评估酒精暴露胎儿斑马鱼模型中的致畸变化

本实验的总体目标是研究乙醇暴露对斑马鱼发育过程的影响。首先，在斑马鱼早期发育阶段，将其暴露于含乙醇的正常胚胎水中以施加乙醇剂量。随后，去除乙醇，使斑马鱼继续发育至预定的时间点。

然后，将经处理的胚胎与对照组胚胎相比，检测其宏观形态学变化以及基因表达的改变。最后，通过mRNA、吗啉代寡核苷酸（morpholinos）或药物对胚胎进行干预，以确定乙醇诱导的发育缺陷是否可以被改变。最终，定量PCR与原位杂交实验结果表明，乙醇对斑马鱼胚胎发育的影响与基因表达的变化相关。

后续对基因表达水平的操作可能改善或预防乙醇诱导的发育缺陷。我们今天演示的技术将拓展我们对胎儿酒精综合征本质以及脊椎动物发育过程保守机制的认识。今天进行演示的是我实验室的技术员Steph Erhardt，她将展示如何用乙醇处理胚胎。

将野生型交配获得的胚胎置于28摄氏度的胚胎水中培养至囊胚期。将一窝胚胎分装至若干培养皿中，每皿放置10至50个胚胎。在鱼水中加入终浓度为0.2%至2.5%（体积比）的乙醇溶液处理胚胎，按所需处理时间完成暴露后，将胚胎放回培养箱继续培养最多24小时。

用新鲜的胚胎水替换含有乙醇的水，培养特定发育阶段以收集 mRNA 用于定量 PCR。将 H 期匹配的胚胎放入 einor 管中。去除鱼水，加入含有 TCEP 的裂解缓冲液。

使用电动研磨器对胚胎进行物理解离，然后置于离心机中低速离心。将上清液转移至预清除柱，随后离心该柱，以去除解离后的大块碎片。

使用RNA提取试剂盒提取RNA。然后采用QPCR或微阵列分析的标准方法合成cDNA，以制备用于原位杂交和抗体染色的胚胎。在4°C条件下，用4%多聚甲醛固定受精后6至24小时的胚胎，过夜，随后用含0.1%吐温的PBS洗涤三次。

在显微镜下使用两把尖头镊子去除卵膜。然后通过一系列甲醇浓度递增、PBT 浓度递减的液体更换步骤，将胚胎转移至甲醇中。待胚胎完全转移至 100% 甲醇后，于 -20 摄氏度保存，以用于软骨染色。

将胚胎培养至受精后五到六天。在4%多聚甲醛中于4摄氏度固定过夜。然后用PBT清洗三次，以确定乙醇暴露引起的基因表达水平变化。

首先设计引物以验证引物，然后进行qPCR。在三个生物学样本上进行测试。这些对照生物学样本可以来自任何年龄阶段，只要目的基因在该特定年龄阶段有表达即可。

引物验证完成后，使用先前制备的cDNA进行qPCR，每个样本设三个复孔，并包括一个斑马鱼对照样本，我们使用gap dh的引物。以gap DH水平对结果进行标准化，然后采用2−ΔΔCt法计算基因表达的相对水平。

相对于野生型，双ΔΔCT法的变体展示实验组的差异。用于酵母双杂交构建。使用标记的核糖探针检测目的基因。

然后在标准条件下，将它们与同龄胚胎共同孵育，并使用碱性磷酸酶检测杂交模式，利用解剖显微镜对样本进行成像，以评估形态发生发育情况，例如观察眼间距和体长等。首先，用对苯二甲醛固定胚胎，然后采集图像，以检查酒精处理对幼虫染色中软骨结构发育的影响。

使用 lc 和蓝色固定斑马鱼胚胎，固定时间数小时至过夜，以固定并清除胚胎，便于成像。通过将活胚胎在含 5 mg/mL 碘化丙啶橙的 PBS 中孵育 1 小时，分析胚胎中的细胞死亡情况。用 PBS 洗涤胚胎三次，然后将胚胎置于载玻片上，使用共聚焦显微镜对样品进行成像，并采用 Z 轴序列图像生成复合图像。

在确定因乙醇暴露而导致表达下调的基因后，将每纳升含有25至200皮克的感兴趣基因的加帽mRNA注入一个至两个细胞期的胚胎中。将卵置于37°C恒温培养箱中孵育，使其恢复并发育至囊胚期，随后如前所述进行乙醇处理。对于因乙醇暴露而表达上调的基因，可通过在一个至两个细胞期的胚胎中注射皮克至纳克量级的反义吗啉代寡核苷酸（antisense morpholino）以实现基因敲低。

该方案与带帽mRNA的方案类似。若注射的是mRNA剪接形态，应使用RT-PCR检测剪接与未剪接转录本的相对量，以分析基因表达的剂量依赖性。需对注射的吗啉寡聚物进行梯度滴定，并让胚胎发育至所需阶段后再用乙醇处理。斑马鱼胚胎暴露于乙醇会导致多种发育和遗传缺陷，这些缺陷与其他脊椎动物中观察到的表型相关。

轴向组织（包括脊索）发育异常会导致脊索缩短并偶有中断，从而部分引起体节后续的异常，如图所示。未经处理的对照组体节呈现明显的V形，而经乙醇处理的体节则呈现U形外观，这与音猬因子（sonic hedgehog）信号通路减弱时的表型一致，如图所示。

乙醇暴露的另一个后果可能是早期发育延迟及随后的Noor缺陷所导致的胚胎长度缩短。这一发现类似于在发育期间暴露于乙醇的儿童中观察到的青春期前持续状态和身材矮小，提示斑马鱼模型对于理解此类人类出生缺陷具有相关性。动物模型已证实，严重的乙醇暴露可导致显著的胎儿酒精综合征表型，包括synthia和opia。

在斑马鱼中，眼内距（IOD）随乙醇剂量增加而减小，这与人类出生缺陷的特征一致。小眼球仅在极高剂量下出现，但较低剂量即可导致 IOD 显著减小，提示该动物模型在面部中线发育方面存在类似的缺陷。在本图中，比较了未经处理和经乙醇处理的胚胎中三个 b 基因和 glee1 基因的早期表达水平。

两个基因在乙醇处理的样品中均表现出表达水平降低。通过使用NC二元杂交技术，分析了six three B和gooID的表达模式，如图所示。在此，与未经处理的对照组相比，这两个基因在乙醇处理的胚胎中均显示出空间表达的减少。

由于这两个基因均在将发育为颅面中线结构的组织中表达，因此受精后八小时时其表达量的降低与后续发育过程中眼间距（IOD）的减小相一致。一旦确定了受乙醇影响的基因，便可采用相应方法调节其表达水平。在此示例中，通过注射 sonic hedgehog 的 mRNA（一种可提升 glee one 水平的配体），恢复了因 glee one 减少以及乙醇处理胚胎所导致的严重发育缺陷。

然而，注射六三B未能挽救乙醇暴露后的表型。观看本视频后，您应能充分理解如何探究乙醇对发育中斑马鱼胚胎所导致的遗传与发育缺陷。本实验所采用的技术也可适用于希望研究其他水溶性化合物对发育中脊椎动物胚胎毒性的研究人员。