小鼠精子冷冻保存与复苏——使用 I·Cryo 试剂盒

本实验的总体目标是冷冻保存小鼠精子。首先使用冷冻保存吸管从小鼠附睾尾部收集精子，然后将吸管置于液氮中冷冻并长期储存，待需要时通过在温水中解冻来恢复精子活性。

回收的小鼠精子最终用于体外受精。该试剂盒相较于现有方法的主要优势在于，其包含了冷冻保存和回收小鼠精子所需的所有必要材料。通常，初次使用该方法的研究人员可能在操作和装填麦管时遇到困难。首先，为每株需要冷冻保存的小鼠准备15根精子冷冻保存麦管。

首先，将每支0.25毫升的细管与一支1毫升注射器连接，棉塞端靠近注射器。其次，向每支细管中加入8厘米长的体外受精（IVF）培养基，随后加入1厘米长的空气段。第三，对需要冷冻保存的每一品系，用其品系名称标记15支细管。

在四孔板的一个孔中加入 240 微升冷冻保护剂。将一个 1 毫升移液器连接到冷冻罐的手柄上以延长手柄。最后，用 kit 提供的泡沫绝缘盒装入 15 厘米深的液氮，并盖上盖子以实施安乐死。

两只具有生育能力的成年雄性小鼠。对每只小鼠进行手术，取出其附睾附体。将小鼠置于背侧卧位，切开腹壁。

轻轻牵拉附睾管，去除多余的脂肪组织。接着，找到附睾，并连同少量附睾管完整切除。将附睾置于已加入冷冻保护剂的四孔培养皿中的一个孔内，在解剖显微镜下操作。

在每侧附睾上做五到七条纵向切口。然后用镊子轻轻挤压每条切口，以挤出精子。将冷冻保护剂与附睾混合物在室温下孵育三到五分钟，以促进精子释放。

孵育期间用手轻轻晃动培养皿两到三次。这将使精子通过抽吸游出。每个制备好的细管中加入五毫米的精子悬液，随后加入一厘米的空气。

冷冻过程中，确保所有细管装载量一致非常重要。装载完全部15根细管后，仔细热封每根细管的两端。为保证精子存活率，需在10分钟内完成全部15根细管的操作过程。

所有吸管准备好后，将其装入冷冻罐的精子柱中。首先，将冷冻罐放入泡沫盒中，使其在液氮中保持垂直漂浮状态。冷冻罐必须垂直漂浮10分钟，否则会影响精子的冷冻速率。

然后将罐体浸入液氮中。精子由此实现冷冻保存，可长期存放在液氮中。在计划取精前约60小时。

在进行体外受精（IVF）前，请按照书面方案对雌性动物进行超数排卵处理。每解冻一支冻存管，需提前至少一小时将所有培养基在37摄氏度、5%二氧化碳条件下预热平衡。所需材料包括一个35毫米的培养皿，内含一滴90微升的精子处理液，并以矿物油覆盖。

准备一个含有3毫升IVF培养基的35毫米培养皿作为切割皿；每五只超排卵的雌性小鼠，准备一个IVF培养皿，即在四孔板的一个孔中加入500微升IVF培养基。为每个IVF培养皿准备一个洗涤皿，即含有3毫升KSOM培养基的35毫米培养皿，以及一个胚胎培养皿，即含有覆盖于油下的50微升KSOM培养基液滴的35毫米培养皿。在准备好所有所需材料后，迅速从储存液中取出一根麦管，放入37°C水浴中解冻2至3分钟。

将吸管晾干。然后在棉塞下方的气柱处，在空气中做一斜切。在吸管的另一端，在另一气柱上方再做一次斜切。

避免切断精子柱。现在使用200微升移液器从吸管末端吸取精子悬液，并将其滴加至精子处理液的中央。然后将培养皿孵育45至60分钟。

精子孵育期间，分离超排卵雌性小鼠的输卵管壶腹部，并将其转移至切割皿中。使用30号针头或镊子撕开每根输卵管，释放出卵丘细胞复合体。将来自五只雌性小鼠的卵丘细胞复合体转移至每一份体外受精液（IVF）中。

使用最少量的培养基进行操作。避免转移脂肪和血液，因为污染的培养基会抑制受精效率。孵育后，从STM液滴边缘收集10至15微升精子悬液，并将该悬液转移至一个IVF液滴中。

现在将细胞共培养4至6小时以进行受精。受精后，在洗涤皿中用至少2K SOM溶液洗涤胚胎至少两次。然后进行培养。

将胚胎置于KSOM培养液中，直至达到所需的发育阶段。来自五个Charles River近交系小鼠品系的精子被冷冻保存。这五个品系精子的活力保护率和快速前向运动活力保护率分别为81%至47%。

在过去一年半中，不同品系小鼠使用冻融精子进行体外受精（IVF）的成功率介于26%至88%之间。通过精子冷冻保存技术，共存档了49个转基因小鼠品系，并随后利用体外受精技术在四种不同的雌性小鼠品系中成功恢复。这些品系包括C57BL/6、DBA/1和129/SV。一旦掌握该技术，若操作得当，精子冷冻保存过程可在30分钟内完成。

进行此操作时，重要的是要将气流垂直导入罐中，并使用液氮。