小鼠多巴胺能神经元和纹状体组织三维胶原基质培养物的分离与培养

本实验的总体目标是培养多巴胺能中脑和纹状体外植体，以研究中脑-纹状体及黑质-纹状体通路的发育。该目标首先通过显微解剖 E14.5 小鼠胚胎的纹状体和多巴胺能中脑组织来实现。第二步是将解剖所得组织切成适当大小的外植体。

接下来，将外植体置于胶原凝胶中，使其彼此靠近。最后一步是将这些外植体培养两到三天，以促进轴突生长。最终，通过针对特定神经元标志物的免疫组织化学染色，来显示并量化轴突的趋化吸引或排斥反应。

与现有的解离培养或双DX外植体培养等方法相比，该技术的主要优势在于，胶原基质为外植体提供了三维生长基质，可模拟细胞外环境。此外，胶原基质有助于在外植体或邻近细胞释放的蛋白质周围形成相对稳定的浓度梯度。本次实验操作将由我实验室的两名研究生Ava Smith和Francesca进行演示。

开始此操作时，从母鼠子宫中取出 E 14.5 天的小鼠胚胎。将其保存在冰上的 L 15 培养基中，直至使用。接着，将一个胚胎转移至显微镜下，从胚胎中分离出脑组织。

然后沿每个头囊的中区切割，去除头节。接着去除脑膜鞘。在中脑头曲前方稍作背腹向切口。

随后，在中脑头端屈曲的稍后方再做一个背腹向切口。然后使用显微解剖刀沿背侧中线做一后方稍后方的切口，以暴露下方的腹侧中脑组织。注意避免损伤腹侧中脑组织，因其含有多巴胺能神经元。

随后，沿腹侧中线做两个横向且平行的切口，以去除背侧中脑组织。接着，使用显微解剖刀在末端处将剩余的腹侧中脑组织分割为 X 个外植块。将 X 个外植块置于含 5% FBS 的 L-15 培养基中，冰上保存备用。

现在将之前在中脑解剖过程中获得的端脑泡转移至显微镜下。使用镊子在丘脑与视顶盖之间进行切割，以去除丘脑。然后在纹状体前方做一内外侧切口，以移除嗅球等前部结构。

接下来，对位于尾状核附近的组织重复此步骤。随后，将剩余的脑片进行定位，以获得尾状核的冠状切面视图。尾状核可被识别为组织中略为透明的部分。

然后分离出纹状体，并使用显微解剖刀将其切成组织块。避免取材靠近中线处略深的组织，该区域含有来自外侧和内侧神经节隆起的迁移神经元。在四孔板的每个孔内的盖玻片上加入一滴已配制好的胶原液。

将样品置于37摄氏度、5%二氧化碳的培养箱中孵育30分钟。在此孵育过程中，胶原蛋白将发生凝胶化。待胶原蛋白凝胶化后，使用带有200微升吸头的移液器将多巴胺能神经元或唾液腺外植体转移至胶原蛋白中。

然后用针将外植体相互移至紧密相邻的位置，保持它们之间的距离约为一个外植体的直径。接着，去除多余的培养基。

在组织块上加入20微升制备好的胶原蛋白。此操作常导致组织块移动，可用针重新调整组织块的位置。

将胶原在室温下静置15分钟使其凝固。然后将其转移至含有5%二氧化碳、37摄氏度的培养箱中孵育30分钟。待胶原凝固后，加入400 µL的器官培养基，在37摄氏度培养箱中培养2至3天。

为了温和固定标本，加入4%多聚甲醛，在室温下放置1小时。1小时后，在室温下用PBS洗涤3次，每次15分钟。

然后，除去 PBS 后，用封闭缓冲液在室温下封闭 2 小时。随后，在 4 摄氏度下，用一抗和封闭缓冲液于次日孵育过夜。之后，在室温下用 PBS 洗涤 5 次，每次 1 小时。然后，用与相应荧光基团偶联的二抗进行孵育。

在封闭缓冲液中于4°C孵育过夜。从这一步开始，需用铝箔包裹组织块，以尽量减少其暴露于光照。随后在4°C的PBS中洗涤过夜，次日再进行多次洗涤。

接下来，使用长效抗荧光淬灭封片剂将外植体固定在显微镜载玻片上，使外植体一侧朝下。将盖玻片非常轻柔地放置在封片剂上，避免产生气泡。然后使用倒置荧光显微镜获取 x 个外植体的数字图像。

利用这些图像，将每个X外植体划分为四个象限，以生成近端象限和远端象限。随后，分别测量从X外植体近端和远端象限中延伸出的最长20条神经突的长度。使用这20条最长神经突的平均长度，计算每个单独外植体的近端-远端比值。

近端与远端比值大于1表明轴突被吸引，而比值小于1则表明轴突被排斥。图中所示为使用抗酪氨酸羟化酶抗体染色的中脑外植体，显示轴突向外生长。

虚线表示相邻的外植块。此处的箭头指示单个神经突及其生长锥。这是近端-远端比值定量分析的一个示例。

这些区域被均等地划分为四个象限。近端象限朝向相邻的X外植体，而远端象限则背向它。观看本视频后，您应能充分理解如何共培养多巴胺能神经元和纹状体外植体，以研究中脑-黑质通路的发育过程，并探讨这些通路形成过程中所涉及的分子机制。