Name: 从小学的人角质形成细胞器官筏文化的代 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-02-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 26 s
Description: 学习利用人原代角质形成细胞或上皮细胞系建立器官型筏式培养物，通过气液界面培养10至14天，模拟体内上皮分化过程，用于研究病毒与宿主相互作用及上皮细胞生物学特性。

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作者谨此感谢英国伯明翰大学的 Sally Roberts 惠赠 E1ˆE4 抗体。本工作获得美国国家癌症研究所资助（资助号：4R00CA137160-03）。

1. 类器官漂浮培养的准备
<ol>
	<li>金属漂浮网架在使用前必须先用铬酸硫酸处理，以去除可能干扰分化过程的任何残留物。将金属网架浸入盛有硫酸的玻璃烧杯中，处理1小时，然后用自来水持续冲洗过夜。过夜冲洗后，再用双蒸水冲洗3-5小时。</li>
	<li>为提供对漂浮物的支撑，将漂浮网架的三个边各自弯折约0.5 cm，且各弯折点之间保持等距。随后对金属网架进行高压灭菌。</li>
	<li>配制10倍重悬缓冲液：加入2.2 g NaHCO3和4.8 g Hepes，溶于100 ml 0.05 M NaOH中。过滤除菌后，分装为每份5 ml，于-20°C保存。</li>
	<li>配制不含碳酸氢钠的10倍DMEM培养基。过滤除菌后，分装为每份5 ml，于-20°C保存。</li>
	<li>配制小鼠表皮生长因子（EGF）：将100 mg EGF和10 mg BSA分别溶于10 ml去离子双蒸水（ddH2O）中。将EGF与BSA溶液混合，并加入80 ml去离子双蒸水，总体积为100 ml。过滤除菌，分装（5 ml/管），于-20°C保存。每升E培养基中加入5 ml浓度为1 mg/ml的EGF溶液（终浓度为5 ng/ml）。</li>
</ol>
2. 胶原凝胶的制备
<ol>
	<li>每个培养筏需要一份胶原凝胶。胶原应置于冰上以防止其凝固。每份胶原凝胶需含有3 ml胶原混合液，其组成为：2.4 ml冷的鼠尾胶原蛋白I型（终浓度为3–4 mg/ml）、0.3 ml 10倍浓度重悬缓冲液（10X reconstitution buffer）、0.3 ml 10倍浓度DMEM以及1–2 × 106个作为饲养层细胞的小鼠3T3 J2成纤维细胞。对于高浓度的鼠尾胶原溶液，需用0.02 M乙酸稀释至所需工作浓度。</li>
	<li>确定所需胶原凝胶（培养筏）的数量，然后计算出所需胶原、10倍浓度重悬缓冲液、10倍浓度DMEM及J2成纤维细胞的总混合液（master mix）用量。由于胶原具有较高黏度，配制总混合液时应额外多准备3–4份凝胶所需的量。</li>
	<li>制备胶原凝胶时，先用胰酶消化J2成纤维细胞，并用培养基中和。将所有细胞收集后转移至一个50 ml锥形离心管中，计数细胞以确定可制备的培养筏数量。每个胶原凝胶（即每个培养筏）需要1–2 × 106个成纤维细胞。随后以低速离心收集细胞。</li>
	<li>吸除成纤维细胞沉淀中的培养基，并根据所计算的培养筏数量，用适量的10倍浓度重悬缓冲液、10倍浓度DMEM和胶原重新悬浮细胞。最后加入胶原，以避免凝胶过快凝固。胶原加入后应迅速但轻柔地混匀，防止产生气泡。凝胶应呈红橙色，表明pH值正确。若混合液颜色过黄，可加入数滴滤膜除菌的1 N NaOH，轻轻混匀至颜色恢复正常。</li>
	<li>将3 ml胶原-成纤维细胞混合液加入6孔培养板的各孔中。加样时应沿孔壁缓慢吹加，避免产生气泡。将培养板放入37°C细胞培养箱中，静置30分钟使其凝固。</li>
	<li>30分钟后，在已凝固的胶原凝胶表面加入3 ml含EGF的E培养基，然后将培养板放回培养箱。凝胶应在37°C下至少维持一天，但应在四天内使用。培养两天后效果最佳。</li>
</ol>
3. 准备角质形成细胞以进行分化
<ol>
	<li>低代次角质形成细胞应培养至约70%融合度。每个表皮培养模型需要1-2×106个角质形成细胞。用胰蛋白酶消化角质形成细胞，并用含表皮生长因子（EGF）的E培养基中和。计数细胞以确定可制备的表皮培养模型数量。低速离心收集细胞。根据计算的表皮培养模型数量，将细胞沉淀重悬于每份1 ml含EGF的E培养基中。</li>
	<li>倾斜6孔板，吸除胶原凝胶中的培养基。向每个凝胶中加入2 ml新鲜含EGF的E培养基。对于每个凝胶，小心地将1 ml重悬的角质形成细胞加入孔中已有的2 ml E培养基中。轻轻吹打混合角质形成细胞与2 ml培养基，然后逐滴滴加回凝胶表面。晃动或摇动培养板可能导致细胞在胶原凝胶上分布不均。将培养板放入37°C培养箱中孵育。</li>
	<li>细胞应继续培养至完全融合，并每日更换E培养基。当培养基在换液后一天变为黄色时，表明细胞已达到融合状态。此过程通常需要2-4天。若至第4天培养基仍未变色，则进入下一步操作。</li>
</ol>
4. 制备筏式培养物
<ol>
	<li>使用无菌镊子将无菌金属浮载网格（弯曲侧朝下）放入一个 10 cm 培养皿中。吸除胶原凝胶中的培养基。为使凝胶从孔壁脱离，用无菌刮匙沿凝胶边缘上下移动。取出胶原凝胶时，将培养板轻微倾斜，并将刮匙置于凝胶下方将其抬起。将胶原凝胶平铺于金属网格上，确保凝胶与网格之间无气泡产生。每个网格上可放置两个凝胶。</li>
	<li>为形成气液界面，缓慢将不含 EGF 的 E 培养基加入培养皿底部，使浮载网格接触培养基，但胶原凝胶不接触液体。培养基不应透过网格孔隙。添加培养基时应缓慢，避免在网格下方产生气泡，否则将影响组织的均匀分化。将浮载物在 37°C 条件下孵育，并每隔一天更换培养基，维持气液界面。14 天后收获浮载物。</li>
</ol>
5. 典型结果
当使用原代角质形成细胞正确执行该方案时，将获得一个结构良好的分化上皮，其中皮肤的不同层次清晰可见。可通过苏木精和伊红（H&amp;E）染色对筏式培养物的切片进行组织学检查来实现这一评估，如图1B所示。H&amp;E染色还可用于观察筏式结构的形态，以及病毒或抗病毒化合物对细胞分层和分化能力的影响。例如，由HPV永生化的原代人角质形成细胞（HFK-31）构建的筏式结构明显比正常人包皮角质形成细胞（HFK）构建的更厚，反映出细胞增殖速率增加，以及HPV蛋白能够使正在分化的细胞持续处于细胞周期中（图1B）10。这导致在整个上皮层中均保留细胞核，而正常角质形成细胞在分化后即退出细胞周期，随之发生核膜崩解。为了更深入地研究分化过程，可进行免疫组织化学染色以检测特定的分化标志物，包括细胞角蛋白、兜甲蛋白（involucrin）和丝聚蛋白（filaggrin）。不同的细胞角蛋白在分化的特定阶段表达7。如图2所示，细胞角蛋白10（K10）不在基底层表达，仅存在于由逐步分化细胞组成的上基底层中。在HPV阳性的筏式结构中，K10的表达相较于正常角质形成细胞出现延迟，再次反映了HPV蛋白对角质形成细胞分化的调控作用。免疫组织化学还可用于分析病毒基因的表达谱。图3展示了对HPV蛋白E1^E4表达的代表性染色结果，该蛋白是一种晚期蛋白，仅在上皮最上层表达。正如预期，在正常人包皮角质形成细胞的筏式培养物中未观察到任何染色信号。
<img alt="三维上皮培养方法示意图；流程：胶原凝胶栓、上皮生长、气液界面。" src="/files/ftp_upload/3668/3668fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图1"> 
图1. A) 由原代角质形成细胞或上皮细胞系制备类器官筏式培养物的方法示意图。B) 由稳定维持HPV-31（HFK-31）附加体的人包皮角质形成细胞或正常人包皮角质形成细胞（HFK）生成的类器官筏式培养物的苏木精-伊红染色结果。图中标识出各个上皮层以及胶原凝胶栓。
<img alt="显示HFK细胞中K10和DAPI染色的荧光显微镜示意图，突出表达情况" src="/files/ftp_upload/3668/3668fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 2"> 
图 2. 细胞角蛋白10（K10）的表达局限于上皮的表层基底层。对由HFK-31细胞以及正常HFKs构建的类器官漂浮培养物进行横切，并使用抗K10抗体进行免疫组织化学染色。细胞DNA用DAPI复染。图像通过共聚焦荧光显微镜采集。箭头指示上皮的基底层。
<img alt="HFK 细胞荧光显微镜图像；E1^E4，DAPI 染色，合并；蛋白表达。" src="/files/ftp_upload/3668/3668fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 3"> 
图 3. 人乳头瘤病毒（HPV）E1^E4 蛋白在病毒生命周期的增殖期晚期产生。对由 HFK-31 细胞以及正常 HFKs 生成的类器官浮置培养物的横切面进行免疫组织化学染色，使用针对 E1^E4 的抗体。细胞 DNA 用 DAPI 进行复染。图像通过共聚焦荧光显微镜采集。箭头指示上皮的基底层。

<ol><li>Andrei, G., Duraffour, S., VandenOord, J., Snoeck, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial+raft+cultures+for+investigations+of+virus+growth%2C+pathogenesis+and+efficacy+of+antiviral+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Antiviral+Research%22%5BJournal%5D)">Epithelial raft cultures for investigations of virus growth, pathogenesis and efficacy of antiviral agents.</a> Antiviral Research. 85, 431-449 (2010).</li>
<li>Asselineau, D., Prunieras, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstruction+of+%27simplified%27+skin%3A+control+of+fabrication%5BTitle%5D)+AND+%22The+British+Journal+of+Dermatology%22%5BJournal%5D)">Reconstruction of 'simplified' skin: control of fabrication.</a> The British Journal of Dermatology. 111, Suppl . 27. 219-222 (1984).</li>
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<li>Cheng, S., Schmidt-Grimminger, D. C., Murant, T., Broker, T. R., Chow, L. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation-dependent+up-regulation+of+the+human+papillomavirus+E7+gene+reactivates+cellular+DNA+replication+in+suprabasal+differentiated+keratinocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">Differentiation-dependent up-regulation of the human papillomavirus E7 gene reactivates cellular DNA replication in suprabasal differentiated keratinocytes.</a> Genes & Development. 9, 2335-2349 (1995).</li>
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<li>Meyers, C., Frattini, M. G., Hudson, J. B., Laimins, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biosynthesis+of+human+papillomavirus+from+a+continuous+cell+line+upon+epithelial+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Biosynthesis of human papillomavirus from a continuous cell line upon epithelial differentiation.</a> Science. 257, 971-973 (1992).</li>
<li>Wilson, R., Laimins, L. A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWilson%2C+R+%22Differentiation+of+HPV-Containing+Cells+Using+Organotypic+Raft+Culture+or+Methylcellulose%22">Differentiation of HPV-Containing Cells Using Organotypic Raft Culture or Methylcellulose</a>. , Humana Press Inc. Totowa. 119-119 (2006).</li>
<li>zur Hausen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Papillomavirus+infections--a+major+cause+of+human+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Papillomavirus infections--a major cause of human cancers.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1288, F55-F78 (1996).</li>
</ol>

我们没有需要披露的内容。

我们在此描述一种可用于研究上皮细胞分化的通用方法，该方法亦可轻松改造用于研究病毒致病机制以及潜在治疗手段的有效性。许多病毒以上皮细胞作为感染的主要部位（例如人乳头瘤病毒HPV），或在病毒生命周期的某一阶段靶向感染上皮细胞（如疱疹病毒）。尽管培养类器官筏式培养体系耗时较长，但其能够真实地重现 体内 上皮分化为研究病毒与宿主细胞相互作用提供了极为有用的方法。要成功培养完全分化的上皮组织，必须注意一些关键步骤。为了在悬滴培养体系中保持分化能力，胶原凝胶中必须含有足够数量的成纤维细胞饲养层，以维持角质形成细胞单层的生长。悬滴培养中分化不良可能源于胶原-成纤维细胞凝胶上角质形成细胞密度过低、悬滴结构构建不当，或未能每天更换培养基。另一个影响上皮分化质量的重要因素是所用成纤维细胞饲养层的类型。本实验所描述的方法使用了小鼠3T3-J2成纤维细胞。尽管其他类型的成纤维细胞也可作为饲养层，但不建议使用增殖过快或可能迁移至真皮表面的成纤维细胞7。虽然本方案建议在培养14天后收获悬滴组织，但也可在此时间点之前或之后进行收获。然而，超过14天后，悬滴组织会逐渐变薄。除了可用于免疫组织化学分析的切片外，悬滴组织还可用于提取RNA和DNA，以及病...

<table><tbody><tr><td>大鼠尾部I型胶原蛋白（4-5 mg/ml）</td><td>BD 生物科学</td><td>354236</td><td></td></tr><tr><td>不含 NaHCO₃ 的 DMEM&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td>Invitrogen</td><td>12100-061</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO₃&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Calbiochem</td><td>391338</td><td></td></tr><tr><td>不锈钢金属网格</td><td>威廉斯与梅特尔公司</td><td>CR-03063-040-100-S</td><td></td></tr><tr><td>E 培养基&lt;sup&gt;11&lt;/sup&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>表皮生长因子</td><td>BD 生物科学</td><td>354010</td><td></td></tr></tbody></table>

由原代人角质形成细胞生成类器官筏式培养物

Generation of Organotypic Raft Cultures from Primary Human Keratinocytes

类器官型上皮筏式培养技术的发展为研究人员提供了一种高效的方法 体外 能够真实再现上皮细胞分化的系统。该系统具有多种用途，例如，培养角质形成细胞三维类器官筏状培养物的能力，是人乳头瘤病毒（HPV）研究中的一个重要里程碑1人乳头瘤病毒的生命周期与鳞状上皮的分化过程紧密相关2. 如本文所示，类器官上皮筏状培养可重现整个乳头瘤病毒生命周期，包括病毒的产生3,4,5此外，这些类器官培养物表现出类似于所观察到的发育异常病变 体内 感染人乳头瘤病毒（HPV）。因此，该系统也可用于研究上皮细胞癌以及药物对上皮细胞分化的普遍影响。该系统最初由 Asselineau 和 Prunieras 开发。6 并由Kopan修改 等.7，类器官上皮筏培养系统已发展为一种通用且相对简便的培养模型，该模型通过在维持于气-液界面的胶原栓上培养细胞来实现（图1A）。在10至14天的过程中，细胞发生分层与分化，形成具有完整厚度的上皮组织，并表达分化特异性的细胞角蛋白。收获的筏状结构可通过组织学方法以及常规分子和生物化学技术进行分析。本文中，我们描述了一种利用原代人角质形成细胞生成筏培养物的方法。该技术同样适用于已建立的上皮细胞系，并可轻松改造用于正常或病变组织活检来源的上皮组织8许多病毒在其复制生命周期中会以皮肤或黏膜上皮作为靶标。近年来，已有研究证明，利用类器官漂浮培养法研究病毒与宿主细胞相互作用的可行性，相关病毒包括多种疱疹病毒、腺病毒、细小病毒以及痘病毒。9因此，可调节类器官筏式培养技术用于研究病毒致病机制，并且是检验针对无法在永生化细胞系中培养的病毒之新型抗病毒药物的唯一手段。

一种 体外 模拟方法 体内 描述了上皮细胞分化。许多病毒在其生命周期中会以上皮细胞为靶标，该方法提供了一种更接近真实情况的研究病毒与宿主相互作用的手段 体内该技术可用于原代角质形成细胞、已建立的细胞系，以及正常或病变的活检组织。

类器官上皮筏式培养技术的发展为研究人员提供了一种高效的体外系统，能够真实地重现……

本实验的总体目标是从原代角质形成细胞或已建立的上皮细胞系中生成类器官漂浮培养物。首先制备成纤维细胞胶原凝胶塞，然后将上皮细胞接种于凝胶塞表面。将凝胶块转移至浮载网格中，在气液界面培养10至14天。最后一步是收获组织筏。最终可通过组织学或免疫组织化学分析评估上皮细胞分化的变化，该方法有助于深入了解上皮细胞分化过程。该方法也可应用于其他系统，例如在其生命周期中感染皮肤或黏膜上皮的病毒。演示本实验步骤的是我实验室的研究生 Dan Anneker。首先，将铬酸倒入玻璃烧杯中，并将金属载网浸入酸中一小时。然后用自来水持续冲洗载网过夜。过夜冲洗后，再用双蒸水冲洗载网3至5小时，使载网晾干。随后将载网的三个边弯曲，每边弯曲约0.5厘米，且各边间距相等，最后对载网进行高压灭菌。制备胶原凝胶后，用胰蛋白酶处理两份成纤维细胞，然后用培养基中和胰蛋白酶。将成纤维细胞转移至一个50毫升的锥形管中，计数细胞以确定可制备的细胞筏数量。随后在室温下以244 × g离心4分钟，吸除成纤维细胞沉淀中的培养基，并根据计算出的细胞筏数量，将细胞重悬于适量的重悬缓冲液DMEM和胶原中。最后加入胶原蛋白以防止凝胶过快固化。加入胶原蛋白后，需迅速而轻柔地混匀溶液，以避免将气泡引入凝胶中。如果凝胶混合物颜色过黄，可加入数滴经过滤除菌的液体。一种正常的氢氧化钠。轻轻混匀，直至凝胶变为红橙色，表明 pH 值正确。现在将 3 毫升胶原成纤维细胞混合物沿六孔培养板每个孔的孔壁缓慢移液，避免产生气泡，然后将培养板在 37 摄氏度下孵育 30 分钟，使凝胶凝固。当凝胶凝固后，在凝固的胶原凝胶表面加入3毫升含EGF的E培养基，将培养板放回培养箱中。待低代次角质形成细胞生长至约70%融合度时，用胰蛋白酶消化角质形成细胞，然后用eed中和胰蛋白酶。在含有EGF的条件下计数细胞，以确定可制备的表皮筏式培养物（rafts）数量。离心细胞后，将沉淀重悬于每计算所得的类器官培养物中含EGF的1毫升eed培养基中。随后，将六孔板倾斜以去除胶原凝胶中的培养基，然后向每个凝胶中加入2毫升新鲜的含EGF的eed培养基。接下来，小心地将1毫升重悬的角质形成细胞加入到每个孔中已存在的2毫升eed培养基中。轻轻吹打角质形成细胞及其两毫升培养基，逐滴加入到胶原凝胶上。将培养板置于37摄氏度培养箱中培养2至4天，使细胞生长至汇合。当培养基在换液后一天变为黄色，或至第4天时，即可使用无菌镊子将无菌金属浮栅（弯曲面朝下）放入10厘米培养皿中。吸出一个胶原凝胶中的培养基，然后用无菌刮铲在凝胶边缘上下移动，使凝胶从孔壁松脱。将胶原凝胶块从六孔板转移至网格是该操作中最困难的步骤。需小心地将刮铲轻轻滑入凝胶块下方，避免将其撕裂，并将其平稳放置在网格上，确保凝胶块与网格之间不产生任何气泡。随后，可使用刮刀将此过程中发生折叠的部分抹平。取出凝胶时，将培养板略微倾斜，将刮刀置于凝胶下方并轻轻抬起。将胶原凝胶平铺于金属网格上，确保凝胶与网格之间无气泡产生。为建立气液界面，将不含 EGF 的 EED 缓慢加入培养皿底部，使筏状结构网格接触培养基，但胶原凝胶不接触。最后将筏状结构在 37°C 条件下孵育。维持气液界面，在 14 天后收获筏状结构。如图所示，由 HPV 31 永生化的原代人角质形成细胞（H fk, 30 ones）构建的筏状结构明显比由正常人皮肤角质形成细胞（hks）构建的更厚。因此，HPV 蛋白具有使正在分化的细胞持续保持在细胞周期中的能力。本研究对由 HK 30 细胞以及正常 HKS 建立的类器官筏式培养物的横切面进行了免疫组织化学分析，使用绿色标记的抗角蛋白 10 或 K 10 抗体。如箭头所示，K 10 在基底层中未表达，而仅存在于上基底层，即由逐步分化的细胞组成的层次中。在此图中，人乳头瘤病毒（HPV）蛋白E1、E4（一种晚期蛋白，仅表达于上皮的最上层，此处以绿色表示）的表达情况如预期所示。与前一张图相同，在正常人角质形成细胞（hks）的悬滴培养物中未观察到染色。箭头再次指示上皮组织发育后的基底层。该技术为癌症生物学领域的研究人员提供了一条途径，使其能够利用一种模拟体内上皮分化的系统来研究人乳头瘤病毒的发病机制。观看本视频后，您应能充分掌握如何利用原代角质形成细胞或已建立的上皮细胞系构建类器官筏式培养体系。

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