养基。</li>
	</ul>
	</li>
	<li>将灌注后的肝脏（见第3节）转移至冰上培养皿中的10 ml新鲜PBS中，用剪刀剪成小块。</li>
	<li>将组织转移至70 μm细胞筛中，用玻璃研杵或2 ml注射器的研杵压碎肝组织。缓慢加入10 ml冷胶原酶缓冲液，压过细胞筛。收集悬液，并重复过滤两次。</li>
	<li>将悬液转移至冰上新的50 ml离心管中。处理下一个肝脏。</li>
	<li>将肝细胞悬液于37 °C孵育60分钟，每15分钟轻轻混匀一次。</li>
	<li>在4 °C下以30 × g离心3分钟。</li>
	<li>将上清液转移至新管中，保留约5 mm液体覆盖在沉淀上方。</li>
	<li>在4 °C下以650 × g离心10分钟。</li>
	<li>弃去上清液，保留约3 mm液体覆盖在沉淀上方。</li>
	<li>用20 ml Percoll缓冲液重悬沉淀。</li>
	<li>在4 °C下以600 × g离心20分钟。</li>
	<li>弃去上清液，通过轻弹管壁重悬沉淀。</li>
	<li>用PBS洗涤沉淀一次。</li>
	<li>用RPMIcomplete洗涤沉淀一次。</li>
	<li>将沉淀重悬于3 ml RPMIcomplete中，取1:10稀释后进行细胞计数。</li>
	<li>将细胞以约107 个细胞/ml的浓度重悬于RPMIcomplete中，并将离心管置于冰上。</li>
</ol>
5. 胞内细胞因子染色（ICCS）
5.1 刺激：
<ol>
	<li>按所述方法将肝淋巴细胞重悬于 RPMIcomplete 中，浓度约为 107 个细胞/ml。取 100 μl（含 106 个细胞）加入未经组织培养处理的平底 96 孔板中，每孔 100 μl。</li>
	<li>加入含 2 μg/ml 布雷菲德菌素 A 的 RPMIcomplete 50 μl，随后加入含 2 μg/ml CYP2D6 刺激肽的 RPMIcomplete 50 μl（即优势 CD4 表位 CYP2D641-60 PGLGNLLHVDFQNTPYCFDQ12 或优势 CD8 表位 CYP2D6193-212 RRFEYDDPRFLRLLDLAQEG12）。用移液器吹打混匀。</li>
	<li>在 37°C 下孵育 5 小时（为最佳刺激时间，但过夜孵育亦可）。</li>
</ol>
5.2. 染色：
<ol>
	<li>配制以下储存液：
	<ul type="disc">
		<li>FACS缓冲液：含1%胎牛血清（FCS）的PBS。</li>
		<li>固定/透化缓冲液：含0.1%皂苷和4%多聚甲醛的FACS缓冲液</li>
		<li>FACS/皂苷洗涤缓冲液：含0.1%皂苷的FACS缓冲液</li>
		<li>FACS/PFA缓冲液：含1%多聚甲醛（PFA）的FACS缓冲液</li>
	</ul>
	</li>
	<li>将细胞转移至V型底96孔微孔板中，在4 °C下以460 × g离心3分钟。弃去上清液并涡旋振荡微孔板</li>
	<li>加入150 μl FACS缓冲液，在4 °C下以460 × g离心3分钟。弃去上清液并涡旋振荡微孔板。重复洗涤一次。</li>
	<li>如必要（使用二抗时），在FACS缓冲液中加入1 μg/ml αCD16/32抗体混合物（FcR阻断剂），4 °C孵育15分钟以封闭表面Fc受体，随后用150 μl染色缓冲液洗涤两次（460 × g，2分钟，4 °C）。</li>
	<li>表面分子染色：例如，在50 μl FACS缓冲液中加入10 μg/ml Anti-CD8a-FITC单克隆抗体，4 °C避光孵育30分钟。</li>
	<li>加入100 μl FACS缓冲液，在4 °C下以460 × g离心3分钟。</li>
	<li>用150 μl FACS缓冲液洗涤细胞两次（460 × g；3分钟；4 °C）。涡旋振荡微孔板。</li>
	<li>用100 μl固定/透化缓冲液在室温下固定/透化细胞10分钟。</li>
	<li>在4 °C下以460 × g离心7分钟。注意，由于固定/透化步骤会改变细胞整体密度，因此必须将离心时间延长至7分钟。涡旋振荡微孔板。</li>
	<li>用150 μl FACS/皂苷洗涤缓冲液洗涤两次（460 × g；7分钟；4 °C）。涡旋振荡微孔板。</li>
	<li>细胞内分子染色：例如，在50 μl FACS/皂苷洗涤缓冲液中加入10 μg/ml Anti-IFNγ-PE单克隆抗体，4 °C孵育30分钟。</li>
	<li>加入100 μl FACS/皂苷洗涤缓冲液，在4 °C下以460 × g离心7分钟。</li>
	<li>用150 μl FACS/皂苷洗涤缓冲液洗涤细胞两次（460 × g；7分钟；4 °C）。涡旋振荡微孔板。</li>
	<li>用FACS缓冲液洗涤细胞一次（460 × g；7分钟；4 °C）。涡旋振荡微孔板。</li>
	<li>将细胞重悬于200 μl FACS/PFA缓冲液中，转移至流式管中，避光保存于4 °C，直至通过流式细胞仪获取数据。我们通常使用FACSCanto II或FACSCalibur（BD Biosciences，Heidelberg，德国）。</li>
</ol>
6. 免疫组织化学
6.1. H&amp;用于评估肝脏常规病理的E染色：
<ol>
	<li>取肝脏组织，浸入一次性底模中的Tissue-Tek O.C.T. 包埋剂中，并在干冰上快速冷冻。</li>
	<li>使用设定温度为 -17 °C 的 Leica 冷冻切片机切割 7 μm 厚的肝组织切片，并将切片贴附于 Superfrost Plus 显微镜载玻片上。将载玻片储存于 -20 °C，待后续使用。</li>
	<li>将冷冻切片浸入预冷的乙醇中，在 -20 °C 固定 15 分钟。室温晾干 10 分钟。</li>
	<li>在蒸馏水中洗涤 2 次，每次 2 分钟，室温进行（以下步骤 6.1.5 至 6.1.13 均在室温下操作）。</li>
	<li>用 Mayer 苏木精染液染色 8 分钟。</li>
	<li>用温水（30 °C）自来水冲洗 10 分钟，期间多次更换水。</li>
	<li>用蒸馏水漂洗。</li>
	<li>用 95% 乙醇漂洗 20 秒。</li>
	<li>用伊红 G/Y 溶液复染 40 秒。</li>
	<li>用 95% 乙醇脱水 2 次，每次孵育 5 分钟。</li>
	<li>用 100% 乙醇脱水 2 次，每次孵育 5 分钟。</li>
	<li>用二甲苯透明 2 次，每次透明 5 分钟。</li>
	<li>用 Roti-Histokitt 封片剂封片。</li>
</ol>
6.2. 胶原蛋白 I 沉积的免疫组织化学染色：
<ol>
	<li>取肝脏组织，浸入一次性底模中的 OCT 包埋剂中，并在干冰上快速冷冻。</li>
	<li>使用设定为 -17 °C 的 Leica 冷冻切片机切割 7 μm 厚的肝组织切片，并将组织切片贴附于 Superfrost Plus 显微镜载玻片上。将载玻片保存在 -20 °C，待后续使用。</li>
	<li>用预冷的乙醇在 -20 °C 固定冷冻切片 15 分钟，然后室温干燥 10 分钟。</li>
	<li>在 PBS 中洗涤 2 次，每次 2 分钟，室温操作。</li>
	<li>在含有 0.3% H2O2 和 0.1% 叠氮化钠的 PBS 中孵育 10 分钟，室温操作。</li>
	<li>在 PBS 中洗涤 2 次，每次 2 分钟，室温操作。</li>
	<li>根据生产商说明书，使用亲和素-生物素封闭试剂盒进行封闭。</li>
	<li>用含 10% 胎牛血清的 PBS（FCS/PBS）封闭 30 分钟，室温操作。</li>
	<li>一抗为兔抗小鼠 I 型胶原抗体，用 10% FCS/PBS 按 1:200 稀释。将切片与一抗在室温孵育 2 小时。</li>
	<li>在 PBS 中洗涤切片 3 次，每次 4 分钟，室温操作。</li>
	<li>将生物素化抗兔二抗按 1:500 稀释，并与切片在室温孵育 1.5 小时。</li>
	<li>在 PBS 中洗涤切片 3 次，每次 4 分钟，室温操作。</li>
	<li>根据生产商说明书，依次使用亲和素-过氧化物酶偶联物和二氨基联苯胺-过氧化氢进行显色反应。</li>
	<li>用 Mayer 苏木精溶液复染 5 分钟，在 PBS 中洗涤 2 次，每次 2 分钟，室温操作，最后用 Aquatex 封片。</li>
</ol>
7. 代表性结果
用 Ad-2D6 感染小鼠会引发两种不同阶段的肝损伤。感染后的最初几天，病毒对肝脏的感染会导致血清转氨酶水平急性升高，这是肝细胞死亡的指标6。这一初期的急性阶段与人源 CYP2D6（hCYP2D6）的表达无关，使用空载对照病毒（Ad-Control）或表达绿色荧光蛋白的病毒（Ad-GFP）感染后同样可观察到该现象。相反，第二阶段为自身免疫介导，且依赖于触发分子 hCYP2D6 的表达。该自身免疫阶段发生在感染后 2 至 4 周内，并可持续数月之久6。
 
<img alt="小鼠注射研究示意图；追踪CYP2D6感染分析中的血清和肝脏数据。" src="/files/ftp_upload/3644/3644fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图1">
图1. CYP2D6 模型。 将野生型 FVB 或 C57BL/6 小鼠通过静脉和腹腔注射两种剂量的 Ad-2D6。在感兴趣的时间点采集肝脏和血清，检测肝损伤情况以及人源 CYP2D6 特异性抗体和T细胞的形成。
在CYP2D6模型中，野生型FVB或C57BL/6小鼠感染Ad-2D6后出现的持续性自身免疫性肝炎具有以下特征：首先，肝脏呈现异常的形态学改变。特别是肝叶发生融合，整个肝脏散在出现增生性结节，并可见明显的包膜纤维化（图2）。
 
<img alt="肝脏形态学比较；Ad-Control 与 Ad-2D6；细胞变化；实验研究。" src="/files/ftp_upload/3644/3644fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 2">
图2. 肝脏形态学。 感染后第4周检测到典型的Ad-2D6诱导的肝脏损伤。注意，肝脏各个叶已发生融合（箭头所示）。增生性结节散在分布于整个肝脏表面（箭头所示）。使用不表达hCYP2D6的对照腺病毒进行感染对肝脏形态无影响。
其次，在Ad-2D6感染的小鼠肝脏中，门脉周围区域和实质区域出现广泛且持续的细胞浸润，而在Ad-Control感染的小鼠中则无此现象（图3A）。纤维化主要发生在肝包膜下区域，部分胶原纤维束伸入实质内（图3B）。
 
<img alt="组织学比较，肝组织切片；免疫染色，细胞结构重点；示意图。" src="/files/ftp_upload/3644/3644fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 3"> 
图3. 肝脏组织学。 A：感染Ad-Control或Ad-2D6后第4周FVB小鼠肝脏组织切片的苏木精-伊红（H&E）染色结果。注意仅在Ad-2D6感染的小鼠肝脏中出现明显的单核细胞浸润（单箭头所示）。三重箭头指示肝实质内邻近门脉区之间桥接的较大范围细胞浸润灶。B：感染Ad-2D6或Ad-control后第4周肝纤维化的免疫组织化学图像。肝脏切片经抗I型胶原抗体染色以显示胶原沉积。注意在肝包膜下有多层胶原沉积（三重箭头），部分胶原束伸入肝实质（单箭头），并可见大量浸润细胞聚集（箭头尖）。每种条件下均展示两个代表性肝脏切片。比例尺：100 μm。
第三个特征是产生高效价的抗CYP2D6抗体，这些抗体具有与人类LKM-1抗体相似的表位特异性 6,13最后，生成主要归巢于肝脏的hCYP2D6特异性CD4和CD8 T细胞。可通过免疫优势hCYP2D6肽刺激并结合胞内细胞因子染色（ICCS）检测IFNγ表达，从而检测此类hCYP2D6特异性T细胞（图4）。hCYP2D6特异性CD8 T细胞可杀伤Ad-2D6感染的靶细胞 体内 12.
 
<img alt="流式细胞术散点图；CD4/CD8表位；IFNγ表达分析；免疫应答研究。" src="/files/ftp_upload/3644/3644fig4.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图4">
图4. hCYP2D6特异性T细胞。 对hCYP2D6特异性T细胞进行流式细胞术分析。在Ad-2D6感染后第4周分离肝脏淋巴细胞，并用hCYP2D6的主要CD4或CD8表位过夜刺激。通过细胞内细胞因子染色检测IFNγ的产生，并使用FACS Canto II（BD Biosciences, Heidelberg, Germany）进行流式细胞术分析。图中所示为hCYP2D6特异性CD4和CD8细胞所占的百分比。

<ol><li>Manns, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diagnosis+and+management+of+autoimmune+hepatitis%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Diagnosis and management of autoimmune hepatitis.</a> Hepatology. 51, 2193-2213 (2010).</li>
<li>Czaja, A. J., Manns, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+the+Diagnosis%2C+Pathogenesis+and+Management+of+Autoimmune+Hepatitis%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Advances in the Diagnosis, Pathogenesis and Management of Autoimmune Hepatitis.</a> Gastroenterology. 4, 429-443 (2010).</li>
<li>Christen, U., Hintermann, E., Jaeckel, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+animal+models+for+autoimmune+hepatitis%5BTitle%5D)+AND+%22Semin.+Liver+Dis%22%5BJournal%5D)">New animal models for autoimmune hepatitis.</a> Semin. Liver Dis. 29, 262-272 (2009).</li>
<li>Christen, U., Holdener, M., Hintermann, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+for+autoimmune+hepatitis%5BTitle%5D)+AND+%22Autoimmun.+Rev%22%5BJournal%5D)">Animal models for autoimmune hepatitis.</a> Autoimmun. Rev. 6, 306-311 (2007).</li>
<li>Czaja, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+autoimmune+hepatitis%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Rev.+Gastroenterol.+Hepatol%22%5BJournal%5D)">Animal models of autoimmune hepatitis.</a> Expert Rev. Gastroenterol. Hepatol. 4, 429-443 (2010).</li>
<li>Holdener, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Breaking+tolerance+to+the+natural+human+liver+autoantigen+cytochrome+P450+2D6+by+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Breaking tolerance to the natural human liver autoantigen cytochrome P450 2D6 by virus infection.</a> J. Exp. Med. 205, 1409-1422 (2008).</li>
<li>Manns, M. P., Griffin, K. J., Sullivan, K. F., Johnson, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LKM-1+autoantibodies+recognize+a+short+linear+sequence+in+P450IID6%2C+a+cytochrome+P-450+monooxygenase%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">LKM-1 autoantibodies recognize a short linear sequence in P450IID6, a cytochrome P-450 monooxygenase.</a> J. Clin. Invest. 88, 1370-1378 (1991).</li>
<li>Zanger, U. M., Hauri, H. P., Loeper, J., Homberg, J. C., Meyer, U. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibodies+against+human+cytochrome+P-450db1+in+autoimmune+hepatitis+type+II%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Antibodies against human cytochrome P-450db1 in autoimmune hepatitis type II.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 85, 8256-8260 (1988).</li>
<li>von Herrath, M. G., Fujinami, R. S., Whitton, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microorganisms+and+autoimmunity%3A+making+the+barren+field+fertile%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Microorganisms and autoimmunity: making the barren field fertile.</a> Nat. Rev. Microbiol. 1, 151-157 (2003).</li>
<li>Yardeni, T., Eckhaus, M., Morris, H. D., Huizing, M., Hoogstraten-Miller, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retro-orbital+injections+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Lab.+Anim.+%28NY%29%22%5BJournal%5D)">Retro-orbital injections in mice.</a> Lab. Anim. (NY). 40, 155-160 (2011).</li>
<li>Forbes, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morbidity+and+mortality+rates+associated+with+serial+bleeding+from+the+superficial+temporal+vein+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Lab.+Anim.+%28NY%29%22%5BJournal%5D)">Morbidity and mortality rates associated with serial bleeding from the superficial temporal vein in mice.</a> Lab. Anim. (NY). 39, 236-240 (2010).</li>
<li>Ehser, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mimicry+rather+than+identity+beaks+T+cell+tolerance+in+the+CYP2D6+mouse+model+for+human+autoimmune+hepatitis%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Molecular mimicry rather than identity beaks T cell tolerance in the CYP2D6 mouse model for human autoimmune hepatitis.</a> , Forthcoming (2011).</li>
<li>Hintermann, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epitope+spreading+of+the+anti-CYP2D6+antibody+response+in+patients+with+autoimmune+hepatitis+and+in+the+CYP2D6+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Autoimmun%22%5BJournal%5D)">Epitope spreading of the anti-CYP2D6 antibody response in patients with autoimmune hepatitis and in the CYP2D6 mouse model.</a> J. Autoimmun. , Forthcoming (2011).</li>
<li>Ando, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Class+I-restricted+cytotoxic+T+lymphocytes+are+directly+cytopathic+for+their+target+cells+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Class I-restricted cytotoxic T lymphocytes are directly cytopathic for their target cells in vivo.</a> J. Immunol. 152, 3245-3253 (1994).</li>
<li>Zierden, M., Kuhnen, E., Odenthal, M., Dienes, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+and+regulation+of+autoreactive+CD8%2B+T+cells+in+a+transgenic+mouse+model+of+autoimmune+hepatitis%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Effects and regulation of autoreactive CD8+ T cells in a transgenic mouse model of autoimmune hepatitis.</a> Gastroenterology. 139, 975-986 (2010).</li>
<li>Limmer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Failure+to+induce+organ-specific+autoimmunity+by+breaking+of+tolerance%3A+importance+of+the+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Failure to induce organ-specific autoimmunity by breaking of tolerance: importance of the microenvironment.</a> Eur. J. Immunol. 28, 2395-2406 (1998).</li>
<li>Voehringer, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Break+of+T+cell+ignorance+to+a+viral+antigen+in+the+liver+induces+hepatitis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Break of T cell ignorance to a viral antigen in the liver induces hepatitis.</a> J. Immunol. 165, 2415-2422 (2000).</li>
<li>Derkow, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+priming+of+CD8+and+CD4+T-cells+in+animal+models+of+autoimmune+hepatitis+and+cholangitis%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Differential priming of CD8 and CD4 T-cells in animal models of autoimmune hepatitis and cholangitis.</a> Hepatology. 46, 1155-1165 (2007).</li>
<li>Lapierre, P., Djilali-Saiah, I., Vitozzi, S., Alvarez, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+murine+model+of+type+2+autoimmune+hepatitis%3A+Xenoimmunization+with+human+antigens%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">A murine model of type 2 autoimmune hepatitis: Xenoimmunization with human antigens.</a> Hepatology. 39, 1066-1074 (2004).</li>
<li>Djilali-Saiah, I., Lapierre, P., Vittozi, S., Alvarez, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+vaccination+breaks+tolerance+for+a+neo-self+antigen+in+liver%3A+a+transgenic+murine+model+of+autoimmune+hepatitis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">DNA vaccination breaks tolerance for a neo-self antigen in liver: a transgenic murine model of autoimmune hepatitis.</a> J. Immunol. 169, 4889-4896 (2002).</li>
<li>Christen, U., Hintermann, E., Holdener, M., von Herrath, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viral+triggers+for+autoimmunity%3A+is+the+%27glass+of+molecular+mimicry%27+half+full+or+half+empty%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Autoimmun%22%5BJournal%5D)">Viral triggers for autoimmunity: is the 'glass of molecular mimicry' half full or half empty.</a> J. Autoimmun. 34, 38-44 (2010).</li>
<li>Krebs, P., Scandella, E., Odermatt, B., Ludewig, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+functional+exhaustion+and+deletion+of+CTL+following+immunization+with+recombinant+adenovirus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Rapid functional exhaustion and deletion of CTL following immunization with recombinant adenovirus.</a> J. Immunol. 174, 4559-4566 (2005).</li>
<li>Hintermann, E., Bayer, M., Pfeilschifter, J., Christen, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adenoviral+delivery+of+the+liver+autoantigen+cytochrome+P450+2D6+chronically+activates+hepatic+stellate+cells+and+induces+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Manuscript+Submitted%22%5BJournal%5D)">Adenoviral delivery of the liver autoantigen cytochrome P450 2D6 chronically activates hepatic stellate cells and induces fibrosis.</a> Manuscript Submitted. , (2011).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

在以往的研究中，实验性肝炎通常仅表现为短暂性，且目前许多自身免疫性肝病模型依赖较为复杂的疾病诱导方案（综述见3,5）。例如，多个模型采用表达特定靶抗原的转基因小鼠，并过继转移针对该抗原的特异性T细胞，这些T细胞多为TcR转基因T细胞14,15。通常还需额外感染嗜肝病毒、细菌或寄生虫以诱发疾病16-18。另一种方法是使用编码靶抗原（包括CYP2D619）的质粒进行DNA疫苗接种来诱导肝炎。然而，该方法还需联合使用编码促炎性细胞因子（如IL-12）的质粒进行加强免疫20。遗憾的是，除少数例外情况15,20外，所诱导的肝炎通常仅为短暂性。
CYP2D6 模型6,21 采用一种简单的方法，通过用表达 hCYP2D6 的腺病毒（AIH-2 中的主要自身抗原7,8）感染小鼠来诱导自身免疫性肝炎。通过腺病毒载体递送 CYP2D6 可确保肝脏被直接靶向，同时引发局部炎症，从而促进免疫耐受的破坏。然而需要注意的是，该模型的成功依赖于病毒滴度以及给药途径的选择。一方面，Ad-2D6 是一种复制缺陷型病毒，因此需要足够高的病毒滴度才能在肝脏中产生足够量的抗原；另一方面，过高的滴度可能导致致命的急性肝衰竭。此外，已有研究证实，高滴度腺病毒感染小鼠会导致免疫应答的功能性耗竭22。在本模型中，我们结合静脉注射与腹腔注射的方式，以实现持续的慢性细胞浸润以及广泛的纤维化。我们观察到，仅进行静脉注射仍可引起显著的细胞浸润，但不会导致被膜下区域的纤维化，提示腹腔注射所引发的腹腔内炎症可能参与了被膜下胶原的持续沉积（Hintermann &amp; Christen，正在撰写中的论文）。然而需要强调的是，所观察到的肝纤维化具有抗原特异性，因为在使用相同滴度的 Ad-GFP 或 Ad-Control 感染后，未检测到肝星状细胞的活化及胶原沉积23。
CYP2D6 模型反映了人类自身免疫性肝炎（AIH）的诸多特征1,2，例如以持续性细胞浸润和肝纤维化为特点的慢性肝炎6。此外，该模型中存在高滴度抗 CYP2D6 抗体，其表位特异性和表位扩散模式13与 AIH-2 患者体内发现的 LKM-1 抗体相似，表明存在共同的慢性自身免疫反应。CYP2D6 是 AIH-2 的主要抗原，但在更常见的 AIH-1 型患者中不被识别。此外，患有其他自身免疫性病因肝病的患者，如原发性胆汁性胆管炎（PBC）或原发性硬化性胆管炎（PSC），会产生针对不同肝脏自身抗原的标志性自身抗体，其肝脏病理特征也不同，分别以小（PBC）或大（PSC）胆管为中心。尽管如此，CYP2D6 模型为研究自身免疫性肝病过程中发生的慢性肝脏炎症相关的免疫病理机制、鉴定驱动肝细胞自身免疫性破坏的关键因子以及评估可能的治疗干预措施以治愈该疾病提供了机会。

<table><tbody><tr><td>23G 针头</td><td>BD Biosciences</td><td>300800</td><td></td></tr><tr><td>27&amp;frac12;G 针头</td><td>VWR international</td><td>612-0151</td><td></td></tr><tr><td>30&amp;frac12; G 针头</td><td>BD Biosciences</td><td>304000</td><td></td></tr><tr><td>丙氨酸氨基转移酶检测条（GPT/ALT）</td><td>Roche Group</td><td>10 745 138 202</td><td></td></tr><tr><td>天冬氨酸氨基转移酶检测条（GOT/AST）</td><td>Roche Group</td><td>10 745 120 202</td><td></td></tr><tr><td>麻醉仪 Univentor 400</td><td><a href="http://www.agnthos.se" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> AgnTho&amp;#8217;s</a></td><td></td><td></td></tr><tr><td>一次性基模，37×24×10 mm</td><td>VWR international</td><td>720-0208</td><td></td></tr><tr><td>细胞滤筛，70 mm</td><td>VWR international</td><td>734-0003</td><td></td></tr><tr><td>冷冻切片机</td><td>Leica Microsystems</td><td>CM1850 UV</td><td></td></tr><tr><td>肝素化毛细管</td><td>Fisher Scientific</td><td>3123987</td><td></td></tr><tr><td>显微镜载玻片 Superfrost Plus</td><td>Menzel-Glaser</td><td>J1800AMNZ</td><td></td></tr><tr><td>Microtainer SST 管</td><td>BD Biosciences</td><td>365951</td><td></td></tr><tr><td>微量滴定板，V 型底</td><td>VWR international</td><td>391-1924</td><td></td></tr><tr><td>Reflotron Plus</td><td>Roche Group</td><td></td><td>用于测定血清 AST / ALT</td></tr><tr><td>兔抗小鼠 I 型胶原 IgG 抗体</td><td>Chemicon International</td><td>AB765P</td><td></td></tr><tr><td>生物素标记的山羊抗兔 IgG</td><td>Vector Laboratories</td><td>VC-BA-1000-MC15</td><td></td></tr><tr><td>FITC 标记的抗小鼠 CD8a 抗体</td><td>SouthernBiotech</td><td>1550-02</td><td></td></tr><tr><td>PE 标记的抗小鼠 IFN&amp;#947; 抗体</td><td>BD Biosciences</td><td>554412</td><td></td></tr><tr><td>PE 标记的抗小鼠 CD16/CD32 抗体（FcR 封闭）</td><td>BD Biosciences</td><td>553141</td><td></td></tr><tr><td>Aquatex</td><td>VWR international</td><td>1.08562.0050</td><td></td></tr><tr><td>亲和素/生物素封闭试剂盒</td><td>Vector Laboratories</td><td>VC-SP-2001-KI01</td><td></td></tr><tr><td>布雷菲德菌素 A</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B6542</td><td></td></tr><tr><td>胶原酶 IV</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5138-100MG</td><td></td></tr><tr><td>DAB 底物试剂盒 3&amp;rsquo;3&amp;rsquo;二氨基联苯胺</td><td>Vector Laboratories</td><td>VC-SK-4100-KI01</td><td></td></tr><tr><td>脱氧核糖核酸酶（DNase）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DN-25</td><td></td></tr><tr><td>Elite ABC 试剂</td><td>Vector Laboratories</td><td>VC-PK-7100-L050</td><td></td></tr><tr><td>伊红 G/Y 溶液</td><td>Carl Roth Gmbh</td><td>X883.1</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清（FCS）</td><td>Biochrom AG</td><td>S 0115</td><td></td></tr><tr><td>异氟烷</td><td>Forene</td><td>B506</td><td></td></tr><tr><td>Meyer&amp;rsquo;s 苏木精溶液</td><td>AppliChem</td><td>A4840,1000</td><td></td></tr><tr><td>OCT 包埋剂</td><td>Sakura Finetek</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液（PBS）配制的 10% 甲醛</td><td>Carl Roth Gmbh</td><td>A146.3</td><td></td></tr><tr><td>Percoll</td><td>Amersham</td><td>17-0891-01</td><td></td></tr><tr><td>Roti-Histokit</td><td>Carl Roth Gmbh</td><td>6638.1</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 培养基</td><td>Invitrogen</td><td>61870</td><td></td></tr><tr><td>皂苷（来自皂荚树皮）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7900</td><td></td></tr></tbody></table>

cyp2d6 动物模型：如何在小鼠中诱导自身免疫性肝炎

The CYP2D6 Animal Model: How to Induce Autoimmune Hepatitis in Mice

自身免疫性肝炎是一种病因未明的罕见但危及生命的肝脏自身免疫性疾病1,2。过去曾多次尝试建立能够反映人类疾病特征的动物模型3-5。然而，在各种模型中，疾病诱导过程较为复杂，且肝炎往往仅为一过性3-5。因此，我们开发了一种简便的小鼠模型，该模型以2型自身免疫性肝炎（AIH-2）的主要人类自身抗原hCYP2D6作为触发因子6。识别hCYP2D6的1型肝肾微粒体抗体（LKM-1）是AIH-2的标志性抗体7,8。通过腺病毒载体（Ad-2D6）将hCYP2D6递送至野生型FVB或C57BL/6小鼠体内，可确保触发抗原直接递送至肝脏。由此引发的局部炎症为后续自身免疫反应的发生提供了有利环境9。联合采用静脉注射和腹腔注射Ad-2D6是诱导肝脏持久性自身免疫损伤的最有效途径（第1节）。本文详细介绍了如何在CYP2D6模型中诱导自身免疫性肝病，以及如何评估肝脏损伤的不同方面。首先，通过眼后静脉丛采血，检测反映肝细胞破坏的血清标志物（如转氨酶）水平以及hCYP2D6抗体的滴度（第2节）。其次，通过采集脾脏和肝脏中的淋巴细胞，表征hCYP2D6特异性的T细胞应答。为获得纯化的肝脏淋巴细胞，需经门静脉用PBS灌注肝脏（第3节），随后用胶原酶消化，并通过Percoll梯度离心纯化（第4节）。通过hCYP2D6肽段刺激，并利用流式细胞术检测IFNγ产生细胞，分析hCYP2D6特异性T细胞的频率（第5节）。第三，通过肝脏组织切片的免疫组织化学染色，评估细胞浸润和纤维化程度（第6节）。为证实该模型的慢性特征，需在疾病启动后的多个时间点进行上述分析。在评估可能用于预防、延缓或阻断肝脏自毁过程的治疗手段时，必须对免疫应答的强度（表现为hCYP2D6特异性T细胞和/或B细胞的频率与活性）以及肝脏损伤和纤维化的程度进行系统评估。

用表达人类主要自身抗原细胞色素P450 2D6（hCYP2D6）的腺病毒感染小鼠，该抗原可被2型自身免疫性肝炎患者血清所识别，从而导致一种持续性的自身免疫介导的肝病，其特征为严重的肝炎、纤维化以及产生针对CYP2D6的特异性免疫反应。

CYP2D6 动物模型：如何在小鼠中诱导自身免疫性肝炎

自身免疫性肝炎是一种病因未明的罕见但危及生命的肝脏自身免疫性疾病1,2。过去曾多次尝试……

以下实验的总体目标是建立并验证一种用于自身免疫性肝炎的小鼠模型。自身免疫性肝炎是一种人类自身免疫性肝脏疾病，其特征为肝脏界面的慢性炎症（肝炎）、高γ球蛋白血症以及标志性自身抗体的产生。首先，通过感染表达致病性自身抗原CYP2D6的腺病毒载体，在肝脏内诱导局部炎症反应。随后，通过肝脏灌注及密度梯度离心法分离肝脏淋巴细胞。最终，分别通过免疫组织化学染色和细胞内细胞因子染色来评估肝脏损伤程度及自身抗原特异性T细胞的鉴定。与现有方法相比，该技术的主要优势在于，我们的自身免疫性肝炎模型表现出肝脏的慢性炎症以及针对自身抗原的特异性免疫反应，这与患有2型自身免疫性肝炎的人类患者的免疫反应几乎完全相同。我们的模型有助于解答自身免疫性肝病领域中的关键问题，例如，自身免疫性肝炎患者肝脏进行性损伤的驱动机制是什么。在常规操作中，我们通常需要通过眼静脉窦进行静脉注射和采血，同时对肝脏进行灌注，这些操作对操作者的技术要求较高，需要经过充分练习才能掌握。麻醉后，用拇指和中指捏住小鼠颈背部皮肤并拉紧头部松弛的皮肤。注意在此位置下，由于眼部周围皮肤受到牵拉，眼球会略微突出。现在将针头插入靠近动物鼻部的眼睑交界处的内眦，缓慢注射100 µL的80 2D六病毒溶液。然后稍微回撤针头并闭合眼睑。首先，用一个5毫升注射器吸取冷PBS，并在注射器上安装一根27号针头。随后，在处死小鼠后，用剪刀在动物后肢约一厘米处的皮肤和肌肉层上做切口，沿动物两侧剪开，向上延伸至横膈膜。当到达横膈膜时，将皮肤向后拉，用剪刀将横膈膜从肋骨上剪下，并解剖下腔静脉。在此解剖阶段，将胃和肠道移至一侧，暴露门静脉。灌注肝脏是该操作中最困难的部分，尤其是当肝脏存在慢性炎症甚至纤维化时。小鼠体型较小，因此需要稳定的手法才能准确穿刺门静脉。此外，必须缓慢加入 PBS，否则可能造成组织损伤。将先前准备好的针头插入门静脉，然后轻轻推动注射器活塞，使 PBS 缓慢冲洗肝脏中的血液，直至灌注完成。用镊子夹住膈肌，用剪刀将膈肌从体内剪下，从而取出肝脏。最后，将器官转移至培养皿中，并移除膈肌、胆囊以及仍与肝脏相连的其他组织。需要注意的是，患有自身免疫性肝炎的动物肝脏呈纤维化，且各个肝叶已发生融合。首先，在培养皿中加入10毫升新鲜PPS溶液，并将其置于冰上。将灌注后的肝脏转移至培养皿中，用剪刀将组织剪成小块。接着，将组织和PBS倒入70微米细胞滤筛中，使用玻璃研杵将肝组织块压过滤筛。然后，小心地将10毫升冷的胶原酶缓冲液倒在组织块上，必要时继续使用研杵操作。在4°C条件下，以30 × g离心3分钟，使细胞沉淀。将上清液转移至新管中，保留沉淀上方约5毫米液体；随后以650 × g离心10分钟，温度保持在4°C。弃去上清液，仅保留最后3毫米的液体。将沉淀重悬于20毫升每细胞缓冲液中，然后在4摄氏度下以600 × g离心20分钟，弃去上清液，并通过轻弹管壁重悬沉淀，此过程用于研究腺病毒2D6感染野生型小鼠后在CYP 2D6模型中发生的持续性自身免疫性肝炎。肝脏表现出明显改变的形态，如右侧图所示。特别是，肝叶发生融合（由黑色箭头指示），并且遍布整个肝脏可见散在的嗜酸性结节（由黑色箭头指示），同时可观察到明显的包膜纤维化，而对照感染组未见此现象。如左图所示，不表达人CYP 2D6的腺病毒对肝脏形态无影响。在感染腺病毒2D6的小鼠肝脏门管区和实质区域中出现广泛且持续的细胞浸润，而在感染对照腺病毒的小鼠中则无此现象。请注意，仅在感染腺病毒2D6的小鼠中可见单核细胞的显著浸润，如单个黑色箭头所示。此处。三重箭头指示肝实质中邻近门脉区之间存在较大的细胞浸润。在本图中，可以观察到纤维化主要在肝包膜下区域发展，并伴有部分胶原束向实质内突出。请注意，如三重黑箭头所示，肝包膜下存在多层胶原沉积，部分胶原束如单箭头所示向实质内延伸，以及如黑箭头头所示存在大量浸润细胞的细胞簇。腺病毒感染小鼠中持续性自身免疫性肝炎的第三个特征是，主要产生趋向肝脏的人源CYP2D6特异性CD4和CD8 T细胞，如这些代表性细胞内细胞因子染色点图所示。经免疫优势CD4或CD8人源CYP2D6多肽过夜刺激后，肝脏淋巴细胞分别诱导出CD4阳性或CD8阳性T细胞特异性的干扰素γ表达。在进行该操作时，需注意肝脏的充分灌注是关键步骤，以避免外周血单核细胞污染肝脏淋巴细胞。完成该操作后，可进一步开展其他方法，例如分离原代肝星状细胞，以研究T细胞活化状态及其迁移潜能。该动物模型将为自身免疫性肝病领域的研究人员探索驱动肝脏慢性炎症的关键因素，以及评估患者的潜在治疗方法提供重要基础。

the-cyp2d6-animal-model-how-to-induce-autoimmune-hepatitis-in-mice

Research

科研

JoVE Journal

Medicine

医学

CYP2D6动物模型：如何诱导小鼠自身免疫性肝炎

本视频展示了如何在SJL小鼠中诱导自身免疫性垂体炎，以及如何通过组织病理学评估其严重程度。...

在SJL小鼠中诱导实验性自身免疫性垂体炎

该视频展示了一项利用人诱导性多能干细胞（iPSC）来源的CD8+...

利用病毒抗原特异性T细胞抑制乙型肝炎病毒复制

本视频展示了一种构建双人源化小鼠模型的方法，该模型同时具有人免疫系统和人肝细胞。该方法包括将人肝细胞和造血干细胞与祖细胞移植到转基因免疫缺陷小鼠体内。...

开发含有人肝细胞和免疫细胞的人源化小鼠模型

将bm12淋巴细胞移植到C57BL/6受体小鼠体内是系统性红斑狼疮的成熟动物模型。本文介绍如何利用该模型诱导疾病发生，并通过流式细胞术对滤泡辅助性T细胞、生发中心B细胞和浆细胞进行表征分析。...

C57BL/6小鼠中系统性红斑狼疮（SLE）的bm12可诱导模型

本文介绍了一种通过喂食胆碱缺乏且添加乙硫氨酸（CDE）的饮食来诱导小鼠慢性肝损伤的常用方法。我们展示了健康监测、肝脏灌注、分离与保存的操作过程。为期六周的时间进程可用于评估肝损伤、病理组织学、纤维化、炎症反应以及肝前体细胞的应答情况。...

小鼠胆碱缺乏、乙硫氨酸补充（CDE）饮食慢性肝损伤模型

本文介绍了一种利用人诱导性多能干细胞来源的肝细胞构建家族性高胆固醇血症人源化肝脏嵌合小鼠模型的实验方案。该模型是测试高胆固醇血症新疗法的重要工具。...

利用诱导多能干细胞衍生肝细胞构建家族性高胆固醇血症人源化肝脏嵌合小鼠模型

我们描述了一种在BALB/c小鼠中建立的体内免疫、可转化的肝炎模型，可用于研究药物诱导的自身免疫性肝炎的发病机制，包括该疾病中观察到的性别差异。我们将阐述如何利用该模型通过体内和体外实验技术实现可重复的分析。...

在BALB/c小鼠中诱导药物诱导型自身免疫性肝炎以研究其致病机制

本文描述了一种具有临床相关性的肝癌小鼠模型的建立，该模型可重现肝细胞癌（HCC）典型的免疫学特征。...

一种由致癌性肝细胞诱导的原位小鼠肝细胞癌模型，发生于肝脏炎症与纤维化背景下

本文介绍了一种简单且可靠的非酒精性脂肪性肝炎（NASH）饮食诱导啮齿类动物模型，通过非SPF级动物饲养环境并给予特定高脂饮食实现。我们描述了在暴露于环境微生物的小鼠中鉴定肝脏和脂肪组织免疫细胞亚群的方法，以模拟人类的免疫学状态。...

一种与2型糖尿病相关的非酒精性脂肪性肝炎高级小鼠模型

在本报告中，我们介绍了一种可使研究人员建立小鼠眼内葡萄膜炎模型的实验方案。该模型通常被称为实验性自身免疫性葡萄膜炎（EAU），是一种成熟的模型，能够模拟人类疾病的多个方面。本文将描述如何通过多种检测指标来诱导并监测疾病进展。...

实验性自身免疫性葡萄膜炎：一种眼内炎症的小鼠模型

已建立多种桥本甲状腺炎的动物模型，其中包括NOD小鼠的自发性自身免疫性甲状腺炎。H-2h4小鼠是一种简单且可靠的HT诱导模型。本文描述了该建模方法，并对病理过程进行评估，以增进对SAT小鼠模型的理解。...

小鼠自发性自身免疫性甲状腺炎模型的建立

了解利用腺病毒表达CYP2D6诱导小鼠自身免疫性肝炎的实验方法。该模型通过肝脏灌注和密度梯度离心分离肝淋巴细胞，结合免疫组化和胞内细胞因子染色评估肝损伤，为研究人类2型自身免疫性肝炎的慢性肝脏炎症机制及开发潜在治疗方案提供可靠平台。

CYP2D6 动物模型：如何在小鼠中诱导自身免疫性肝炎

探索更多视频