Name: 在体外转录和Gaussia荧光素酶基因的上限由HeLa细胞转染 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-03-26T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 55 s
Description: 学习体外转录合成带帽和不带帽的Gaussia荧光素酶mRNA，并通过转染HeLa细胞检测荧光素酶活性，比较两种加帽方法的效果。该方法适用于RNA功能研究和基因表达分析。

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Dongxian Yue, Brett Robb, George Tzertzinis, Tanya Bhatia, Breton Hornblower

RNase 常见于皮肤、头发、灰尘、实验台表面、溶液等处。操作前应佩戴手套，并彻底清洁实验台面、移液器等，以避免 RNase 污染。强烈建议使用无核酸酶的移液器吸头、离心管、玻璃器皿和试剂。
1. 体外 使用T7高产率RNA合成试剂盒进行转录
转录反应所用的DNA模板是含有Gaussia荧光素酶基因的线性化质粒，该基因编码序列上游包含一个T7启动子（图1B）。
<ol>
	<li>从T7高产量RNA合成试剂盒中取出各组分，解冻后置于冰上保存。</li>
	<li>对于未加帽RNA，在室温下按以下顺序设置反应体系：</li>
</ol>
<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>组分</td>
			<td>体积 (μl)</td>
			<td>终浓度</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>无核酸酶水*</td>
			<td>X</td>
			<td> </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X 反应缓冲液</td>
			<td>2</td>
			<td>1X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP (100 mM)</td>
			<td>2</td>
			<td>10mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CTP (100 mM)</td>
			<td>2</td>
			<td>10mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UTP (100 mM)</td>
			<td>2</td>
			<td>10mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GTP (100 mM)</td>
			<td>2</td>
			<td>10mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>模板 DNA *</td>
			<td>X</td>
			<td>1 μg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T7 RNA 聚合酶混合液</td>
			<td>2</td>
			<td> </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>总体积</td>
			<td>20</td>
			<td> </td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
*加入1 μg DNA，并用无核酸酶水补足总体积至20 μl。所加水量需根据模板DNA的浓度进行调整。
<ol start="3">
	<li>对于加帽RNA：按以下顺序在室温下设置反应体系：</li>
</ol>
<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>组分</td>
			<td>体积 (μl)</td>
			<td>终浓度</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>无核酸酶水*</td>
			<td>X</td>
			<td> </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X 反应缓冲液</td>
			<td>2</td>
			<td>1X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP (100 mM)</td>
			<td>2</td>
			<td>10mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CTP (100 mM)</td>
			<td>2</td>
			<td>10mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UTP (100 mM)</td>
			<td>2</td>
			<td>10mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GTP (20 mM)</td>
			<td>2</td>
			<td>2mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3´-O-甲基-m7G(5')ppp(5')G 帽类似物 (ARCA)(40mM)</td>
			<td>4</td>
			<td>8mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>模板 DNA*</td>
			<td>X</td>
			<td>1 μg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T7 RNA 聚合酶混合液</td>
			<td>2</td>
			<td> </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>总体积</td>
			<td>20</td>
			<td> </td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
*加入1 μg DNA，并用无核酸酶水补足总体积至20 μl。所加水量根据模板DNA的浓度而定。
<ol start="4">
	<li>充分涡旋混匀，然后在干燥空气培养箱中37 °C孵育反应体系2小时。</li>
	<li>参照步骤1.3–1.4，从含有CLuc基因的线性化质粒合成Cypridina荧光素酶（CLuc）的加帽转录本。该mRNA将与加帽及未加帽的GLuc mRNA共转染，用于GLuc表达的归一化。</li>
</ol>
2. 去除模板DNA
在进行纯化之前，用DNase I处理转录反应以去除DNA模板。
<ol>
	<li>向转录反应中加入 70 μl 无核酸酶水，然后加入 10 μl DNase I 反应缓冲液。</li>
	<li>向反应体系中加入 2 μl DNase I。</li>
	<li>在干式空气恒温培养箱中 37 °C 孵育 15 分钟。</li>
</ol>
3. 带帽与去帽RNA的柱纯化
<ol>
	<li>根据制造商说明，使用 MEGAclear 试剂盒纯化加帽和未加帽的 RNA（也可使用任何基于离心柱的 RNA 纯化试剂盒）。</li>
	<li>使用 NanoDrop 分光光度计对 RNA 进行定量。</li>
	<li>根据制造商说明，使用 Agilent RNA 6000 Nano 试剂盒和 Agilent 2100 生物分析仪评估 RNA 样品的质量。</li>
</ol>
4. 使用以下方法进行RNA加帽 痘苗病毒 封端系统
<ol>
	<li>取10 μg纯化的未加帽GLuc mRNA。</li>
</ol>
标准加帽反应最多可对10 μg（100个核苷酸或更长）的RNA进行加帽。如果需要对更大量的RNA进行加帽，可相应扩大反应体系。
<ol start="2">
	<li>用无核酸酶水将体积调至 15 μl。</li>
	<li>将 RNA 在 65 °C 下加热 10 分钟以去除二级结构，然后置于冰上 5 分钟。</li>
	<li>为建立加帽反应，在 15 μl 变性 RNA 中加入 2 μl 10X 加帽缓冲液、1 μl GTP（10 mM）、1 μl 新鲜稀释的 S-腺苷甲硫氨酸（2 mM）和 1 μl（10 单位）痘苗病毒加帽酶。</li>
	<li>轻轻涡旋混匀，于干式空气孵育器中 37 °C 孵育反应 30 分钟。</li>
</ol>
5. 帽子结构RNA的柱纯化
<ol>
	<li>使用MEGAclear试剂盒纯化加帽RNA（也可使用任何基于离心柱的RNA纯化试剂盒）。</li>
	<li>根据生产商说明书，使用Agilent RNA 6000 Nano试剂盒和Agilent 2100生物分析仪评估RNA样品质量。</li>
</ol>
6. 使用 TransIT mRNA 转染试剂盒进行 HeLa 细胞转染
<ol>
	<li>在48孔板中接种HeLa细胞，每孔加入150 μl高糖Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM），并添加10%胎牛血清（每孔细胞数为0.7–2.3 × 105个）。</li>
	<li>于37 °C孵育16–24小时，使细胞融合度达到60–90%。</li>
	<li>将GLuc（带帽和去帽）及CLuc RNA稀释至100 ng/μl的浓度。</li>
</ol>
每次转染均设置8个重复。
<ol start="4">
	<li>准备8个离心管 管。向每根管中加入 1 μl 未加帽的GLuc RNA， 1 μl 加帽CLuc RNA（用于归一化）和 25 μl 无血清DMEM。充分混匀。</li>
	<li>准备8个离心管，向每个管中加入 1 μl 加帽GLuc RNA（帽类似物）， 1 μl 加帽的CLuc RNA（用于标准化）和 25 μl 无血清DMEM。充分混匀。</li>
	<li>准备8个离心管，向每个管中加入 1 μl 加帽GLuc RNA（痘苗病毒), 1 μl 加帽的CLuc RNA（用于标准化）和 25 μl 无血清DMEM。充分混匀。</li>
	<li>添加 0.2 μl 向第一组8个试管中加入mRNA增强试剂并混匀。</li>
	<li>添加 0.2 μl 转录将IT mRNA试剂加入第一组8个试管中并混匀。</li>
	<li>室温孵育2-5分钟。（孵育时间不得超过5分钟）。</li>
	<li>将转染混合物逐滴加入含有 HeLa 细胞培养物的孔中（参考 图3 用于平板设置。</li>
	<li>重复步骤7至10，使用2nd 和 3rd 8支试管为一组</li>
	<li>37 °C下孵育过夜（16小时） 37 °C 在5% CO₂中2.</li>
</ol>
7. Gaussia 荧光素酶（GLuc）检测
使用 BioLux Gaussia 荧光素酶检测试剂盒，检测每个孔上清液中的 GLuc 活性，步骤如下：
<ol>
	<li>通过将15 μl BioLux GLuc底物加入1.5 ml BioLux GLuc测定缓冲液中，配制新鲜的测定溶液（每个样品需要50 μl测定溶液）。根据样品数量以及 luminometer 注射器的预冲洗需求，配制足量溶液（参见制造商说明书）。</li>
	<li>通过反复倒置试管充分混匀（切勿涡旋振荡）。</li>
</ol>
使用来自 Berthold Technologies 的 Centro LB 960 微孔板发光仪测量发光值。
<ol start="3">
	<li>将化学发光仪设置为50 μl的注射体积和2-10秒的积分时间。</li>
	<li>从每个孔中吸取10 μl细胞培养上清液，加入至96孔黑色板中。</li>
	<li>用检测溶液预冲洗注射器，然后进行化学发光信号的测定。</li>
	<li>未转染孔获得的数值将作为阴性对照。</li>
</ol>
8. Cypridina 荧光素酶（CLuc）检测
使用 BioLux Cypridina Luciferase Assay Kit 检测每个孔上清液中的 CLuc 活性，步骤如下：
<ol>
	<li>根据试剂盒说明书中的说明，配制新鲜的复溶底物（100倍浓缩液）。</li>
	<li>解冻 BioLux Cypridina 荧光素酶检测缓冲液并充分混匀（避光操作）。</li>
	<li>为配制 CLuc 检测溶液，将 15 μl 复溶底物（100倍浓缩液）加入 1.5 ml BioLux Cypridina 荧光素酶检测缓冲液中（每份样品需 50 μl 检测溶液）。请根据样品数量及发光仪进样器的预冲洗需求配制足量溶液（参见仪器制造商说明书）。</li>
	<li>通过反复倒置管子充分混匀（勿用涡旋振荡器）。</li>
	<li>将溶液在室温下放置 30 分钟（避光）。</li>
</ol>
使用Berthold Technologies公司的Centro LB 960微孔板发光仪测量发光值。
<ol start="6">
	<li>将化学发光仪设置为50 μl进样量，延迟1-2秒，积分2-10秒。</li>
	<li>从每个孔中取10 μl细胞培养上清液加入至96孔黑色板中。</li>
	<li>用CLuc检测试剂溶液预润进样器，并检测发光信号。</li>
	<li>未转染孔所得数值将作为阴性对照。</li>
</ol>
9. 代表性结果
T7 高产量 RNA 合成试剂盒每 20 μl 反应可产生最多 180 μg 未加帽 RNA 以及 40 至 50 μg 加帽 RNA。在 Agilent 2100 生物分析仪上分析时，高质量且完整的 RNA 应显示为一个单一、尖锐的峰，代表 RNA 转录本。宽峰或多峰表明 RNA 发生了降解。此外，验证 RNA 的大小也非常重要。若 RNA 转录本长度长于预期，可能是由于模板质粒 DNA 消化不完全所致。RNA 降解和产量降低通常是由于模板 DNA 引入了污染物所致。图 2 展示了在生物分析仪上运行高质量、完整 RNA 后获得的电泳图谱和凝胶图像示例。
将带有5'端帽子结构和无帽子结构的GLuc RNA转染至HeLa细胞后，进行孵育，并检测细胞培养上清液中的荧光素酶活性。5'端帽子结构对于保护RNA免受外切核酸酶降解8以及促进mRNA的翻译起始9具有重要作用。因此，RNA加帽是转染实验中的关键步骤。共转录（帽类似物）方法可获得约40 μg RNA，其中约80%具有帽子结构。而利用痘苗病毒加帽酶的实验方案每反应可对最多10 μg RNA（长度≥100个核苷酸）进行加帽，效率接近100%。
图4展示了转染了加帽与未加帽RNA样本的细胞培养物之间荧光素酶表达水平的差异。可以明显看出，与转染未加帽RNA的细胞培养物（无荧光素酶活性）相比，转染加帽RNA的细胞培养物荧光素酶表达水平显著更高。此外，图4还证实了两种加帽技术——使用帽类似物和使用痘苗病毒加帽酶——均能成功生成具有功能性的加帽RNA转录本，并可被翻译成蛋白质。t检验得到的双尾p值为0.2583，表明两种加帽方法的发光数据之间无显著统计学差异。
<img alt="T7转录示意图；DNA模板，RNA转录本；核苷酸序列过程。" src="/files/ftp_upload/3702/3702fig1A.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图1。">
图 1A。 T7 RNA 聚合酶介导的 RNA 合成
 
<img alt="pCMV-GLuc 质粒图谱，5764 bp；基因表达、克隆载体、限制性酶切位点。" src="/files/ftp_upload/3702/3702fig1B.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 2。"> 
图 1B. 含有 GLuc 基因和 T7 启动子的 pCMV-GLuc 载体。
 
<img alt="RNA色谱结果；加帽与未加帽RNA分析；电泳图谱。" src="/files/ftp_upload/3702/3702fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 2。"> 
图 2. 加帽与未加帽RNA的Bioanalyzer电泳图谱及凝胶样图像。X轴表示RNA的核苷酸（nt）长度，Y轴表示荧光单位（FU）。A）纯化后GLuc mRNA（未加帽）的电泳图谱。B）使用Vaccinia加帽酶加帽的GLuc mRNA（加帽）的电泳图谱。C）通过共转录方式使用加帽类似物加帽的GLuc mRNA的电泳图谱。D）由Bioanalyzer生成的凝胶样图像。'L'泳道为RNA标记物，泳道1为未加帽的GLuc mRNA，泳道2为使用加帽类似物加帽的GLuc mRNA，泳道3为使用Vaccinia加帽酶加帽的GLuc RNA。
 
<img alt="基因表达实验的孔板布局示意图；样本类型：未加帽/加帽的GLuc与CLuc。" src="/files/ftp_upload/3702/3702fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图3."> 
图3. HeLa细胞转染实验孔板设置示例。每个孔中的HeLa细胞铺板密度为60-90%融合度。向每孔加入转染混合物，包含相应类型的GLuc RNA（未加帽、使用帽类似物加帽或使用Vaccinia加帽酶加帽）、用于归一化的加帽CLuc RNA、mRNA Boost试剂和TransIT mRNA试剂。每次转染设8个重复孔（图中相同颜色的孔代表重复）。
 
 
<img alt="标准化发光值的柱状图；GLuc RNA 加帽与未加帽；RNA 分析结果。" src="/files/ftp_upload/3702/3702fig4.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 4."> 
图 4.HeLa 细胞中的 GLuc 表达。将纯化的加帽和未加帽 GLuc mRNA 转染至 HeLa 细胞中，并在 37 °C 下孵育过夜（16 小时）。收集每孔的细胞培养上清液，检测 GLuc 和 CLuc 活性，并记录发光值。GLuc 的发光值以加帽 CLuc RNA 的发光值为基准进行标准化。 
<img alt="GLuc 发光强度比率公式，发光强度测定，归一化值计算公式，RLU。" src="/files/ftp_upload/3702/3702eq1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="公式 1">
* 在归一化之前，已从 GLuc 和 CLuc 值中减去未转染细胞的发光信号。
 
商标
BioLux 是 New England Biolabs, Inc. 的商标。
TransIT 是 Mirus Bio LLC 的注册商标。
MEGAclear 是 Ambion 的商标。

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<li>Lockless, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recognition+of+capped+RNA+substrates+by+VP39%2C+the+vaccinia+virus-encoded+mRNA+cap-specific+2%27-O-methyltransferase%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Recognition of capped RNA substrates by VP39, the vaccinia virus-encoded mRNA cap-specific 2'-O-methyltransferase.</a> Biochemistry. 37, 8564-8574 (1998).</li>
</ol>

所有作者均为新英格兰生物实验室股份有限公司的员工。

体外转录是一种用于获得高产量 RNA 的有效方法，适用于多种应用。使用 T7 高产量 RNA 合成试剂盒的主要优势在于其配方经过优化，可实现 RNA 的高产量。此外，试剂盒中提供的试剂不含污染性核酸酶，从而能够合成高质量、完整的 RNA 转录本。该试剂盒设计具有高稳定性和灵活性，可用于合成 mRNA、荧光标记 RNA、高比活性放射性标记探针以及加帽 RNA。试剂盒说明书列出了每种应用所需的具体操作步骤和附加材料，还包含有关使用 PCR 产物和合成 DNA 寡核苷酸作为转录模板的技术信息。需要注意的是，该转录试剂盒仅能使用含有 T7 启动子的 DNA 模板。
本文所述方法展示了使用痘苗病毒加帽酶进行转录后RNA加帽，以及使用RNA帽结构类似物进行共转录加帽。我们已证明，这两种方法合成的加帽RNA在转染后均具有功能活性。5'帽结构可提高RNA的稳定性及翻译效率，因此对于显微注射11和转染7实验至关重要。共转录加帽方法可生成40–50 μg、约80%加帽率的RNA。需要注意的是，使用在m7G的3'-羟基位点被阻断的3'-O-Me-m7G(5')ppp(5')G RNA帽类似物（ARCA），可确保帽结构以正确方向整合17。若需制备更大量RNA，可对两种加帽方法的标准反应体系进行放大。然而，从成本角度考虑，使用痘苗病毒加帽系统更为经济可行，因为共转录加帽所用的帽类似物是一种相对昂贵的组分。此外，痘苗病毒加帽系统的加帽效率接近100%，因此也是一种更优的方法。
上述描述的RNA加帽方法可在RNA的5'末端合成具有帽0（cap 0）结构的RNA。帽1（cap 1）结构则涉及RNA末端第一个核苷酸核糖糖基的2'-O位点的额外甲基化。已有研究报道，帽1结构可提高RNA的翻译效率18，可通过使用2'-O-甲基转移酶实现该结构的引入20, 21。
本文所述方法可用于转录、加帽和转染任何目标 mRNA。本实验方案特别选用了荧光素酶 GLuc 和 CLuc，因其具有多种优势：它们可直接分泌到细胞培养基中，因而无需细胞裂解步骤；此外，它们产生的生物发光信号强度高，活性检测灵敏度高且操作简便。需要注意的是，细胞中 GLuc 的表达可能受到除 RNA 自身功能外多种因素的影响，例如移液误差、每孔细胞数量差异、转染效率不同等。为校正这些因素的影响，需进行数据归一化处理。在本方案中，我们通过将 CLuc RNA 作为内参与 GLuc RNA 共转染。将 GLuc 发光信号除以 CLuc 对照值后，即可对转染过程中的误差和变异进行归一化校正19。

<table><tbody><tr><td>T7 高产 RNA 合成试剂盒</td><td>New England Biolabs</td><td>E2040S</td><td></td></tr><tr><td>3&amp;rsquo;-O-Me-m&lt;sup&gt;7&lt;/sup&gt;G(5&amp;rsquo;)ppp(5&amp;rsquo;)G RNA 帽结构类似物</td><td>New England Biolabs</td><td>S1411S</td><td></td></tr><tr><td>DNase I（RNase-free）</td><td>New England Biolabs</td><td>M0303S</td><td></td></tr><tr><td>痘苗病毒加帽系统</td><td>New England Biolabs</td><td>M2080S</td><td></td></tr><tr><td>MEGAclear 试剂盒</td><td>Ambion</td><td>AM1908</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop 分光光度计</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agilent RNA 6000 Nano 试剂盒</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-1511</td><td></td></tr><tr><td>Agilent 2100 生物分析仪</td><td>Agilent Technologies</td><td>G2939AA</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Trans&lt;/em&gt;IT mRNA 转染试剂盒</td><td>Mirus Bio LLC</td><td>MIR2250</td><td></td></tr><tr><td>HyClone* 经典液体培养基：高糖 Dulbecco&amp;rsquo;s 改良 Eagle&amp;rsquo;s 培养基</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>SH30285.01</td><td></td></tr><tr><td>HyClone 非必需氨基酸</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>SH30238.01</td><td></td></tr><tr><td>Centro LB 960</td><td>Berthold Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BioLux&lt;em&gt; Gaussia&lt;/em&gt; 荧光素酶检测试剂盒</td><td>New England Biolabs</td><td>E3300S</td><td></td></tr><tr><td>BioLux &lt;em&gt;Cypridina&lt;/em&gt; 荧光素酶检测试剂盒</td><td>New England Biolabs</td><td>E3309S</td><td></td></tr><tr><td>RNase 抑制剂，小鼠来源</td><td>New England Biolabs</td><td>M0314</td><td></td></tr><tr><td>RNase 抑制剂，人胎盘来源</td><td>New England Biolabs</td><td>M0307</td><td></td></tr><tr><td>pCMV-GLuc 对照质粒</td><td>New England Biolabs</td><td>N8081</td><td></td></tr></tbody></table>

体外 转录与gaussia荧光素酶mrna加帽及其后续的hela细胞转染

In vitro Transcription and Capping of Gaussia Luciferase mRNA Followed by HeLa Cell Transfection

体外转录是指由RNA聚合酶以包含相应启动子序列（T7、T3、SP6）及待转录基因的线性DNA模板为模板合成RNA转录本的过程（图1A）。典型的转录反应体系包含模板DNA、RNA聚合酶、核糖核苷三磷酸、RNase抑制剂以及含有Mg2+离子的缓冲液。
高质量的RNA通常被大量需要用于多种应用。使用 体外 转录已被报道用于RNA结构与功能研究，例如剪接1哺乳动物细胞中的RNAi实验2，通过“Eberwine方法”进行反义RNA扩增3，微阵列分析4 以及用于RNA疫苗研究5该技术还可用于制备放射性标记和荧光染料标记的探针6. Warren, 等 通过转染实现人类细胞重编程的最新报道 体外 转录的带帽RNA7New England Biolabs 公司的 T7 高产 RNA 合成试剂盒设计用于在每 20 μl 反应体系中合成高达 180 μg 的 RNA。使用该试剂盒已成功转录长度达 10 kb 的 RNA。只要在待转录基因的上游含有 T7 启动子序列，即可使用线性化质粒 DNA、PCR 产物和合成 DNA 寡核苷酸作为转录模板。
在真核生物中，为RNA添加5'端帽结构是一个重要的过程。该过程对于RNA的稳定性8、高效翻译9、核内运输10以及剪接11至关重要。该过程涉及在RNA的5'三磷酸末端添加一个7-甲基鸟苷帽结构。RNA加帽可通过转录后使用加帽酶或在转录过程中使用帽类似物来实现。在酶法加帽中，使用痘苗病毒（Vaccinia）加帽酶对mRNA进行加帽12,13。该酶以GTP和S-腺苷甲硫氨酸作为供体，在RNA的5'端添加7-甲基鸟苷帽（即帽0结构）。两种方法均可产生具有功能活性的加帽RNA，适用于转染或其他应用14，例如用于反向遗传系统中病毒基因组RNA的制备15，以及对eIF4E等帽结合蛋白进行晶体学研究16。
在下述方法中，使用 NEB 的 T7 高产 RNA 合成试剂盒合成Gaussia荧光素酶（GLuc）和Cypridina荧光素酶（CLuc）的加帽与未加帽 RNA 转录本。取部分未加帽的 GLuc RNA，利用痘苗病毒加帽系统（NEB）进行加帽。以含有 GLuc 或 CLuc 基因及 T7 启动子的线性化质粒作为模板 DNA。将转录所得的 RNA 转染至 HeLa 细胞，并检测细胞培养上清液中的荧光素酶活性。其中，加帽的 CLuc RNA 用作内参对照，以标准化 GLuc 的表达水平。

该方法可实现高产量 体外 从含有线性化质粒的模板合成带帽和无帽mRNA 高斯荧光素酶 荧光素酶（GLuc）基因。RNA经纯化后，取部分未加帽RNA通过酶法加帽 痘苗病毒 病毒加帽酶。最后一步中，将mRNA转染至HeLa细胞，并检测细胞培养上清液中的荧光素酶活性。

体外 转录与Gaussia荧光素酶mRNA加帽及其后续的HeLa细胞转染

体外转录是由含有相应启动子序列的线性DNA模板经RNA聚合酶催化合成RNA转录本的过程……

本实验的总体目标是将带有帽子结构和无帽子结构的 Gaussia 荧光素酶 mRNA 转录本转染至 HeLa 细胞，并检测细胞培养物中的荧光素酶活性。该目标首先通过使用 T7 高效 RNA 合成试剂盒，体外转录合成 Gaussia 荧光素酶的带帽与无帽 mRNA 转录本来实现。实验中展示了两种 mRNA 加帽方法。一种方法是在转录过程中使用帽类似物，另一种方法则使用痘苗病毒加帽酶进行转录后加帽。下一步是将加帽与未加帽的mRNA转录本转染入heli细胞。最终，在heli细胞培养物中比较由未加帽或加帽mRNA产生的荧光素酶活性。与自行建立转录反应相比，该方法的主要优势在于，T7 高效 RNA 合成试剂盒已经过测试并优化，能够产生高产量、更重要的是高质量、全长的 RNA 转录本，这对于成功进行 RNA 翻译以及功能性活性蛋白的表达极为重要。因此，该方法为 RNA 转染提供了重要参考，体外转录的 RNA 还可用于其他应用，如显微注射、微阵列分析、基于杂交的印迹以及 RNA 结构与功能研究。本示例反应的DNA模板为含有高斯荧光素酶（gluc）基因的线性化质粒。在T7启动子作用下，将合成加帽与未加帽的转录产物。首先，将T7高产量RNA合成试剂盒中的各组分解冻，并置于冰上保存。为避免RNA污染，应佩戴手套，并彻底清洁实验台表面、移液器及其他材料。强烈建议使用无核酸酶的移液器吸头、离心管和玻璃器皿来合成未加帽的RNA。在室温下配制反应体系，先加入10×缓冲液和水，然后依次加入核苷酸、DNA模板，最后加入聚合酶混合物。添加试剂的顺序对于合成加帽RNA至关重要。使用帽类似物配制类似的反应混合物，但需加入帽类似物核苷酸。在加入标准核苷酸后，轻轻涡旋混匀反应组分，短暂离心，然后将反应体系置于干式空气孵育箱中37摄氏度孵育两小时。作为内部对照，设置第二个反应，从线性化质粒c Luke中合成c Luke的加帽转录本，用于标准化gluc的表达。孵育结束后，从每个反应体系中去除DNA模板。加入70微升无核酸酶的水，随后加入10微升DNA、一份反应缓冲液，然后加入2微升DNA。在干式空气孵育箱中，于37摄氏度条件下孵育15分钟，使DNA发生反应。现在使用任何基于离心柱的RNA纯化试剂盒纯化反应产物，并使用NanoDrop™分光光度计对RNA进行定量。最后，使用Agilent RNA 6,000 nano试剂盒和Agilent 2100生物分析仪评估RNA的质量。对于标准加帽反应，将10微克纯化的未加帽gluc mRNA用15微升无核酸酶水中溶解。可根据需要相应放大。将RNA在65摄氏度加热10分钟以破坏其二级结构，随后置于冰上5分钟。进行加帽反应时，向变性RNA中加入加帽缓冲液、新稀释的GTP、蜗牛甲硫氨酸和痘苗病毒加帽酶。轻轻涡旋混匀反应组分，短暂离心，然后在37摄氏度的干式空气孵育器中孵育30分钟。孵育结束后，按照前一节末尾的方法对 RNA 进行纯化和分析。首先接种 HeLa 细胞。在 48 孔板的 28 个孔中，每个孔应含有 70,000 至 230,000 个细胞以及 150 µL 添加了 10% 血清的高糖 DMEM 培养基。将培养板在37摄氏度下孵育，直至细胞融合度达到60%至90%，通常需要16至24小时。当细胞准备就绪后，配制转染混合物。将RNA稀释至浓度为100纳克每微升。然后准备24个微量离心管，用于三种不同的反应，每种反应重复八次，共八管。每管加入1 µL未加帽的gluc RNA、1 µL加帽的c luke RNA用于归一化，以及25 µL无血清培养基。使用移液器将DMEM在接下来的八支试管中充分混匀。设置相同的反应，但在最后八支试管中，用使用帽类似物制备的加帽型gluc RNA替代未加帽的gluc RNA。现在将来自痘苗病毒反应的加帽型gluc RNA加入到第一组八支试管中，与未加帽的gluc RNA混合，并加入0.2微升mRNA增强试剂，随后再混入0.2微升。转录 mRNA 试剂允许反应在室温下进行，时间不超过五分钟。反应进行至两分钟时，开始将每种混合物逐滴转移至含有培养细胞的孔中。随后，对接下来的两组试管重复此步骤，这些试管中含有来自痘苗病毒反应的加帽、类加帽葡萄糖、RNA 以及加帽的葡萄糖 RNA。留出四个孔作为阴性对照，在37摄氏度、5%二氧化碳条件下将细胞培养过夜。上清液使用Biox GIA荧光素酶检测试剂盒进行Gluc检测。通过将15微升Biox Gluc底物加入1.5毫升Biox Gluc检测试剂缓冲液中，新鲜配制检测试剂溶液。最终混合物不要涡旋震荡。对于CLU检测，通过翻转试管混合。制备100倍新鲜重悬的底物。然后，将15微升重悬的底物加入1.5毫升Blu Ciena荧光素酶检测试剂缓冲液中，配制检测试剂溶液。轻轻混匀C Luke检测试剂溶液，避免涡旋震荡，并在避光条件下室温孵育30分钟。检测试剂溶液制备完毕后。使用微孔板发光仪测量细胞的发光强度。将发光仪设置为在2到10秒内注入50微升检测溶液。接着，将每种细胞培养上清液各10微升转移至96孔黑色培养板的孔中。用检测溶液预润注射器，然后进行发光度测定。T7高产量RNA合成试剂盒在Agilent 2100生物分析仪上分析时，每20微升反应体系可产生高达180微克的未加帽RNA，以及40至50微克的加帽RNA。质量良好，完整性高。RNA 应显示一个单一的尖锐峰，代表 RNA 转录本。宽峰或多峰表明 RNA 降解。还必须验证 R-N-A-R-N-A 的大小。转录产物长度长于预期可能是由于模板质粒未完全消化所致，而DNA-RNA降解以及产量降低通常是因模板引入反应体系中的污染物所导致。DNA转染后，进行孵育并检测荧光素酶活性。5'端帽结构对于保护RNA免受外切核酸酶降解以及促进翻译起始具有重要作用。因此，RNA加帽是转染实验中的关键步骤。转染了加帽与未加帽转录本的细胞培养物之间在检测到的发光信号上的差异明确支持了这一点，同时也表明使用帽类似物和使用痘苗病毒加帽酶的两种加帽技术均能成功生成具有功能性的加帽RNA转录本。观看本视频后，您应能够充分理解如何合成高质量的加帽RNA转录本，以用于转染及其他多种应用。

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学习体外转录合成带帽和不带帽的Gaussia荧光素酶mRNA，并通过转染HeLa细胞检测荧光素酶活性，比较两种加帽方法的效果。该方法适用于RNA功能研究和基因表达分析。

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