在体外转录和Gaussia荧光素酶基因的上限由HeLa细胞转染
March 26th, 2012
该方法描述了从含有 Gaussia 荧光素酶 （GLuc） 基因的线性化质粒中高产量地体外合成加帽和未加帽的 mRNA。纯化 RNA，并使用牛痘病毒加帽酶对一小部分未加帽的 RNA 进行酶促加帽。在最后一步中，将 mRNA 转染到 HeLa 细胞中，并检测细胞培养物上清液的荧光素酶活性。
该程序的总体目标是用加帽和未加帽的 mRNA、半乳荧光素酶转录物转染 hela 细胞，并检测细胞培养物中的荧光素酶活性。这是通过首先使用 T 7 高产量 RNA 合成试剂盒通过体外转录合成无加帽和加帽 mRNA（Gaia 荧光素酶的转录本）来实现的。展示了两种加帽 mRNA 的方法。
一种在转录过程中使用帽类似物，另一种使用牛痘加帽酶进行转录后加帽。下一步是将加帽和未加帽的 mRNA 转录本转染到螺旋细胞中。最终，在超级命名的 heli 细胞培养物中比较由未加帽或加帽的 mRNA 产生的荧光素酶活性。
与设置您自己的转录反应相比，这种方法的主要优势在于，T 7 高产量 RNA 合成试剂盒已经过测试和优化，可产生高产量，更重要的是，可产生高质量的全长 RNA 转录本。这对于成功的 RNA 翻译和功能活性蛋白的表达极为重要。因此，该方法提供了对 RNA 转染的见解体外转录的 RNA 也可用于其他应用，例如显微注射微阵列分析、基于杂交的印迹以及 RNA 结构和功能研究。
本示例反应的 DNA 模板是含有高斯荧光素酶或 gluc 基因的线性化质粒。使用 T 7 启动子，将合成加帽和无帽产品。首先解冻 T seven 高产量 RNA 合成试剂盒中的组分，并将它们保存在冰上。
为避免 RNA 污染，请戴上手套并彻底清洁工作台表面移液器和其他材料强烈建议使用不含核酸酶的移液器吸头、试管和玻璃器皿合成未加帽的 RNA。在室温下构建反应，从 10 x 缓冲液和水开始，然后是核苷酸，即 DNA 模板。最后，聚合酶混合物。
试剂添加的顺序对于合成加帽 RNA 很重要。使用 cap 类似物，制备类似的反应混合物，但添加 cap 类似核苷酸。加入标准核苷酸后，现在通过轻轻涡旋混合反应组分，然后脉冲、旋转并在 37 摄氏度下在干燥空气培养箱中孵育反应两周作为内部对照设置第二个反应，从线性化质粒 C Luke 表达合成 c Luke 的帽转录物 C Luke 表达用于标准化 gluc 表达。
孵育后，从每个反应混合物中去除 DNA 模板。加入 70 μL 无核酸酶水，然后加入 10 μL DNA、1 种反应缓冲液，然后加入 2 μL DNA。第一，让 DNA 在 37 摄氏度下在干燥空气培养箱中反应 15 分钟。
现在使用任何基于离心柱的 RNA 纯化试剂盒纯化反应，并使用 NanoDrop TM 分光光度计定量 RNA。最后，使用 Agilent RNA 6， 000 nano Kitt 和 Agilent 2100 生物分析仪评估 RNA 质量。对于标准加帽反应，在 15 μL 无核酸酶的水中加入 10 μg 纯化的未加帽 gluc mRNA。
这可以相应地扩大规模。将 RNA 在 65 摄氏度下加热 10 分钟以破坏二级结构，然后将其置于冰上 5 分钟。为了设置加帽反应，向变性 RNA 中加入加帽缓冲液 GTP 新鲜稀释的蜗牛蛋氨酸和痘苗加帽酶轻轻涡旋反应组分脉冲旋转，并在 37 摄氏度下在干燥空气培养箱中孵育反应 30 分钟。
孵育后，如上一节末尾所述，清理和分析 RNA。首先铺板 hela 细胞。在 48 孔板的 28 个孔中，每个孔应包含 70 至 230， 000 个细胞和 150 微升补充有 10% 血清的高葡萄糖 DMEM。
在37 摄氏度下孵育板，直到细胞达到 60% 至 90% 汇合，这应该需要 16 到 24 小时。当细胞准备好后，准备转染混合物。将 RNA 稀释至 100 ng/μL 的浓度。
然后设置 24 个微量离心管，用于三种不同的反应。复制 8 次，共 8 管。添加 1 μL 未加帽的 gluc RNA、1 μL 加帽的 c luke RNA 进行标准化和 25 μL 游离血清。
DMEM 始终在接下来的 8 个试管中使用移液器充分混合。设置相同的反应，但不添加未加帽的 gluc RNA，而是在最后八个试管中加入使用加帽类似物制备的加帽 gluc RNA。现在将来自牛痘反应的加帽 gluc RNA 加入第一组八管中，加入 0.2 μL mRNA 增强试剂中的未加帽 gluc RNA 混合物，然后混合 0.2 μL。
转运 mRNA 试剂允许反应在室温下进行不超过 5 分钟。反应开始 2 分钟后，开始将每种混合物滴加至装有培养细胞的孔中。对接下来的两组管重复此步骤，这些管包含来自牛痘反应的帽、类似帽 gluc、RNA 和加帽 gluc RNA。
留下四个孔作为阴性对照，在 37 摄氏度下以 5% 二氧化碳测定孵育细胞过夜。使用 Biox GIA 荧光素酶检测试剂盒进行 Gluc 检测的上述命名。通过将 15 微升 biox gluc 底物添加到 1.5 ml biox gluc 测定缓冲液中来制备新鲜的测定溶液。
不要涡旋最终混合物。通过试管倒置进行 CLU 测定混合。准备 100 x 新鲜重组的底物。
然后通过将 15 微升重构底物添加到 1.5 毫升 Blu Ciena 荧光素酶测定缓冲液中来制备测定溶液。混合 C Luke 检测溶液而不涡旋，并在室温下避光孵育 30 分钟。制备检测溶液。
使用微孔板发光仪测量细胞的发光。将光度计设置为在 2 到 10 秒内注入 50 μL 检测溶液。接下来，将 10 μL 每种细胞培养物超级名称转移到 96 的孔中，同时将板设为黑色。
用测定溶液灌注注射器并继续测量发光。在 Agilent 2100 生物分析仪上分析时，T 7 高产量 RNA 合成试剂盒每 20 μL 反应可产生高达 180 μg 的无加帽 RNA 和 40 至 50 μg 加帽 RNA。质量好。
RNA 应显示一个代表 RNA 转录本的尖峰。一个宽峰或多个峰表示 RNA 降解。验证 R-N-A-R-N-A 的大小也很重要。
转录本长度长于预期可能是由于模板质粒消化不完全、D-N-A-R-N-A 降解和较低产量通常是从模板引入反应中的污染物的结果。DNA 转染后进行孵育和检测荧光素酶活性。五个引物帽结构对于保护 RNA 免受核酸外切酶降解和促进翻译起始非常重要。
因此，RNA 加帽是转染实验的重要步骤。用加帽转录本和未加帽转录本转染的细胞培养物之间测得的发光差异清楚地支持了这一点，并且还表明使用加帽类似物的加帽技术和使用痘苗加帽酶的加帽技术都成功地产生了功能性加帽 RNA 转录本。观看本视频后，您应该对如何合成高质量的加帽 RNA 转录本以用于转染和其他各种应用有很好的了解。
概述
该方法描述了从含有高氏萤火虫萤光酶（GLuc）基因的线性质粒中高产量体外合成带帽和不带帽的mRNA。合成的RNA经过纯化，在转染到HeLa细胞之前，一部分不带帽的RNA使用痘苗病毒帽化酶进行酶促帽化，然后用于萤光酶活性测定。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 细胞生物学
- 分子生物学
背景
- 体外转录是从DNA模板产生RNA的方法。
- 带帽的mRNA对于稳定性和翻译效率至关重要。
- 高氏萤火虫萤光酶用于评估mRNA功能。
- HeLa细胞常用于转染研究。
研究目的
- 合成GLuc基因的带帽和不带帽mRNA转录本。
- 比较带帽和不带帽mRNA在HeLa细胞中的萤光酶活性。
- 展示T7高产量RNA合成试剂盒的效率。
使用的方法
- 使用T7 RNA聚合酶试剂盒进行体外转录。
- 使用痘苗病毒帽化酶对不带帽RNA进行酶促帽化。
- 将合成的mRNA转染到HeLa细胞中。
- 萤光酶活性测定以测量GLuc的表达。
主要结果
- 成功合成了高质量的带帽和不带帽mRNA。
- 展示了带帽和不带帽mRNA之间的萤光酶活性差异。
- 验证了T7高产量RNA合成试剂盒用于生产全长RNA转录本的有效性。
- 提供了RNA转染方法的见解。
结论
- 该方法有效地合成并将mRNA转染到HeLa细胞中。
- 帽化改善了mRNA的稳定性和翻译效率。
- 这种方法可以应用于萤光酶测定之外的各种RNA应用。
常见问题
Executive Industry Relevance
This method enables biopharma R&D teams to generate high-quality capped and uncapped mRNA transcripts for functional validation in mammalian cells, supporting target de-risking and assay development workflows. By comparing luciferase activity from capped versus uncapped RNA, teams gain quantitative insights into mRNA stability and translational efficiency—key factors in predictive confidence for RNA-based therapeutics. The approach provides a scalable, reproducible platform for early-stage mechanistic screening and lead identification in RNA drug discovery pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of mRNA functionality through luciferase reporter assays, supporting target hypothesis testing and pathway clarification.
- Operational Value: Provides standardized, high-yield RNA production using optimized kits, reducing variability in transfection experiments.
- Predictive Value: Differentiates capped and uncapped mRNA performance to inform RNA design decisions and improve translational success rates.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative luciferase readouts that enable dose-response and structure-activity relationship analysis for mRNA variants.
- Operational Value: Produces consistent, full-length RNA transcripts suitable for high-throughput transfection and screening platforms.
- Assay Readiness: Supports normalization strategies using internal control RNAs (e.g., CLuc) to improve data reliability across experimental conditions.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Bridges in vitro RNA synthesis with cellular functional readouts, enabling risk-adjusted advancement decisions.
- Mechanistic De-risking: Validates RNA capping strategies that enhance stability and translation—critical for mRNA therapeutic development.
- Predictive Confidence: Supports go/no-go decisions by linking molecular modifications to measurable cellular outcomes.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the early discovery to lead identification continuum, providing a reliable source of functional mRNA for downstream screening and validation efforts.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing via luciferase reporter assays to assess mRNA design impacts on protein expression.
- Screening: Enables preparation of standardized RNA libraries for transfection-based screening in mammalian cells.
- Analytics: Delivers quantitative luminescence measurements that allow comparison of capped versus uncapped mRNA performance.
- Translational Research: Connects RNA synthesis to cellular functionality, supporting biomarker-aligned evaluation of mRNA modifications.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable RNA production and transfection workflow applicable across multiple targets and projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Enhances predictive confidence in mRNA design by demonstrating the functional impact of 5' capping on translation and stability.
- Operational Value: Ensures reproducibility through standardized kits and purification steps, reducing batch-to-batch variability.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling early de-risking of RNA candidates before significant investment.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of mRNA constructs based on empirical translational efficiency data.
Implementation Considerations
- Requires molecular biology expertise in RNA handling, in vitro transcription, and enzymatic capping procedures.
- Depends on access to T7 RNA polymerase kits, capping enzymes, and RNA purification systems (e.g., spin columns).
- Necessitates standardized transfection protocols and luciferase assay instrumentation for consistent results.
- Involves quality control steps (e.g., NanoDrop, Bioanalyzer) to confirm RNA integrity and size before cellular application.
- Adaptation to alternative cell lines or reporter systems may require optimization of transfection reagents and assay conditions.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:33
In vitro Transcription using the T7 High-yield RNA Synthesis Kit
3:29
RNA Capping using the Vaccinia Capping System
4:17
HeLa Cell Transfection using the TransIT mRNA Transfection Kit
6:08
Gaussia Luciferase (GLuc) and Cypridina Luciferase (CLuc) Assays
7:20
Representative Results
8:36
Conclusion
