简单且可靠的 in vivo 与 in vitro 研究病毒组装的方法

本实验的总体目标是研究病毒在体内和体外的组装过程。首先在细菌中表达芜菁花叶病毒（bro mosaic virus）RNA，并通过农杆菌浸润法将其导入植物细胞，以此实现上述目标。随后，从浸润过的叶片中纯化BMV病毒颗粒。

然后制备用于体外组装的衣壳蛋白亚基。最后，利用衣壳蛋白和吲哚菁绿染料在体外组装燕麦花叶病毒（BMV）变体。最终结果表明，通过光学幻影的形成，可观察到体外组装的燕麦花叶病毒变体，该现象可通过荧光吸收和发射来确定。

今天，我们将介绍一种称为过滤法的技术，该技术可用于向植物递送病毒组分。这种方法的主要优势在于无需制备体外转录本，同时能够将多个组分递送到同一个细胞中，从而实现同步感染。我们目前开展的研究工作是利用芜菁花叶病毒与一种经美国食品药品监督管理局（FDA）批准的氰基绿色素分子结合，构建一种新型纳米颗粒，用于生物医学应用。

具体而言，我们的目标是将这些结构用作光学导线幽灵（或称OB gs），应用于包括荧光成像和光声成像在内的光学成像技术，同时也将其作为激光治疗的载体。我们目前正在探索的一项具体临床应用是，在术中操作过程中利用这些结构对卵巢癌进行成像。其核心思路在于，我们可以对这些结构进行功能化修饰。

具有特异性靶向基序的OBG可识别残留的肿瘤细胞，在卵巢癌的情况下，这些细胞可能尤其存在于腹腔内。从先前制备的含有烟草脆裂病毒RNA的农杆菌平板中，挑取单克隆接种于2毫升LB培养基中，该培养基含有50微克/毫升卡那霉素和100微克/毫升利福平。将培养物在28°C、250 RPM的摇床中培养一天。次日，取1毫升菌液接种至50毫升LB培养基（置于500毫升锥形瓶中），在28°C、250 RPM的摇床中继续培养16小时。当菌液在600 nm处的光密度（OD600）达到1.0时，将菌液转移至无菌的30毫升离心管中，离心10分钟。

在5,000 RPM和4摄氏度条件下，将沉淀物溶于10毫升含10毫摩尔氯化镁的溶液中，并在5,000 RPM和4摄氏度下离心10分钟。重复此步骤一次，以确保完全去除抗生素。接下来，将沉淀物悬浮于10毫升缓冲液中，该缓冲液含有10毫摩尔2-(N-吗啉代)乙磺酸（MES）和10毫摩尔氯化镁。

测定每种培养物在600 nm处的光密度（OD 600），并使用10毫摩尔氯化镁和10毫摩尔MES将OD 600调整至0.1。然后混合三种OD 600为0.1的培养悬浮液各10毫升。加入苯乙酮，使其终浓度为100毫摩尔。

轻轻混匀，并在室温下静置反应三小时。孵育结束后，将菌液吸入一支1毫升无针头的注射器中。通过轻压注射器，将菌液悬浮液渗透至2至3片充分展开的N. benthamiana叶片的近轴面，注射位置位于每片叶片远轴面的一侧。

将接种后的植物置于24摄氏度的温室中培养三至四天，然后收获叶片。纯化BMV病毒颗粒后，配制一升1倍病毒解离缓冲液。接着，准备透析膜。

根据 Sambrook 等人的方法，将每毫升含 5 至 10 毫克纯化病毒的溶液加入透析袋中，并将透析袋置于含有 1 × 病毒解离缓冲液的烧瓶中。在 4°C 条件下搅拌透析 24 小时。

收集透析袋中的溶液，在4 °C条件下以30,000 RPM离心30分钟，使未结合的病毒颗粒沉淀。将上清液在4 °C条件下以30,000 RPM离心3小时。在制备好将重新组装成病毒颗粒的RNA转录本后，按1:5的比例混合衣壳蛋白亚基与RNA转录本。

将混合物装入透析袋中，并妥善密封以防止任何泄漏。在配制好一升一倍RNA组装缓冲液后，于次日在4°C条件下将重组反应混合物在该缓冲液中透析24小时，随后从透析袋中取出混合物，加入1.5毫升RNA组装缓冲液，再于4°C以30,000 RPM离心三小时。然后弃去上清液，重悬沉淀。

接下来，在 260 纳米波长处测定病毒颗粒浓度。然后在 280 纳米波长处或其他方法（如 Bradford 法）测定衣壳蛋白亚基的浓度，以评估解离后衣壳蛋白亚基的完整性。进行 12% 至 15% 的 SDS-PAGE 电泳，随后进行蛋白质印迹分析。最后，按照书面实验方案中所述的步骤制备光学病毒空壳（optical viral ghosts）或 ov cheese。

图中所示为透射电子显微镜图像，样本为从农杆菌浸润了三种野生型 BMV 农杆菌构建体混合物的 end hamana 植物中纯化的负染色 BMV Varion。该透射电镜图像显示了含有吲哚菁绿的负染色光学病毒空壳结构。此处展示了光学病毒空壳的吸收光谱和荧光光谱，条件为技术熟练掌握后。

每份样品的操作可在五分钟内完成。观看本视频后，您应能充分理解如何将病毒或非病毒组分包裹进衣壳蛋白亚基中。