Name: 简单而强大在体内和在体外方法研究病毒大会 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-03-01T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 47 s
Description: 学习利用农杆菌介导瞬时表达技术同步递送病毒组分，研究雀麦花叶病毒在植物细胞内的组装过程。该方法可制备光学病毒幽灵，用于生物医学成像与药物递送应用。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

作者感谢实验室多位成员在农杆菌浸润和体外组装实验开发过程中提出的宝贵建议。本研究由加利福尼亚大学资助项目提供经费支持。部分研究工作由美国国家科学基金会资助项目（CBET-1144237）支持。

1. 植物材料
<ol>
	<li>用于包封实验的Nicotiana benthamiana植株应处于四叶期（约3-4周龄）。</li>
</ol>
2. 通过农杆菌浸润法将功能性病毒基因组组分递送至植物细胞并实现表达
<ol>
	<li>第1天： 将含有 pCass-BMV RNA1、BMV RNA2 和 BMV RNA31,2 的农杆菌菌株（例如 EH105 或 GV3101）接种于添加了 50 mg/ml 卡那霉素（用于筛选 pCASS 载体）和 100 mg/ml 利福平（用于筛选农杆菌）的 LB 琼脂平板上，于 28 °C 培养两天。</li>
	<li>第3天： 挑取 LB 琼脂平板上的单菌落，接种至含有 50 mg/ml 卡那霉素和 100 mg/ml 利福平的 2 ml LB 液体培养基中，在 28 °C、250 RPM 的摇床中培养1天。</li>
	<li>第4天： 取1 ml 上述菌液接种至50 ml LB 液体培养基中，培养基中添加有 50 mg/ml 卡那霉素、100 mg/ml 利福平、10 mM MES（pH 5.6）和 100 mM 乙酰丁香酮，置于250 ml 锥形瓶中，在28 °C、250 RPM 的摇床中培养16小时。</li>
	<li>第5天： 当菌液 OD600 达到1.0时，将培养物转移至橡树岭管或无菌 Falcon 管中，在4 °C、5000 rpm 条件下离心10分钟。</li>
	<li>将菌体沉淀重悬于10 ml 含10 mM MgCl2 的溶液中，在4 °C、5000 rpm 条件下离心10分钟，重复此步骤一次，以确保完全去除抗生素。</li>
	<li>将菌体沉淀重悬于10 ml 含10 mM MgCl2 和10 mM MES（pH 5.6）的缓冲液中。</li>
	<li>分别测定 BMV RNA1、RNA2 和 RNA3 菌液的 OD600，并用含10 mM MgCl2 和10 mM MES（pH 5.6）的缓冲液调整至 OD600 = 0.1。</li>
	<li>取 OD600 = 0.1 的三种菌液各1 ml，混合均匀。</li>
	<li>加入乙酰丁香酮至终浓度为100 mM，轻轻混匀，室温静置3小时。</li>
	<li>将上述菌液混合物吸入1 ml 无针头的注射器中。</li>
	<li>将注射器轻压至 N. benthamiana 植株（5叶期，3–4周龄）2–3片充分展开叶片的远轴面一侧，进行浸润接种。</li>
	<li>对其他叶片重复上述浸润操作。</li>
	<li>将接种后的植株置于24 °C 的温室中培养。</li>
	<li>接种后3至4天（dpi）采集浸润过的叶片。</li>
</ol>
3. BMV 病毒粒子的纯化
<ol>
	<li>采集共转染了三种野生型BMV农杆菌转化株混合物的N. benthamiana叶片。</li>
	<li>将叶片置于无菌研钵中，加入等体积（w/v）的BMV提取缓冲液（0.5 M NaAc；0.08 M MgAc，pH 4.5，并在使用前加入1/100体积的β-巯基乙醇）进行研磨3。为最大化病毒产量，建议加入酸洗砂（约0.5–1 g），以促进研磨并有效破坏细胞。</li>
	<li>将叶片提取液通过2–3层纱布过滤，收集滤液。</li>
	<li>将纱布上残留的组织部分用与初始叶材料等量的BMV提取缓冲液再次研磨。</li>
	<li>使用纱布重复过滤步骤。以上操作应在4 °C下进行。</li>
	<li>将滤液转移至离心管中，加入等体积预冷的氯仿，室温下涡旋（或振荡）5分钟，直至悬浮液颜色变为浅绿色。</li>
	<li>将乳化后的溶液在4 °C下以12,000 RPM离心15分钟。</li>
	<li>收集水相，并在磁力搅拌器上搅拌30分钟，以去除残留的氯仿。</li>
	<li>将悬浮液转移至无菌超速离心管中。</li>
	<li>在样品下方铺加1 ml 10%蔗糖溶液（用病毒提取缓冲液配制）作为垫层3。</li>
	<li>在Beckman超速离心机中，于4 °C下以30,000 rpm离心3小时。</li>
	<li>弃去上清液，将沉淀用所需体积的BMV悬浮缓冲液重悬（悬浮缓冲液的配制方法：将BMV提取缓冲液用无菌蒸馏水稀释至1/10）。</li>
	<li>将上述步骤获得的初步纯化的病毒颗粒样品进行10–40%蔗糖密度梯度离心，于4 °C下以28,000 rpm离心150分钟。</li>
	<li>通过手动或分级收集器收集病毒条带。在白光照射下，病毒条带呈蓝色。</li>
	<li>用病毒悬浮缓冲液将含有病毒样品的蔗糖溶液至少稀释50%。</li>
	<li>将稀释后的含病毒蔗糖溶液在Beckman超速离心机中，于4 °C下以30,000 rpm离心3小时。</li>
	<li>最后，将高度纯化的病毒沉淀用所需体积的病毒悬浮缓冲液重悬。</li>
	<li>使用分光光度计在OD260处测定病毒颗粒的浓度（mg/ml）。</li>
</ol>
<img alt="BMV病毒粒子的浓度计算公式；260 nm处的光密度；稀释倍数；消光系数。" src="/files/ftp_upload/3645/3645eq1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Equation 1">
注意：根据RNA含量，BMV的消光系数为54。
<ol start="19">
	<li>通过透射电子显微镜（TEM）观察验证病毒粒子的纯度（图 A）</li>
</ol>
4. 体外组装用衣壳蛋白亚基的制备
<ol>
	<li>配制1升1×病毒解离缓冲液（0.5 M CaCl2；50 mM Tris HCl，pH 7.5；1.0 mM EDTA；1.0 mM DTT 和 0.5 mM PMSF）5。</li>
	<li>根据Sambrook et al 6 的方法制备透析膜。</li>
	<li>将所需浓度的纯化病毒加入透析袋中。</li>
	<li>将含有病毒的透析袋放入盛有1×病毒解离缓冲液的烧杯中。</li>
	<li>在4°C下搅拌透析24小时。</li>
	<li>24小时后收集透析袋中的溶液，并在4°C下以12,000×g离心15分钟，以分离BMV RNA与解离的病毒颗粒。</li>
	<li>收集上清液，并在Beckman离心机中以35,000 rpm在4°C下离心3小时，以沉淀任何未解离的病毒颗粒。</li>
	<li>收集上清液。</li>
	<li>在此阶段，必须去除解离的衣壳蛋白亚基中可能残留的病毒RNA污染。为此，应将第8步获得的上清液在不添加任何RNA的情况下，使用RNA 1×组装缓冲液（见下文）进行过夜的衣壳蛋白亚基重新组装，随后进行高速离心（4°C下30,000 rpm离心3小时），以沉淀任何重新组装的病毒颗粒。经过此重新组装步骤后，含有衣壳蛋白亚基的上清液应不含任何残留的污染性RNA。然而，为确保完全去除，建议仅使用衣壳蛋白亚基在RNA 1×组装缓冲液中进行一次额外的体外重新组装。过夜重新组装后，样品中必须无组装的病毒颗粒（可通过透射电子显微镜TEM验证）。</li>
	<li>通过测定OD 254和280 nm处的吸光度，或采用Bradford法等其他方法测定衣壳蛋白亚基的浓度。</li>
	<li>进行12–15% SDS-PAGE电泳，随后进行Western blot，以评估解离的衣壳蛋白亚基的完整性。</li>
</ol>
5. 体外 含RNA病毒颗粒的组装
<ol>
	<li>制备将被重新组装成病毒颗粒的RNA转录本，并计算其浓度7。</li>
	<li>按1:5（质量比）的比例混合衣壳蛋白亚基与RNA转录本5。</li>
	<li>将上述混合物加入透析袋中，并妥善封闭以防止泄漏。</li>
	<li>配制1,000 ml的RNA 1×组装缓冲液（50 mM NaCl；50 mM Tris-HCl，pH 7.2；10 mM KCl；5 mM MgCl2，1.0 mM DTT）5。</li>
	<li>将含有反应混合物的透析袋放入装有1×组装缓冲液的烧杯中，并进行搅拌。</li>
	<li>在4 °C下轻轻搅拌，透析重组反应24小时。</li>
	<li>24小时后从透析袋中收集混合物，并加入1.5 ml RNA组装缓冲液。</li>
	<li>将此混合物通过Centricon-100离心柱，在低速（2,000×g）下离心30分钟。</li>
	<li>在4 °C下用1.5 ml组装缓冲液洗涤柱子一次，持续30分钟。</li>
	<li>重复上述洗涤步骤两次。</li>
	<li>最后，在4 °C下以10,000×g离心5分钟，洗脱重新组装的病毒颗粒。</li>
	<li>在OD 260 nm处测定病毒颗粒的浓度。</li>
</ol>
6. 光学病毒空壳（OVGs）的制备
<ol>
	<li>将吲哚菁绿（Indocyanine green, ICG）8 按所需浓度比例加入纯化的衣壳蛋白中（本报告中使用的吲哚菁绿与衣壳蛋白的质量比为1:10），并通过移液充分混匀。</li>
	<li>将衣壳蛋白与ICG的混合溶液在OVG组装缓冲液（1 M NaCl；50 mM NaAc；1 mM EDTA；1 mM DTT，pH 4.8）中于4 °C透析24小时。</li>
	<li>24小时后，从透析袋（截留分子量12 kDa）中收集溶液，并在4 °C下以90,000 rpm离心1小时（图B）。</li>
	<li>弃去上清液，通过涡旋振荡或将沉淀在BMV悬浮缓冲液中于4 °C过夜静置自发悬浮，使沉淀重新悬浮。</li>
	<li>通过透射电子显微镜（TEM）验证OVG的形态（图C）。</li>
	<li>使用分光光度计（Cary 50, Varian Inc.）测定240 nm至950 nm范围内的吸光度；通过约700 nm和790 nm处的特征吸收峰确认ICG的存在8（图D）。</li>
	<li>使用荧光分光光度计（Fluorolog 3, Jobin-Yvon），在620 nm激发波长下激发OVG溶液，可在约700 nm和约800 nm处观察到典型的ICG荧光发射峰（图D）。</li>
</ol>
7. 代表性结果
<img alt="电子显微镜图像，显示病毒颗粒分布及详细的结构形态。" src="/files/ftp_upload/3645/3645figA.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 A"> 
图 A. 通过农杆菌浸润法将三种野生型BMV农杆菌构建体混合物转入本氏烟（N. benthamiana）植株后纯化的BMV病毒颗粒的透射电子显微镜（TEM）图像（比例尺 = 100 nm）。
<img alt="Chromatography method, green substance in test tube, separation process diagram." src="/files/ftp_upload/3645/3645figB.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure B"> 
图 B。 沉淀物 体外 高速离心后收集含有ICG的OVG。
<img alt="用于病毒学研究中结构分析的病毒颗粒电子显微镜图像。" src="/files/ftp_upload/3645/3645figC.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 C"> 
图 C. 负染ICG包埋OVG的透射电子显微镜图像（比例尺 = 100 nm）。
<img alt="光学病毒鬼影光谱；吸光度和荧光图谱；波长分析。" src="/files/ftp_upload/3645/3645figD.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 D"> 
图 D. OVGs 的吸光度（上图）和荧光（下图）光谱。OVGs 发射所用的激发波长为 620 nm。

<ol><li>Annamalai, P., Rao, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replication-independent+expression+of+genome+components+and+capsid+protein+of+brome+mosaic+virus+in+planta%3A+a+functional+role+for+viral+replicase+in+RNA+packaging%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Replication-independent expression of genome components and capsid protein of brome mosaic virus in planta: a functional role for viral replicase in RNA packaging.</a> Virology. 338, 96-111 (2005).</li>
<li>Annamalai, P., Rofail, F., Demason, D. A., Rao, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replication-coupled+packaging+mechanism+in+positive-strand+RNA+viruses%3A+synchronized+coexpression+of+functional+multigenome+RNA+components+of+an+animal+and+a+plant+virus+in+Nicotiana+benthamiana+cells+by+agroinfiltration%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Replication-coupled packaging mechanism in positive-strand RNA viruses: synchronized coexpression of functional multigenome RNA components of an animal and a plant virus in Nicotiana benthamiana cells by agroinfiltration.</a> J. Virol. 82, 1484-1495 (2008).</li>
<li>Annamalai, P., Rao, A. L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAnnamalai%2C+P+%22Plant+Virology+Protocols%22">Plant Virology Protocols</a>. Foster, N., Johansen, H. 451, Humana Press. 251-264 (2008).</li>
<li>Lane, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+bromoviruses%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Virus+Res%22%5BJournal%5D)">The bromoviruses.</a> Adv. Virus Res. 19, 151-220 (1974).</li>
<li>Choi, Y. G., Rao, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+studies+on+bromovirus+capsid+protein.+VII.+Selective+packaging+on+BMV+RNA4+by+specific+N-terminal+arginine+residuals%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Molecular studies on bromovirus capsid protein. VII. Selective packaging on BMV RNA4 by specific N-terminal arginine residuals.</a> Virology. 275, 207-217 (2000).</li>
<li>Sambrrok, J., Russel, D. W. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSambrrok%2C+J+%22Molecular+Cloning.+A+Laboratory+Manual%22">Molecular Cloning. A Laboratory Manual</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2001).</li>
<li>Dreher, T. W., Rao, A. L., Hall, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replication+in+vivo+of+mutant+brome+mosaic+virus+RNAs+defective+in+aminoacylation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Replication in vivo of mutant brome mosaic virus RNAs defective in aminoacylation.</a> J. Mol. Biol. 206, 425-438 (1989).</li>
<li>Jung, B., Rao, A. L., Anvari, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+nano-constructs+composed+of+genome-depleted+brome+mosaic+virus+doped+with+a+near+infrared+chromophore+for+potential+biomedical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22A.C.S.+Nano%22%5BJournal%5D)">Optical nano-constructs composed of genome-depleted brome mosaic virus doped with a near infrared chromophore for potential biomedical applications.</a> A.C.S. Nano. 5, 1243-1252 (2011).</li>
<li>Voinnet, O., Lederer, C., Baulcombe, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+viral+movement+protein+prevents+spread+of+the+gene+silencing+signal+in+Nicotiana+benthamiana%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A viral movement protein prevents spread of the gene silencing signal in Nicotiana benthamiana.</a> Cell. 103, 157-167 (2000).</li>
<li>Wroblewski, T., Tomczak, A., Michelmore, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+Agrobacterium-mediated+transient+assays+of+gene+expression+in+lettuce%2C+tomato+and+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Biotechnol.+J%22%5BJournal%5D)">Optimization of Agrobacterium-mediated transient assays of gene expression in lettuce, tomato and Arabidopsis.</a> Plant Biotechnol. J. 3, 259-273 (2005).</li>
</ol>

我们无任何披露事项。

此处介绍的农杆菌浸润法可广泛适用于多种植物病毒。该方法的一个显著特征是能够将多个农杆菌载体同步递送至同一细胞，从而克服了常规使用的植物病毒机械接种法通常存在的主要缺陷。 在体 和 体外 以溴化花叶病毒为模型的组装研究，若遵循一些技巧，可高效开展。（i）为成功进行浸润 N. benthamiana 叶片，在渗透前24小时内不要给植物浇水；（ii）若在下午4至5点之间进行渗透，农杆菌悬浮培养液将更容易扩散至细胞间隙；（iii）培养液在OD600处的光密度值不应超过1.0600高密度农杆菌培养物的侵染已知会引发细胞毒性及叶片衰老9,10 这可能严重影响病毒复制及后续的病毒粒子形成；（iv）在渗透过程中，应轻轻按压叶片的远轴面，以防止对叶片造成严重损伤，从而避免触发植物的免疫反应；（v）可通过将最高浓度与最低浓度的蔗糖相加后除以2的方法，在离心管中用BMV悬浮缓冲液配制10%至40%的25%蔗糖密度梯度 即，10% + 40% / 2 = 25%），立即于 -80 °C 冻结 2–4 小时，随后将蔗糖溶液直立放置于 4 °C 过夜...

<table><tbody><tr><td>MES 钠盐</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2993</td><td></td></tr><tr><td>吲哚菁绿</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I2633</td><td></td></tr><tr><td>贝克曼超速离心机</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td>型号：L8-70M</td><td></td></tr><tr><td>Centricon-100 柱</td><td>EMD Millipore</td><td>YM-100</td><td></td></tr><tr><td>分光光度计</td><td>Varian, Inc.</td><td>部件号 10068900</td><td></td></tr><tr><td>荧光分光光度计</td><td>Fluorolog 3, Jobin-Yvon.</td><td>部件号 FL3-21</td><td></td></tr></tbody></table>

简单且可靠的 in vivo 与 in vitro 研究病毒组装的方法

Simple and Robust in vivo and in vitro Approach for Studying Virus Assembly

在感染人类、动物和植物的正链RNA病毒中，子代病毒颗粒被包裹形成成熟且稳定的病毒粒子是其在特定宿主中建立感染的关键阶段。因此，对包裹过程的研究有助于揭示调控病毒组装以形成具有感染性病毒粒子的机制。这类信息对于制定抑制病毒传播和控制疾病的新方法至关重要。病毒包裹过程可被研究 体内 和 体外基因组包装 体内 是一个高度调控的、选择性过程，涉及大分子相互作用和亚细胞区室化。因此，研究病毒衣壳化所涵盖的事件至关重要 体内 将为理解病毒如何增殖和组装提供基础知识。近期 体外 衣壳化已被广泛应用于生物医学成像及治疗领域的研究。在这一探索进程中，非包膜植物病毒处于领先地位 体外 负电荷外源物质的衣壳化。麦芽花叶病毒（Brome mosaic virus, BMV）是一种对植物具有致病性的无包膜多组分RNA病毒，已被用作研究基因组包装的模型系统。 体内 和 体外用于包封实验的 烟草本氏 植物， 农杆菌 介导的瞬时表达，称为农杆菌浸润（agroinfiltration），是一种高效且可靠的同步递送多个组分并在同一细胞中表达的技术。该方法中，将含有相应组分的农杆菌悬浮液 Agrobacterium tumefaciens 将含有目标病毒mRNA cDNA的双元质粒载体导入农杆菌，再利用1 ml一次性注射器（无针头）将其注入植物叶片的细胞间隙。该过程可将DNA插入片段转移至植物细胞内；T-DNA插入片段在细胞核中短暂存在，并由宿主RNA聚合酶II转录，从而实现瞬时表达。所产生的mRNA转录本（具有5'端帽子结构和3'端多聚腺苷酸尾）随后被转运至细胞质中进行翻译。在侵染后约24至48小时，可取侵染区域的叶片组织用于显微观察或生化分析。农杆菌介导的瞬时转化可实现大量细胞（数百至数千个）的同步转染。对于体外衣壳化实验，首先通过透析含有氯化钙的解离缓冲液，将纯化的苜蓿花叶病毒（BMV）病毒颗粒解离为衣壳蛋白，再经离心去除RNA及未完全解离的病毒颗粒。随后，基因组缺失的衣壳蛋白亚基可与目标病毒基因组组分或非病毒组分（如吲哚菁染料）重新组装形成新的病毒样颗粒。

一种简单、高效且稳健的方法，通过同步递送多种病毒组分至植物细胞 农杆菌介导的瞬时表达方法被描述。该方法适用于研究复制、衣壳化，随后的 体外 非病毒组分的重装配，形成基因组耗尽的光学病毒幽灵，适用于生物医学应用。

在对人类、动物和植物具有致病性的正链RNA病毒基因组中，子代病毒颗粒被包裹形成成熟且稳定的病毒粒子是至关重要的……

本实验的总体目标是研究病毒在体内和体外的组装过程。首先在细菌中表达芜菁花叶病毒（bro mosaic virus）RNA，并通过农杆菌浸润法将其导入植物细胞，以此实现上述目标。随后，从浸润过的叶片中纯化BMV病毒颗粒。然后制备用于体外组装的衣壳蛋白亚基。最后，利用衣壳蛋白和吲哚菁绿染料在体外组装燕麦花叶病毒（BMV）变体。最终结果表明，通过光学幻影的形成，可观察到体外组装的燕麦花叶病毒变体，该现象可通过荧光吸收和发射来确定。今天，我们将介绍一种称为过滤法的技术，该技术可用于向植物递送病毒组分。这种方法的主要优势在于无需制备体外转录本，同时能够将多个组分递送到同一个细胞中，从而实现同步感染。我们目前开展的研究工作是利用芜菁花叶病毒与一种经美国食品药品监督管理局（FDA）批准的氰基绿色素分子结合，构建一种新型纳米颗粒，用于生物医学应用。具体而言，我们的目标是将这些结构用作光学导线幽灵（或称OB gs），应用于包括荧光成像和光声成像在内的光学成像技术，同时也将其作为激光治疗的载体。我们目前正在探索的一项具体临床应用是，在术中操作过程中利用这些结构对卵巢癌进行成像。其核心思路在于，我们可以对这些结构进行功能化修饰。具有特异性靶向基序的OBG可识别残留的肿瘤细胞，在卵巢癌的情况下，这些细胞可能尤其存在于腹腔内。从先前制备的含有烟草脆裂病毒RNA的农杆菌平板中，挑取单克隆接种于2毫升LB培养基中，该培养基含有50微克/毫升卡那霉素和100微克/毫升利福平。将培养物在28°C、250 RPM的摇床中培养一天。次日，取1毫升菌液接种至50毫升LB培养基（置于500毫升锥形瓶中），在28°C、250 RPM的摇床中继续培养16小时。当菌液在600 nm处的光密度（OD600）达到1.0时，将菌液转移至无菌的30毫升离心管中，离心10分钟。在5,000 RPM和4摄氏度条件下，将沉淀物溶于10毫升含10毫摩尔氯化镁的溶液中，并在5,000 RPM和4摄氏度下离心10分钟。重复此步骤一次，以确保完全去除抗生素。接下来，将沉淀物悬浮于10毫升缓冲液中，该缓冲液含有10毫摩尔2-(N-吗啉代)乙磺酸（MES）和10毫摩尔氯化镁。测定每种培养物在600 nm处的光密度（OD 600），并使用10毫摩尔氯化镁和10毫摩尔MES将OD 600调整至0.1。然后混合三种OD 600为0.1的培养悬浮液各10毫升。加入苯乙酮，使其终浓度为100毫摩尔。轻轻混匀，并在室温下静置反应三小时。孵育结束后，将菌液吸入一支1毫升无针头的注射器中。通过轻压注射器，将菌液悬浮液渗透至2至3片充分展开的N. benthamiana叶片的近轴面，注射位置位于每片叶片远轴面的一侧。将接种后的植物置于24摄氏度的温室中培养三至四天，然后收获叶片。纯化BMV病毒颗粒后，配制一升1倍病毒解离缓冲液。接着，准备透析膜。根据 Sambrook 等人的方法，将每毫升含 5 至 10 毫克纯化病毒的溶液加入透析袋中，并将透析袋置于含有 1 × 病毒解离缓冲液的烧瓶中。在 4°C 条件下搅拌透析 24 小时。收集透析袋中的溶液，在4 °C条件下以30,000 RPM离心30分钟，使未结合的病毒颗粒沉淀。将上清液在4 °C条件下以30,000 RPM离心3小时。在制备好将重新组装成病毒颗粒的RNA转录本后，按1:5的比例混合衣壳蛋白亚基与RNA转录本。将混合物装入透析袋中，并妥善密封以防止任何泄漏。在配制好一升一倍RNA组装缓冲液后，于次日在4°C条件下将重组反应混合物在该缓冲液中透析24小时，随后从透析袋中取出混合物，加入1.5毫升RNA组装缓冲液，再于4°C以30,000 RPM离心三小时。然后弃去上清液，重悬沉淀。接下来，在 260 纳米波长处测定病毒颗粒浓度。然后在 280 纳米波长处或其他方法（如 Bradford 法）测定衣壳蛋白亚基的浓度，以评估解离后衣壳蛋白亚基的完整性。进行 12% 至 15% 的 SDS-PAGE 电泳，随后进行蛋白质印迹分析。最后，按照书面实验方案中所述的步骤制备光学病毒空壳（optical viral ghosts）或 ov cheese。图中所示为透射电子显微镜图像，样本为从农杆菌浸润了三种野生型 BMV 农杆菌构建体混合物的 end hamana 植物中纯化的负染色 BMV Varion。该透射电镜图像显示了含有吲哚菁绿的负染色光学病毒空壳结构。此处展示了光学病毒空壳的吸收光谱和荧光光谱，条件为技术熟练掌握后。每份样品的操作可在五分钟内完成。观看本视频后，您应能充分理解如何将病毒或非病毒组分包裹进衣壳蛋白亚基中。

simple-robust-vivo-vitro-approach-for-studying-virus

Research

科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

简单而强大在体内和在体外方法研究病毒大会

来源：Olety, B., et. al., 可视化HIV-1 Gag与巨大单层囊泡（GUV）膜的结合。 J. Vis. Exp.

在巨大单层囊泡膜上可视化病毒结构蛋白的组装

本文介绍了一种利用透射电子显微镜在液体环境中以纳米级分辨率对病毒复合物进行成像的方法。...

原位 液相中生物组装体的透射电子显微镜观察

病毒颗粒附着于表面是通过超分辨率荧光成像或原子力显微镜（AFM）进行单病毒颗粒成像的前提条件。本文展示了一种用于实现病毒颗粒在玻璃表面可控黏附的样品制备方法，适用于原子力显微镜和超分辨率荧光成像。...

单病毒颗粒原子力显微镜与超分辨率荧光成像的样品制备

本文介绍了冷冻电子显微镜技术，该方法可用于获得大分子在接近天然状态下的高质量显微图像。该技术所获得的图像适用于后续基于单颗粒分析方法的计算机处理，以实现大分子的三维结构重建。...

冷冻电镜技术的注意事项：大分子三维重构的样品制备与高质量数据采集入门指南

利用病毒基因组扩增的常规检测方法受限于无法区分具有感染性与非感染性的病毒颗粒。本文旨在提供详细的实验方案，介绍利用适配体结合、动态光散射和透射电子显微镜等替代方法，以辅助区分具有感染性的诺如病毒颗粒。...

替代方法 体外 病毒衣壳结构完整性的测定方法

采用相关联的光镜与电镜显微技术（CLEM），通过电子显微镜（EM）对先前经光镜（LM）筛选出的细胞中病毒诱导产生的细胞内结构进行成像。将光镜与电镜结合为一种混合成像方法，以实现对病毒与宿主相互作用的整合性观察。...

用于追踪和成像冷冻固定细胞中病毒蛋白相关结构的关联光镜与电镜技术

为深入分析呼吸道合胞病毒（RSV）RNA合成的分子机制，我们报告了一种利用分子伴侣磷酸化蛋白（P）共表达无RNA的核蛋白（N）的实验方案0用于后续 体外...

呼吸道合胞病毒特异性核衣壳的生成与组装

本文描述了制备适用于在纳米尺度下通过透射电子显微镜进行液相电镜和冷冻电镜分析的病毒组装体的实验方案。...

在液体和冰中推进病毒组装的高分辨率成像

我们介绍了一种使用荧光蛋白mScarlet进行Epon包埋后共聚焦光镜与电镜联用的详细实验方案。该方法能够同时保持荧光信号与超微结构的完整性，适用于多种生物学研究应用。...

环氧树脂包埋后关联光学与电子显微镜技术

本视频方案演示了如何对病毒学样本进行扫描透射电子显微镜断层成像。为获得最佳结果，样本需通过高压冷冻及后续的冷冻置换方法进行制备。...

病毒学中的扫描透射电子显微镜断层成像：高压冷冻-冷冻置换样品的三维成像

学习利用农杆菌介导瞬时表达技术同步递送病毒组分，研究雀麦花叶病毒在植物细胞内的组装过程。该方法可制备光学病毒幽灵，用于生物医学成像与药物递送应用。

简单且可靠的 in vivo 与 in vitro 研究病毒组装的方法

探索更多视频