在斑马鱼模型的胎儿酒精暴露评估致畸的变化
2012年3月20日
为了了解乙醇诱导发育损伤的分子机制，我们已经开发的乙醇暴露斑马鱼模型，并正在探索乙醇暴露后发生的物理，细胞和基因改变 1。然后，我们来寻求潜在的干预和快速测试他们在这个动物模型。
该程序的总体目标是研究乙醇暴露对发育中的斑马鱼的影响。这是通过在早期发育期间首先将斑马鱼暴露在正常胚胎水中接触乙醇剂量来实现的。接下来，去除乙醇，让鱼发育到所需的时间点。
然后，与对照胚胎相比，在处理的胚胎中检测粗略的身体变化以及基因表达的改变。最后，用 mRNA、形态或药物纵胚胎，以确定是否可以改变乙醇诱导的发育缺陷。最终，定量 PCR 和 C 中两种杂交的组合表明，乙醇对发育中的斑马鱼胚胎的影响与基因表达变化有关。
随后对基因表达水平的纵可能会改善或防止乙醇诱导的发育缺陷。我们今天展示的技术扩展了我们对胎儿酒精综合征性质的了解，并保护了脊椎动物的发育过程。今天将由 Steph Erhardt 演示，他是我实验室的一名技术员 To treat embryos with ethanol.
将它们从野生型交配饲养到圆顶阶段，在 28 摄氏度的胚胎水中。将胚胎从一窝中分成所需数量的培养皿，每培养皿 10 到 50 个胚胎。将 0.2% 至 2.5% 体积的乙醇溶液在鱼水中加入到胚胎中，并在所需的暴露时间后放回培养箱中长达 24 小时。
在特定发育期间，用新鲜胚胎水代替含乙醇的水，以收集 mRNA 进行定量 PCR。将 H 匹配的胚胎放入 einor 管中。去除鱼水并加入含 TCEP 的裂解缓冲液。
使用电动粉碎机，物理分离胚胎，然后放入离心机中缓慢旋转。将溶质转移到预澄清柱中，然后离心柱。删除已解离的大块。
使用 RNA 分离试剂盒提取 RNA。然后使用 QPCR 或微阵列分析的标准方法合成 CDNA，以制备用于 C 两次杂交和抗体声明的胚胎。受精后 6 至 24 小时，将胚胎在 4% 对甲醛中在 4 摄氏度下固定过夜，然后洗涤 3 次和 PBS 加 0.1% 吐温。
在显微镜下用两个锋利的镊子取出 choon。然后使用一系列增加甲醇浓度和降低 PBT 浓度的液体变化将胚胎移入甲醇中。将胚胎转移到 100% 甲醇中后，将它们储存在零下 20 摄氏度以染色软骨。
将胚胎饲养到受精后 5 或 6 天。将它们在 4 摄氏度的 4% 多聚醛中固定过夜。然后在 PBT 中洗涤它们 3 次，以确定哪些基因表达水平因乙醇暴露而发生变化。
通过首先设计引物来验证引物来执行 QPCR。在三个生物样品上测试它们。这些对照生物样品可以是任何年龄，只要目标基因在该特定年龄表达即可。
一旦引物得到验证，使用先前制备的 CDNA 进行一式三份的 QPCR 运行样品，包括斑马鱼对照的对照样品，我们使用引物来间隙 dh。将结果标准化以达到 DH 水平差距。然后使用强大的方法计算基因表达的相对水平。
两个 delta delta CT 的变化显示相对于野生型的实验差异。对于 C 中两个杂交构建体。将标记的核糖探针抛弃到目标基因上。
然后使用标准条件将它们与年龄匹配的胚胎一起孵育，并使用碱性磷酸酶检测杂交模式，使用解剖显微镜对样本进行成像以评估形态发生发育，例如可能对活胚胎进行形状成像以评估眼距和体长。首先，将胚胎固定在对位甲醛中。然后收集图像以检查酒精处理对幼虫染色中发育中的软骨结构的影响。
使用 lc 和 blue 固定斑马鱼数小时，以在成像前过夜拘留和清除胚胎。通过将活胚胎与 5 毫克/毫升的 aine orange 在 PBS 中孵育 1 小时来分析活胚胎中的细胞死亡。在 PBS 中洗涤胚胎 3 次，然后将胚胎安装在载玻片上，使用共聚焦显微镜对样品进行成像，并使用 Z 系列创建复合材料。
在鉴定出因乙醇暴露而表达降低的基因后，将目标基因的加帽 mRNA 每 nL 注射 25 至 200 pg 到 1 至 2 个细胞阶段。让鸡蛋在 28 摄氏度的加热培养箱中恢复，直到它们达到圆顶阶段，然后像以前一样用乙醇处理它们。对于因乙醇暴露而表达增加的基因，通过将皮克级至纳克量的反义形态注射到一到两个细胞期胚胎中来敲低它们。
该方案类似于加帽 mRNA 的方案。如果注射 mRNA，剪接 morpho，使用 R-T-P-C-R 测量效率，以比较剪接和未切片转录物的数量，以分析剂量依赖性基因活性，滴定注射的 morino 并让胚胎发育到所需阶段，然后再用乙醇处理它们。斑马鱼胚胎暴露于乙醇会导致许多发育和遗传缺陷，这些缺陷与其他脊椎动物的表型有关。
包括 Noor 在内的中轴组织的异常发育导致 noord 缩短和偶尔中断，这在一定程度上导致体节后期异常，如图所示。虽然未经处理的对照具有强烈的 V 形，但乙醇处理的体节呈现出 U 形外观，声波刺猬信号减少。如图所示。
乙醇暴露的另一个后果，可能是早期发育迟缓和随后的 Noor 缺陷的下游是胚胎长度缩短。这一发现类似于在发育过程中暴露于乙醇的儿童中发现的青春期前、身材矮小的持续性，这表明斑马鱼模型与理解这种人类先天缺陷有关。动物模型已经证明，严重的乙醇暴露会导致明显的胎儿酒精综合征表型，包括 synthia 和 opia。
在斑马鱼中，眼距或 IOD 以乙醇剂量依赖性方式降低，这与人类出生缺陷的性质一致。Opia 仅在非常高的剂量下发现，但较低剂量确实会显着降低 IOD，这表明该动物模型在中线面部发育方面存在类似的缺陷。在该图中，比较了未处理和乙醇处理的胚胎中 6 个 3 B 和 glee 1 的早期基因表达水平。
这两个基因在乙醇处理的样品中均表现出表达水平降低。使用 NC two 杂交，分析了 six three B 和 gooID 的表达模式。在这里，与未处理的对照相比，这两个基因在乙醇处理的胚胎中都显示空间表达降低。
因为这两个基因都在注定要成为 C 颅面中线组织的组织中表达，所以它们在受精后 8 小时的减少与发育后期 IOD 的减少一致。一旦确定了受乙醇影响的基因，就存在增加或减少其表达的机制。在这个例子中，为声波刺猬注射了 mRNA，这是一种增加 glee one 水平的配体，它挽救了由于 glee one 和乙醇处理的胚胎减少而导致的严重缺陷。
然而，注射 6 个 3 B 无法挽救乙醇暴露的表型。看完这段视频，你应该对如何探索乙醇（一种发育中的斑马鱼胚胎）产生的遗传和发育缺陷有一个很好的了解。这里使用的技术也可以应用于那些想要研究发育中的脊椎动物胚胎的其他水溶性化合物的毒性的人。
概览
本研究调查乙醇暴露对发育中的斑马鱼的影响，重点关注物理、细胞和基因改变。研究旨在识别缓解乙醇诱导的发育损害的潜在干预措施。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 发育生物学
- 毒理学
背景
- 发育过程中的乙醇暴露可能导致显著的缺陷。
- 斑马鱼作为研究这些影响的模型生物。
- 了解基因表达的变化对于识别干预措施至关重要。
- 胎儿酒精综合症是发育过程中的一个关键关注领域。
研究目的
- 探索乙醇诱导的发育损害背后的分子机制。
- 评估斑马鱼胚胎的物理和基因改变。
- 测试可能预防或减轻这些影响的潜在干预措施。
使用的方法
- 在早期发育过程中，胚胎暴露于不同浓度的乙醇。
- 使用定量PCR和原位杂交分析基因表达。
- 使用mRNA、morpholinos或药物对胚胎进行操作以评估干预效果。
- 比较处理组和对照组之间的物理变化和基因表达改变。
主要结果
- 乙醇暴露导致类似于胎儿酒精综合症的发育缺陷。
- 基因表达变化与斑马鱼胚胎的物理异常相关。
- 针对基因表达的干预可能改善乙醇暴露胚胎的结果。
- 研究结果有助于了解乙醇对脊椎动物发育的影响。
结论
- 斑马鱼模型有效地展示了乙醇对发育的影响。
- 识别基因表达变化对于开发干预措施至关重要。
- 本研究增强了我们对胎儿酒精综合症及其机制的理解。
常见问题
Executive Industry Relevance
Quantitative assessment of teratogenic effects in zebrafish embryos exposed to ethanol enables early-stage de-risking of developmental toxicity for candidate compounds. This model provides predictive confidence for identifying gene expression changes and morphological endpoints relevant to human fetal alcohol spectrum disorders. Integrating these outputs into discovery pipelines supports translational continuity and risk-adjusted portfolio decisions.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of developmental toxicity mechanisms through gene expression and phenotypic analysis.
- Supports functional validation of candidate targets implicated in teratogenic pathways.
- Facilitates mechanistic de-risking by linking molecular changes to observable developmental defects.
- Provides a platform for triaging compounds based on early developmental safety signals.
Screening & Assay Development
- Establishes a reproducible zebrafish embryo assay for teratogenicity screening of water-soluble compounds.
- Delivers quantitative outputs such as intraocular distance and somite morphology for standardized readouts.
- Enables scalability for parallel compound evaluation and intervention testing.
- Supports assay standardization and cross-study reproducibility through defined exposure and measurement protocols.
Translational & Preclinical Research
- Aligns developmental endpoints with human fetal alcohol syndrome phenotypes for translational relevance.
- Enables biomarker identification by correlating gene expression changes with morphological outcomes.
- Supports continuity from discovery through preclinical safety assessment for developmental toxicology.
- Provides predictive value for human risk by modeling conserved vertebrate developmental processes.
Pipeline & Workflow Integration
This zebrafish model integrates into the discovery-to-preclinical continuum for developmental toxicity assessment and target validation.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on teratogenic mechanisms and gene function in vertebrate development.
- Screening: Provides quantitative, reproducible endpoints for early-stage compound triage.
- Analytics: Enables statistical comparison of gene expression and morphological changes between treated and control groups.
- Translational Research: Bridges discovery findings to preclinical safety by modeling human-relevant developmental defects.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable platform for evaluating diverse compounds and genetic interventions in developmental biology.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in developmental toxicity and target validation.
- Operational Value: Standardizes teratogenicity assays for reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions by providing early safety and mechanistic data.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of compounds with favorable developmental safety profiles.
Implementation Considerations
- Requires expertise in zebrafish embryology and molecular analysis techniques.
- Needs access to imaging, quantitative PCR, and in situ hybridization infrastructure.
- Demands cross-team standardization of exposure protocols and measurement endpoints.
- Adaptable to other water-soluble compounds and genetic manipulations in vertebrate embryos.
- Limitations include species-specific differences and the need for careful dose selection to model human-relevant exposures.
