丝绸电影文化系统在体外分析和生物材料设计

该程序的总体目标是建立丝膜体外培养系统。这是通过首先生产用于制造所需薄膜的丝绸溶液来实现的。第二步是将丝溶液浇铸到硅橡胶成型表面上，让薄膜干燥。

随后对丝膜进行处理，用于细胞培养。接下来，使用无菌技术组装培养系统。最后一步是用所需的细胞类型接种丝膜。

最终，丝膜培养表面可以直接成像或在培养物中进行分析。可以根据需要取出板或样品进行固定和进一步处理。与现有方法（例如在标准组织培养塑料上培养）相比，该技术的主要优点是丝膜生物材料具有高度的生物相容性，并且研究人员可以很容易地将其转移到下游体内和体外应用中。

该方法可用于回答细胞生物学和生物材料领域的关键问题，例如如何使用表面拓扑结构来影响细胞反应？虽然这种方法可以提供对角膜上皮反应的见解，但它也可以应用于其他系统，在这些系统中，初始体外实验可以为更复杂的体内系统提供初步答案。要开始制造硅橡胶模具，请获得所需的铸造形貌表面对于本演示。

使用标准的 100 毫米蚀刻硅晶片。PDMS 灌封和催化剂溶液的比例为 9：1，由购买的套件提供。将溶液充分混合以开始固化过程。

将硅晶片表面放置在铸盘中后，称取 4.5 克 PDMS 溶液到硅晶片上。PDMS 溶液均匀分布在晶圆上后，用直径为 100 毫米的培养皿盖住晶圆，并将其置于 10 毫米汞柱上放置两个小时。要从 PDMS 溶液中脱气气泡，第二天将浇注装置放在 60 摄氏度烘箱中的平面上过夜，将固化的 PDMS 硅晶片放入 100% 乙醇浴中。

在移除 PDMS 之前，使用剃须刀片使用镊子提起圆周边缘，开始从晶圆上去除 PDMS在 100% 乙醇浴中轻轻拉下 PDMS。注意不要撕裂硅橡胶铸件，使用 14 毫米的打孔器冲出单个 PDMS 模具。此直径设计用于 24 孔板的孔。

要制备蚕丝溶液，请将两升蒸馏水煮沸。在玻璃扬声器中，将 5 克 bombex 毛利蚕茧切成三等份，丢弃广泛污染的茧，如茧内表面覆盖过多的昆虫颗粒所示。将 4.24 克碳酸钠慢慢加入沸水量中，以防止沸腾。

碳酸钠溶解后，将茧块加入沸水中，用涂有特氟龙的搅拌棒搅拌 40 分钟。煮沸后，小心地将蒸馏水排入水槽中，然后用手拧干蚕丝提取物以去除多余的水分。然后将蚕丝提取物放入装有一升蒸馏水的塑料烧杯中搅拌 20 分钟，将其清洗。

用淡水重复此洗涤过程两次。用手将水洗过的蚕丝提取物环出，然后将蚕丝纤维提取物放入化学罩中，让其干燥 12 小时。第二天，称量干燥的丝纤维，通常约为 3.5 克。

然后根据书面方案为 20% 重量体积的丝绸溶液制备 9.3 摩尔的溴化锂溶液。将蚕丝提取物放入烧杯中后。将溴化锂溶液倒在丝纤维上。

确保丝纤维浸入溶液中。使用实验室刮刀，然后将溶解的真丝放入 60 摄氏度的烤箱中 4 小时。4 小时后，使用适当大小的注射器吸取 12 毫升的丝溶液。

放置 18 号针头后。在注射器的末端，将溶液注入透析盒中。填充包埋盒后，用排空的注射器将剩余的空气从包埋盒中抽出。

将装满的透析盒放入 1 升蒸馏水中。1 小时、4 小时、8 小时后换水，然后每 12 小时换 3 次，共换 6 次。透析后。

用注射器从暗盒中缓慢收集丝溶液，然后转移到离心管中。离心后，将溶液以 10， 000 g 和 4 摄氏度离心 20 分钟。将 super natin 放入新试管中。

第二次重复此过程后，将两个 0.5 毫升丝溶液样品移液到单独的小乳清培养皿中。将乳清盘放入 60 摄氏度的干燥烤箱中 12 小时或直到丝溶液驱动。散装蚕丝溶液可在 4 摄氏度下储存。

称量两个样品中剩余的固体丝膜，以测量溶液的丝蛋白浓度密度。使用透明胶带去除任何灰尘，准备 PDMS 铸造表面。接下来，将 PDMS 底物浸泡在 100% 乙醇中 1 分钟，以清洁它们。

然后取下它们并晾干。为了生产 50 微米厚的薄膜，将 70 微升 8% 丝溶液涂抹在 PDMS 模具上。使用液体涂抹工具（如 1 毫升注射器尖端），以 150 帕斯卡的气流压力运行 90 分钟或直到薄膜干燥，让丝绸薄膜在层流洁净工作台上干燥。

薄膜干燥后，将包括 PDMS 模具在内的整套薄膜放入水室和跪室中 4 小时以上，以产生不溶于水的薄膜。这通常是一个空的干燥室，盆底有水，从水和跪室中取出丝膜后，以 25 k帕的真空拉动。在层流洁净工作台上工作，在 35 毫米培养皿中制备 70% 乙醇浴。

然后将任何对照基质和不锈钢环放入培养皿中至少 10 分钟，以便对其进行消毒。接下来，使用镊子从 PDMS 模具中取出丝膜。将它们浸入 70% 乙醇中，并将每层薄膜放入预装有 1 毫升 70% 乙醇的 24 孔板的单个孔中。

确保图案面朝上以允许细胞粘附 为确保此步骤成功，重要的是将丝膜正确无菌地放置在孔内 将不锈钢环放在 SILT 薄膜的顶部，让它们孵育 10 分钟 按照文中的说明进行样品清洗后， 按照那里的指示准备细胞系就座。在该演示中，使用人角膜缘上皮细胞系作为最后一步，每孔采样 500 微升 HCLE 悬浮液，通常使用每平方厘米 10， 000 个细胞的密度，然后继续运行所需的实验方案。这里显示的是 HCLE 细胞系的扫描电子显微照片，在第 2 天粘附在有图案的扁平丝膜上。

在培养物 HCLE 中，培养物继续增殖，到第 8 天在有图案的平坦表面上汇合。在这里的培养中，有图案和扁平的丝膜培养，在第 1 天、第 4 天和第 8 天将 HCLE 细胞与玻璃对照基质进行比较。在使用 SQU 进行培养定量时，核酸含量和 MTT 代谢活性测定数据表明，与玻璃对照表面相比，HCLE 在图案和平面丝膜基材上的活力随时间变化。

这里显示的是 HCLE 细胞在图案化丝膜表面迁移的延时相差成像。在 18 小时的时间内，将细胞以每平方厘米 10， 000 个细胞的密度放置并培养 2 小时，然后成像以进行比较 在相同培养条件下，在 18 小时内显示了 HCLE 细胞在平坦对照表面上迁移的相差成像。一旦准备好丝溶液和硅胶成型，如果执行得当，这项技术可以在八小时内完成 遵循此程序。

可以评估其他方法，如免疫荧光扫描、电子显微镜和分子生物学技术，如蛋白质印迹和免疫测定，以及化学测定，如细胞活力、细胞增殖和代谢率，以更好地了解细胞对这些不同定制设计服务的反应。看完这个视频，你应该对如何制作蚕丝解决方案、创建定制图案、丝绸薄膜和文化有一个很好的了解。这些底物上的任何细胞类型。