Name: 使用γ-干扰素酶酶联免疫检测的特点人类乳头状瘤病毒的新型T-细胞表位 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-03-08T12:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 41 s
Description: 学习使用γ-干扰素酶联免疫斑点法分离和鉴定HPV抗原特异性T细胞克隆的方法。该技术可识别新型T细胞表位，有助于疫苗开发和免疫治疗策略的研究。

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本研究由美国癌症协会学者奖（RSG-06-180-01-MBC）以及美国国立卫生研究院基金（R01 CA143130 和 UL1RR029884）资助。

<ol><li>Nakagawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+favorable+clinical+trend+is+associated+with+CD8+T-cell+immune+responses+to+the+human+papillomavirus+type+16+e6+antigens+in+women+being+studied+for+abnormal+pap+smear+results%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Low.+Genit.+Tract+Dis%22%5BJournal%5D)">A favorable clinical trend is associated with CD8 T-cell immune responses to the human papillomavirus type 16 e6 antigens in women being studied for abnormal pap smear results.</a> J. Low. Genit. Tract Dis. 14, 124-129 (2010).</li>
<li>Walls, E., Crawford, L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWalls%2C+E+%22Lymphocytes%3A+A+practical+approach%22">Lymphocytes: A practical approach</a>. Klaus, G. G. B. , IRL Press. 149-149 (1987).</li>
<li>Nakagawa, M., Kim, K. H., Moscicki, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patterns+of+CD8+T-cell+epitopes+within+the+human+papillomavirus+type+16+%28HPV+16%29+E6+protein+among+young+women+whose+HPV+16+infection+has+become+undetectable%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Diagn.+Lab+Immunol%22%5BJournal%5D)">Patterns of CD8 T-cell epitopes within the human papillomavirus type 16 (HPV 16) E6 protein among young women whose HPV 16 infection has become undetectable.</a> Clin. Diagn. Lab Immunol. 12, 1003-1005 (2005).</li>
<li>Wang, X., Santin, A. D., Bellone, S., Gupta, S., Nakagawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+CD4+T-cell+epitope+described+from+one+of+the+cervical+cancer+patients+vaccinated+with+HPV+16+or+18+E7-pulsed+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Immunol.+Immunother%22%5BJournal%5D)">A novel CD4 T-cell epitope described from one of the cervical cancer patients vaccinated with HPV 16 or 18 E7-pulsed dendritic cells.</a> Cancer Immunol. Immunother. 58, 301-308 (2009).</li>
<li>Larsson, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+recombinant+vaccinia+virus+based+ELISPOT+assay+detects+high+frequencies+of+Pol-specific+CD8+T+cells+in+HIV-1-positive+individuals%5BTitle%5D)+AND+%22AIDS%22%5BJournal%5D)">A recombinant vaccinia virus based ELISPOT assay detects high frequencies of Pol-specific CD8 T cells in HIV-1-positive individuals.</a> AIDS. 13, 767-777 (1999).</li>
<li>Nakagawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytotoxic+T+lymphocyte+responses+to+E6+and+E7+proteins+of+human+papillomavirus+type+16%3A+relationship+to+cervical+intraepithelial+neoplasia%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">Cytotoxic T lymphocyte responses to E6 and E7 proteins of human papillomavirus type 16: relationship to cervical intraepithelial neoplasia.</a> J. Infect. Dis. 175, 927-931 (1997).</li>
<li>Wang, X., Moscicki, A. B., Tsang, L., Brockman, A., Nakagawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Memory+T+cells+specific+for+novel+human+papillomavirus+type+16+%28HPV16%29+E6+epitopes+in+women+whose+HPV16+infection+has+become+undetectable%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Vaccine+Immunol%22%5BJournal%5D)">Memory T cells specific for novel human papillomavirus type 16 (HPV16) E6 epitopes in women whose HPV16 infection has become undetectable.</a> Clin. Vaccine Immunol. 15, 937-945 (2008).</li>
<li>Evans, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antigen+processing+defects+in+cervical+carcinomas+limit+the+presentation+of+a+CTL+epitope+from+human+papillomavirus+16+E6%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Antigen processing defects in cervical carcinomas limit the presentation of a CTL epitope from human papillomavirus 16 E6.</a> J. Immunol. 167, 5420-5428 (2001).</li>
<li>Shi, Y., Smith, K. D., Kurilla, M. G., Lutz, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytotoxic+CD8%2B+T+cells+recognize+EBV+antigen+but+poorly+kill+autologous+EBV-infected+B+lymphoblasts%3A+immunodominance+is+elicited+by+a+peptide+epitope+that+is+presented+at+low+levels+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Cytotoxic CD8+ T cells recognize EBV antigen but poorly kill autologous EBV-infected B lymphoblasts: immunodominance is elicited by a peptide epitope that is presented at low levels in vitro.</a> J. Immunol. 159, 1844-1852 (1997).</li>
<li>Varadarajan, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-throughput+single-cell+analysis+of+human+CD8%2B+T+cell+functions+reveals+discordance+for+cytokine+secretion+and+cytolysis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">A high-throughput single-cell analysis of human CD8+ T cell functions reveals discordance for cytokine secretion and cytolysis.</a> The Journal of Clinical Investigation. , (2011).</li>
<li>Nakagawa, M., Kim, K. H., Moscicki, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Different+methods+of+identifying+new+antigenic+epitopes+of+human+papillomavirus+type+16+E6+and+E7+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Diagn.+Lab+Immunol%22%5BJournal%5D)">Different methods of identifying new antigenic epitopes of human papillomavirus type 16 E6 and E7 proteins.</a> Clin. Diagn. Lab Immunol. 11, 889-896 (2004).</li>
<li>Nakagawa, M., Kim, K. H., Gillam, T. M., Moscicki, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HLA+class+I+binding+promiscuity+of+the+CD8+T-cell+epitopes+of+human+papillomavirus+type+16+E6+protein%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">HLA class I binding promiscuity of the CD8 T-cell epitopes of human papillomavirus type 16 E6 protein.</a> J. Virol. 81, 1412-1423 (2007).</li>
<li>Brown, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+cell+epitope+%22hotspots%22+on+the+HIV+Type+1+gp120+envelope+protein+overlap+with+tryptic+fragments+displayed+by+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22AIDS+Res.+Hum.+Retroviruses%22%5BJournal%5D)">T cell epitope "hotspots" on the HIV Type 1 gp120 envelope protein overlap with tryptic fragments displayed by mass spectrometry.</a> AIDS Res. Hum. Retroviruses. 21, 165-170 (2005).</li>
<li>Masemola, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+and+promiscuous+CTL+epitopes+in+conserved+regions+of+Gag+targeted+by+individuals+with+early+subtype+C+HIV+type+1+infection+from+southern+Africa%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Novel and promiscuous CTL epitopes in conserved regions of Gag targeted by individuals with early subtype C HIV type 1 infection from southern Africa.</a> J. Immunol. 173, 4607-4617 (2004).</li>
<li>Walker, B. D., Korber, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+control+of+HIV%3A+the+obstacles+of+HLA+and+viral+diversity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Immune control of HIV: the obstacles of HLA and viral diversity.</a> Nat. Immunol. 2, 473-475 (2001).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

传统上，免疫学家通过在体外（in vitro）刺激感兴趣的T细胞，并进行极限稀释实验以分离出表位特异性的T细胞克隆，从而鉴定新的T细胞表位。随后使用铬释放实验对T细胞克隆进行表征8,9。然而，许多尝试均未成功，原因可能是T细胞频率过低而无法分离，或可用于完成表征的T细胞克隆数量不足。本文所述方法通过以下方式克服了这些限制：（1）评估是否存在足够数量的感兴趣T细胞；（2）基于干扰素-γ（IFN-γ）的分泌情况富集目标T细胞，提高其频率；（3）采用ELISPOT实验，将自体淋巴母细胞样细胞系（LCLs）与T细胞克隆共同接种，从而仅需少量T细胞克隆细胞即可完成分析。图2展示了一个ELISPOT实验的示例，该实验不仅用于确定潜在T细胞表位所在的区域，还可用于评估表位特异性T细胞的频率。通过从目标区域的斑点形成单位数中减去无肽阴性对照的斑点形成单位数，即可估算出表位特异性T细胞的数量。将该频率乘以仍可用于分析的细胞数，即可得到表位特异性T细胞的估计总数。根据我们的经验，若该数值≥2,500个细胞，则值得继续后续实验。随后可使用市售的磁分离试剂盒，基于IFN-γ的分泌情况分离...

<table><tbody><tr><td>CD8 T细胞分离试剂盒</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-094-156</td><td></td></tr><tr><td>植物血凝素</td><td>Remel, Thermo Fisher Scientific</td><td>R-30852801</td><td>2mg/瓶</td></tr><tr><td>Yssel&amp;rsquo;s 培养基</td><td>Gemini Bio Products</td><td>400-102</td><td>含1%混合人血清</td></tr><tr><td>96孔圆底培养板</td><td>BD Biosciences</td><td>08-772-17</td><td></td></tr><tr><td>重组人IL-2</td><td>R&amp;D Systems</td><td>202-IL-050</td><td>50&amp;#x03BC;g</td></tr><tr><td>24孔培养板</td><td>Corning</td><td>07-200-84</td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液</td><td>Cellgro</td><td>MT-21-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>抗IFN-&amp;#947;单克隆抗体（D1K）</td><td>Mabtech</td><td>3420-3-1000</td><td></td></tr><tr><td>生物素标记的抗IFN-&amp;#947;单克隆抗体（7B-6）</td><td>Mabtech</td><td>3420-6-1000</td><td></td></tr><tr><td>多孔HA ELISPOT板</td><td>EMD Millipore</td><td>MAHA S45 10</td><td></td></tr><tr><td>二甲基亚砜</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650</td><td>100 ml 瓶装</td></tr><tr><td>混合人血清</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S40510H</td><td>需热灭活</td></tr><tr><td>RPMI 1640培养基</td><td>Cellgro</td><td>MT-10-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>吐温-20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2287-100ml</td><td></td></tr><tr><td>Vectastain Elite ABC试剂盒</td><td>Vector Laboratories</td><td>NC9313719</td><td></td></tr><tr><td>稳定型二氨基联苯胺</td><td>Open Biosystems</td><td>MBI 1241</td><td></td></tr><tr><td>AID EliSpot Reader Classic</td><td>Autoimmun Diagnostika GmbH</td><td>ELR06</td><td></td></tr></tbody></table>

使用干扰素-γ酶联免疫斑点试验表征人乳头瘤病毒新型t细胞表位

Use of Interferon-&gamma; Enzyme-linked Immunospot Assay to Characterize Novel T-cell Epitopes of Human Papillomavirus

已开发出一种实验方案，用于克服分离和表征针对引起局部感染病原体（如人乳头瘤病毒（HPV））的稀有T细胞所面临的困难。该方案包括：确定来自受试者体内HPV蛋白中包含T细胞表位的区域，根据干扰素-γ（IFN-γ）的分泌情况筛选出肽特异性T细胞，并培养和表征T细胞克隆（图1）。受试者1是一名近期经活检确诊为高级别鳞状上皮内病变，并在采集T细胞当天接受了环形电切术治疗的患者1。通过使用重叠合成肽进行干扰素-γ（IFN-γ）酶联免疫斑点（ELISPOT）检测，鉴定出人乳头瘤病毒16型（HPV 16）E6和E7蛋白中包含T细胞表位的区域（图2）。该检测结果不仅用于确定含有T细胞表位的区域，还用于估算表位特异性T细胞的数量，并利用市售磁珠（CD8 T细胞分离试剂盒，Miltenyi Biotec，Auburn CA）根据IFN-γ的分泌情况分离这些细胞。将筛选出的IFN-γ分泌型T细胞进行稀释后，单个接种于含有经辐照的饲养细胞混合物的培养体系中，以支持每个孔中单个T细胞的生长。随后使用IFN-γ ELISPOT检测对这些T细胞克隆进行筛选，检测时加入覆盖已鉴定区域的肽段以及自体EB病毒转化的B淋巴母细胞样细胞系（LCLs，制备方法参见Walls和Crawford的描述）2，以最大限度减少所需T细胞克隆的数量。与ELISPOT检测中通常使用的每孔1×105个细胞相比1,3，本实验仅使用1,000个T细胞克隆细胞与1×105个自体LCLs共培养，显著减少了所需T细胞克隆的数量。自体LCLs不仅能够向T细胞克隆呈递肽抗原，还能维持孔内较高的细胞密度，从而促进表位特异性T细胞克隆分泌IFN-γ，确保IFN-γ ELISPOT检测的成功进行。同样，利用IFN-γ ELISPOT检测进一步确定了CD8 T细胞表位（HPV 16 E6 52-61 FAFRDLCIVY）的最小及最优氨基酸序列及其HLA I类限制性分子（B58）。此外，还使用表达HPV 16 E6或E7蛋白的痘苗病毒感染的自体LCLs进行IFN-γ ELISPOT检测，结果显示该E6 T细胞表位可在细胞内源性加工处理。实验还证实了该T细胞表位对其他高危型HPV同源表位的交叉识别能力。该方法也可用于描述CD4 T细胞表位4。

对引起局部感染的病原体（如人乳头瘤病毒）的T细胞表位进行表征具有挑战性，原因是循环中的T细胞数量有限。本文描述了一种方法，该方法从极少量细胞开始，分离并表征稀有的T细胞。

使用干扰素-γ酶联免疫斑点试验表征人乳头瘤病毒新型T细胞表位

已开发出一种实验方案，以克服分离和表征针对病原体（如人类……）的稀有T细胞所面临的困难

本实验的总体目标是从患者体内分离、培养并分析HPV抗原特异性的T细胞克隆。首先，建立CD8 T细胞系，进行SBOT检测并估算抗原特异性T细胞的频率。随后，根据干扰素γ的分泌情况分离抗原特异性T细胞克隆，再通过高通量筛选干扰素γ SBOT检测，鉴定出表位特异性的T细胞克隆。继续对T细胞克隆进行表征，以确定其最短最优肽段。表位序列还决定了该表位是否可被内源性加工处理。鉴定HLA限制性元件，并评估其对其他高危型HPV的交叉反应性。最终目标是通过筛选和表征来自患者的特异性T细胞中的抗原特异性T细胞，鉴定出新颖且具有临床意义的HPV T细胞表位。与使用LY实验等现有方法鉴定抗原特异性T细胞相比，该技术的主要优势在于成功率显著更高。该方法有助于解答免疫学领域的关键问题，例如T细胞识别HPV的哪些区域。该技术的应用前景可延伸至宫颈癌的治疗或诊断，因为基于对T细胞特异性的了解，可开发相应的疫苗和免疫疗法。该方法可用于研究CD8 T细胞表位，也可应用于其他系统，例如CD4 T细胞表位。利用从受试者1建立的CD8 T细胞系进行的干扰素γ酶联斑点（SPO）检测确定，HPV16 E6 46至70区域包含一个T细胞表位。这些表位特异性的T细胞是根据其分泌干扰素γ的能力进行筛选的。在完全E细胞培养基中制备含有经照射的同种异体外周血单个核细胞、B淋巴母细胞和植物血凝素的饲养细胞混合物。现在，利用多通道移液器板，将分离的表位特异性T细胞在饲养细胞混合物中进行连续稀释，制备浓度为每毫升5个细胞的悬液。将稀释后的表位特异性T细胞各100微升加入96孔圆底培养板的每孔中。在37°C和5% CO₂条件下培养5天，并在第11至14天用重组人白细胞介素-2刺激细胞。通过肉眼识别培养板孔底部形成的较大沉淀物，以确定T细胞克隆的生长情况。有时培养基会变为黄色。准备新的饲养细胞混合物，并将完全培养基分装至24孔板中，每孔1毫升。成功的实验关键在于能够使用200微升微量移液器分离并培养T细胞克隆。将T细胞克隆分别转移至含有褶皱状饲养细胞的各个孔中。重复操作，直至所有T细胞克隆均完成转移。在4°C孵育1小时后，用50微升浓度为5微克/毫升的初级抗干扰素γ单克隆抗体包被无菌sbot板的孔；随后用200微升PBS洗涤3次。然后用50微升含5%人混合血清的RPMI 1640培养基封闭非特异性结合位点。始终用无菌针头刺破大型气泡以使其分散。在37摄氏度、5%CO2条件下孵育1小时。接着，在含有5%人血清的50微升RPMI 1640培养基中加入1×10⁵个自体LCL细胞。使用1毫升移液器充分混匀每个T细胞克隆的细胞，取100微升转移至无菌Eppendorf管中，再加入500微升含5%混合人血清的RPMI 1640培养基进行稀释。然后通过离心收集细胞，弃去上清液，并将细胞重悬于110 µL含有5%人血清的RPMI 1640

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人子宫颈管γδ T细胞的分离与流式细胞术分析

本文介绍了一种单分子阵列数字ELISA检测方法的开发与验证方案，该方法可实现对人源样本中所有干扰素-α亚型的超灵敏检测。...

超灵敏单分子阵列数字酶联免疫吸附测定法的开发与验证：用于人干扰素-α

用于豚鼠外周血单个核细胞的干扰素-γ ELISpot...

优化的干扰素-γ ELISpot 法检测豚鼠疫苗接种后T细胞免疫应答

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基于肽段矩阵的乙型肝炎病毒特异性CD4 T细胞应答分析及HLA-DR限制性CD4 T细胞表位鉴定

本文介绍了一种用于检测抗原展示型病毒样颗粒（VLPs）上中和表位的实验方案。利用与蛋白G偶联磁珠结合的包膜糖蛋白特异性单克隆抗体，对来源于人类免疫缺陷病毒（HIV）的VLPs进行免疫沉淀。捕获的VLPs随后通过SDS-PAGE分离，并使用针对病毒核心蛋白Gag的特异性抗体进行Western印迹分析。...

利用捕获法检测基于病毒样颗粒（VLP）疫苗中抗原的中和敏感性表位

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