Name: 精子冷冻保存和恢复使用I ·冷冻包 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-12-12T12:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 6 s
Description: 学习使用I·Cryo试剂盒对小鼠精子进行冷冻保存与复苏，通过液氮冷冻和体外受精技术实现基因修饰小鼠品系的长期保存与高效恢复，为生殖生物学研究提供可靠方法。

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本研究所述工作由查尔斯河实验室（Charles River）资助。作者对基因工程模型与服务团队以及胚胎学工作人员在动物护理和激素注射方面提供的帮助表示最诚挚的感谢。

1. 小鼠精子冷冻保存
<ol>
	<li>对于每一条需要冷冻保存的样本，开始前需准备以下物品。
	<ol>
		<li>4孔板中的1个孔，加入240 µl试剂盒CPA</li>
		<li>15 根精子冷冻保存细管，具体如下
		<ol>
			<li>将0.25 ml细管与1 ml注射器连接，棉塞端靠近注射器。每根细管中加入8 cm（约 160 μl加入 IVF 培养基，然后加入 1 cm 空气。用待保存品系的名称标记细管。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>LN2 应将泡沫箱中的样品置于15 cm深度处。盖上盖子。</li>
	<li>对每种需冷冻保存品系的雄性小鼠各处死2只，小鼠年龄应在10至60周龄之间。从小鼠体内取出双侧尾部附睾及输精管。</li>
	<li>将附睾放入预先准备好的含有CPA的4孔板孔中（步骤1.1）。</li>
	<li>在每侧附睾上做5-7个纵向切口，并轻轻挤压每条输精管以挤出精子。</li>
	<li>在室温下轻轻用手摇动CPA与附睾的混合物3-5分钟，以使精子游出。</li>
	<li>使用先前准备好的吸管，吸取5 mm（约 10 μl精子悬液的体积，然后加入1 cm空气。</li>
	<li>重复此过程，最多共处理15根麦管。为获得最佳精子存活率，应在10分钟内完成麦管的装载与封口。</li>
	<li>仔细热封吸管的两端。将吸管放入冻存罐中，确保精子柱一端先进入。</li>
	<li>将试剂盒中提供的1 ml移液器连接到罐体上以延长手柄。将罐体置于液氮中2 通过盖子上的孔将罐体放入泡沫箱中，使其在液氮中垂直漂浮2 10 分钟。</li>
	<li>将罐体浸入液氮中。精子现已冷冻保存，可转移至长期液氮储存2 储存</li>
	<li>只有当罐体升温至室温后，才能用于下一条线。</li>
</ol>
2. 小鼠超数排卵
<ol>
	<li>通常使用与精子供体相同遗传背景的年轻雌性小鼠。</li>
	<li>小鼠体重应约为 12 g（3–4 周龄）。</li>
	<li>腹腔注射 5–10 IU 孕马血清促性腺激素（PMSG）。</li>
	<li>等待 46–48 小时。</li>
	<li>腹腔注射 5–10 IU 人绒毛膜促性腺激素（hCG）。</li>
	<li>在 hCG 注射后 14–16 小时收集卵母细胞，具体方法如下所述。</li>
</ol>
3. 小鼠精子回收与体外受精
<ol>
	<li>在进行体外受精（IVF）之前，针对每一根需要解冻的麦管，准备以下物品，并在37°C、含CO2的培养箱中平衡至少一小时。
	<ol>
		<li>精子孵育皿：一个35 mm的培养皿，内含90 μl精子处理液（STM），表面覆盖矿物油。</li>
		<li>切割皿：用于最多10只超排卵雌鼠的卵母细胞收集，一个35 mm培养皿中加入3 ml体外受精液（IVF medium）。</li>
		<li>体外受精孔：每5只超排卵雌鼠用于体外受精时，使用4孔板中的一个孔，加入500 μl体外受精液（例如，若使用10只超排卵雌鼠，则需要2个孔）。</li>
		<li>洗涤皿：一个35 mm培养皿，内含3 ml钾离子简单优化培养基（KSOM），用于洗涤4孔体外受精板中的每个孔。</li>
		<li>培养皿：一个35 mm培养皿，内含以矿物油覆盖的50 μl KSOM液滴，用于从每个体外受精孔中获得的胚胎进行培养。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>从液氮（LN2）中取出一根麦管，放入37°C水浴中解冻2-3分钟。</li>
	<li>将麦管从水浴中取出，擦干表面多余水分。在靠近棉塞端的第一个气柱附近进行第一次切割。将麦管切开并置于体外受精液中，此时在精子段之前仍可见一个气柱。</li>
	<li>然后在第二个气柱处切断麦管末端，注意避免切到精子段。以45度角切割——这将使精子更易于吸取。</li>
	<li>使用200 μl移液器从麦管远端吸取精子悬液。</li>
	<li>将精子悬液置于STM液滴中央，并将培养皿放入37°C、5% CO2培养箱中孵育45-60分钟。</li>
	<li>在精子孵育期间，将超排卵雌鼠的输卵管解剖至切割皿中。使用30号针头或镊子撕开每根输卵管，释放出卵丘-卵母细胞复合体（COCs）。避免将脂肪和血液带入体外受精液中，因为污染的培养基会增加额外的洗涤步骤。</li>
	<li>待所有输卵管均被撕开后，将来自5只雌鼠的COCs转移至每个体外受精孔中。超排卵所产生的COCs数量因品系而异。</li>
	<li>从STM液滴边缘吸取10-15 μl精子悬液，在人绒毛膜促性腺激素（hCG）注射后约14-16小时对一个体外受精孔进行受精。对所使用的每个孔重复此受精操作。最终精子浓度约为100万/ml。</li>
	<li>将精子与卵母细胞共同培养4-6小时，置于37°C、5% CO2培养箱中。</li>
	<li>用KSOM至少洗涤胚胎两次，然后将其转移至KSOM液滴中，在37°C、5% CO2培养箱中继续培养以促进发育。</li>
	<li>体外受精率的计算方法为：过夜培养后，二细胞期胚胎数占所用总卵母细胞数的比例。</li>
</ol>
4. 代表性结果
对5种查尔斯河小鼠近交品系的精子进行了冷冻。保护率通过将冷冻精子的评估值除以新鲜精子的评估值得出。C57BL/6NCrl、129S2/SvPasCrl、FVB/NCrl、DBA/2NCrl 和 BALB/cAnNCrl 品系的精子运动性保护率分别为 60.2%、81.3%、78.6%、66.5%、61.0%。快速前向运动性的保护率在 C57BL/6NCrl、129S2/SvPasCrl、FVB/NCrl、DBA/2NCrl 和 BALB/cAnNCrl 品系中分别为 47.3%、69.4%、57.0%、52.8%、54.1%（图1）。
C57BL/6NCrl、129S2/SvPasCrl、FVB/NCrl、DBA/2NCrl 和 BALB/cAnNCrl 小鼠使用冻融精子的体外受精率分别为 55.7%、26.4%、87.3%、87.8% 和 26.2%（图 2）。
在1.5年期间，通过精子冷冻保存技术保存了49个转基因小鼠品系。这些品系随后通过体外受精（IVF）在4种雌性小鼠品系（C57BL/6、BALB/c、DBA/1和129Sv）中成功恢复（以产生活仔为定义标准）（图3）。
<img alt="保护率图表；小鼠品系运动性研究；柱状图；遗传变异分析。" src="/files/ftp_upload/3713/3713fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 1."> 
图 1. 小鼠精子运动性与快速前向运动性的保护率
<img alt="Bar graph; two-cell embryo development (%) across mouse strains; genetic research results." src="/files/ftp_upload/3713/3713fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 2."> 
图2. 体外 小鼠冻融精子的体外受精
<img alt="遗传品系胚胎发育图表；柱状图按供体品系比较体外受精卵母细胞结果。" src="/files/ftp_upload/3713/3713fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图3。"> 
图3。 体外 受精结合冻融精子在转基因小鼠中的应用

<ol><li>Tada, N., Sato, M., Yamanoi, J., Mizorogi, T., Kasai, K., Ogawa, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryopreservation+of+mouse+spermatozoa+in+the+presence+of+raffinose+and+glycerol%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Reprod.+Fertil%22%5BJournal%5D)">Cryopreservation of mouse spermatozoa in the presence of raffinose and glycerol.</a> J. Reprod. Fertil. 89, 511-516 (1990).</li>
<li>Yokoyama, M., Akiba, H., Katsuki, M., Nomura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+normal+young+following+transfer+of+mouse+embryos+obtained+by+in+vitro+fertilization+using+cryopreserved+spermatozoa%5BTitle%5D)+AND+%22Jikken+Dobutsu%22%5BJournal%5D)">Production of normal young following transfer of mouse embryos obtained by in vitro fertilization using cryopreserved spermatozoa.</a> Jikken Dobutsu. 39, 125-128 (1990).</li>
<li>Sztein, J. M., Farley, J. S., Young, A. F., Mobraaten, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Motility+of+cryopreserved+mouse+spermatozoa+affected+by+temperature+of+collection+and+rate+of+thawing%5BTitle%5D)+AND+%22Cryobiology%22%5BJournal%5D)">Motility of cryopreserved mouse spermatozoa affected by temperature of collection and rate of thawing.</a> Cryobiology. 35, 46-52 (1997).</li>
<li>Thornton, C. E., Brown, S. D., Glenister, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large+numbers+of+mice+established+by+in+vitro+fertilization+with+cryopreserved+spermatozoa%3A+implications+and+applications+for+genetic+resource+banks%2C+mutagenesis+screens%2C+and+mouse+backcrosses%5BTitle%5D)+AND+%22Mamm.+Genome%22%5BJournal%5D)">Large numbers of mice established by in vitro fertilization with cryopreserved spermatozoa: implications and applications for genetic resource banks, mutagenesis screens, and mouse backcrosses.</a> Mamm. Genome. 10, 987-992 (1999).</li>
<li>Sztein, J. M., Farley, J. S., Mobraaten, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+fertilization+with+cryopreserved+inbred+mouse+sperm%5BTitle%5D)+AND+%22Biol.+Reprod%22%5BJournal%5D)">In vitro fertilization with cryopreserved inbred mouse sperm.</a> Biol. Reprod. 63, 1774-1780 (2000).</li>
<li>Liu, L., Nutter, L. M., Law, N., McKerlie, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sperm+freezing+and+in+vitro+fertilization+in+three+substrains+of+C57BL%2F6+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Assoc.+Lab.+Anim.+Sci%22%5BJournal%5D)">Sperm freezing and in vitro fertilization in three substrains of C57BL/6 mice.</a> J. Am. Assoc. Lab. Anim. Sci. 48, 39-43 (2009).</li>
<li>Nakagata, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryopreservation+of+mouse+spermatozoa+and+in+vitro+fertilization%5BTitle%5D)+AND+%22Methods.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Cryopreservation of mouse spermatozoa and in vitro fertilization.</a> Methods. Mol. Biol. 693, 57-73 (2011).</li>
<li>Mazur, P., Koshimoto, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Is+intracellular+ice+formation+the+cause+of+death+of+mouse+sperm+frozen+at+high+cooling+rates%5BTitle%5D)+AND+%22Biol.+Reprod%22%5BJournal%5D)">Is intracellular ice formation the cause of death of mouse sperm frozen at high cooling rates.</a> Biol. Reprod. 66, 1485-1490 (2002).</li>
<li>Jin, B., Yamasaki, C., Yamada, N., Seki, S., Valdez, D. M., Kasai, M., Edashige, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mechanism+by+which+mouse+spermatozoa+are+injured+during+freezing%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Reprod.+Dev%22%5BJournal%5D)">The mechanism by which mouse spermatozoa are injured during freezing.</a> J. Reprod. Dev. 54, 265-269 (2008).</li>
<li>Visconti, P. E., Westbrook, V. A., Chertihin, O., Demarco, I., Sleight, S., Diekman, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+signaling+pathways+involved+in+sperm+acquisition+of+fertilizing+capacity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Reprod.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Novel signaling pathways involved in sperm acquisition of fertilizing capacity.</a> J. Reprod. Immunol. 53, 133-150 (2002).</li>
<li>Ostermeier, G. C., Wiles, M. V., Farley, J. S., Taft, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conserving%2C+distributing+and+managing+genetically+modified+mouse+lines+by+sperm+cryopreservation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Conserving, distributing and managing genetically modified mouse lines by sperm cryopreservation.</a> PLoS ONE. 3, e2792-e2792 (2008).</li>
</ol>

作者是该试剂盒制造商查尔斯河（Charles River）的员工。

自1990年以来，使用18%棉子糖和3%脱脂奶粉的基本精子冷冻方案已在多种小鼠品系中被证实可靠，大量小鼠品系已通过该方法实现冷冻保存1,2,3,4,5,6,7。精子细胞在冷冻和解冻过程中受损的主要原因与冰晶形成8,9以及活性氧物质10有关。在冷冻保护液中添加自由基清除剂（如氨基酸）和还原剂（如单硫甘油），已被研究并证实可显著提高近交系小鼠（包括C57BL/6）冻融精子的体外受精率11,6。
在本方案中，我们通过优化基础冷冻保护剂（CPA），添加市售抗氧化剂和冰晶抑制剂，并改进精子冷冻及体外受精（IVF）操作流程，开发出一种新的小鼠精子冷冻保存I•Cryo试剂盒。使用I•Cryo试剂盒冷冻五种近交系小鼠精子后，精子活力保护率（&gt;60%）和快速前向运动精子比例（&gt;45%）均得到良好维持。与基础CPA相比，5种近交系小鼠冻融精子的2细胞期胚胎发育率显著提高11,6。
使用该试剂盒时，用户可通过将每个品系的2只雄性小鼠的精子冷冻，制备高浓度的精子悬液。仅需冷冻15根麦管，操作过程快速、简便，且占用更少的储存空间，适用于短期或长期保存。大多数情况下，仅需解冻1至2根麦管即可恢复小鼠品系。

<table><tbody><tr><td>CPA</td><td>查尔斯河实验室</td><td></td><td>随试剂盒提供</td></tr><tr><td>STM</td><td>查尔斯河实验室</td><td></td><td>随试剂盒提供</td></tr><tr><td>IVF 培养液</td><td>查尔斯河实验室</td><td></td><td>随试剂盒提供</td></tr><tr><td>0.25 ml 塑料细管</td><td>查尔斯河实验室</td><td></td><td>随试剂盒提供</td></tr><tr><td>精子冷冻罐</td><td>查尔斯河实验室</td><td></td><td>随试剂盒提供</td></tr><tr><td>手杖与高脚杯</td><td>查尔斯河实验室</td><td></td><td>随试剂盒提供</td></tr><tr><td>矿物油</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M5310</td><td>应进行胚胎检测</td></tr><tr><td>KSOM培养基</td><td>EMD Millipore</td><td>MR-106-D</td><td></td></tr><tr><td>35 mm 培养皿</td><td>Falcon BD</td><td>351008</td><td></td></tr><tr><td>热封机</td><td>ABTEC</td><td>TISH-200</td><td></td></tr><tr><td>4孔多孔培养皿</td><td>Nalge Nunc International</td><td>73521-424</td><td></td></tr><tr><td>移液器</td><td>Gilson, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>移液器吸头</td><td>各种</td><td></td><td></td></tr><tr><td>37&amp;#x00B0;C + 5% CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 培养箱</td><td>各种</td><td></td><td></td></tr><tr><td>淋巴结&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 储存系统</td><td>各种</td><td></td><td></td></tr><tr><td>37&amp;#x00B0;C 水浴</td><td>VWR 国际</td><td>89032-196</td><td></td></tr><tr><td>体视显微镜</td><td>尼康仪器公司</td><td>SMZ800</td><td></td></tr><tr><td>hCG</td><td>Intervet Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PMSG</td><td>EMD Millipore</td><td>367222</td><td></td></tr><tr><td>1 ml 注射器配 26G 3/8 针头</td><td>BD 生物科学</td><td>BD309625</td><td></td></tr><tr><td>显微解剖剪</td><td>Roboz外科器械公司</td><td>RS-5602</td><td></td></tr><tr><td>30号针头 &amp;frac12; 针</td><td>BD 生物科学</td><td>305106</td><td></td></tr><tr><td>剪刀</td><td>Roboz外科器械公司</td><td>RS-6802</td><td></td></tr><tr><td>镊子</td><td>Roboz外科器械公司</td><td>RS-5135, RS-5110, RS-5005</td><td></td></tr></tbody></table>

小鼠精子冷冻保存与复苏——使用 i·cryo 试剂盒

Mouse Sperm Cryopreservation and Recovery using the I&middot;Cryo Kit

自转基因和基因敲除技术问世以来，已培育出数千种新的转基因小鼠品系。这些珍贵的动物目前大多仅以活体形式存在，一旦发生紧急情况便没有备份方案。胚胎冷冻保存可提供此类备份，但成本较高，操作过程耗时较长，且通常需要大量动物才能成功。自从发现小鼠精子可在仅含18%棉子糖和3%脱脂奶粉的基础冷冻保护剂中成功冷冻保存以来，精子冷冻保存已成为存档、分发和恢复这些珍贵品系的一种可接受且经济有效的方法。
 本文展示了一种新开发的小鼠精子冷冻保存I•Cryo试剂盒。使用该试剂盒对五种常用近交系小鼠的精子进行冷冻并随后复苏。与对照组（基础CPA）相比，使用该试剂盒冷冻的五种近交系小鼠精子，其活力保护率（&gt; 60%）和快速前向运动活力保护率（&gt; 45%）均更高。利用复苏后的精子进行体外受精（IVF），在所检测的全部五种小鼠品系中，受精后发育至二细胞期胚胎的效率均得到一致提升。在超过1.5年的时间内，共利用I•Cryo试剂盒冷冻保存了49个转基因小鼠品系，并通过体外受精成功复苏。

本文展示了新开发的 I•Cryo 小鼠精子冷冻保存试剂盒。使用该试剂盒，在5种小鼠品系中，冻融精子获得的二细胞期胚胎发育率 consistently 得到提高。在1.5年期间，利用 I•Cryo 试剂盒通过精子冷冻保存技术保存了49个基因修饰小鼠品系，并在后续通过体外受精成功恢复了这些品系。

小鼠精子冷冻保存与复苏——使用 I·Cryo 试剂盒

自转基因技术和基因敲除技术问世以来，已创建了数千种新的转基因小鼠品系。其中许多……

本实验的总体目标是冷冻保存小鼠精子。首先使用冷冻保存吸管从小鼠附睾尾部收集精子，然后将吸管置于液氮中冷冻并长期储存，待需要时通过在温水中解冻来恢复精子活性。回收的小鼠精子最终用于体外受精。该试剂盒相较于现有方法的主要优势在于，其包含了冷冻保存和回收小鼠精子所需的所有必要材料。通常，初次使用该方法的研究人员可能在操作和装填麦管时遇到困难。首先，为每株需要冷冻保存的小鼠准备15根精子冷冻保存麦管。首先，将每支0.25毫升的细管与一支1毫升注射器连接，棉塞端靠近注射器。其次，向每支细管中加入8厘米长的体外受精（IVF）培养基，随后加入1厘米长的空气段。第三，对需要冷冻保存的每一品系，用其品系名称标记15支细管。在四孔板的一个孔中加入 240 微升冷冻保护剂。将一个 1 毫升移液器连接到冷冻罐的手柄上以延长手柄。最后，用 kit 提供的泡沫绝缘盒装入 15 厘米深的液氮，并盖上盖子以实施安乐死。两只具有生育能力的成年雄性小鼠。对每只小鼠进行手术，取出其附睾附体。将小鼠置于背侧卧位，切开腹壁。轻轻牵拉附睾管，去除多余的脂肪组织。接着，找到附睾，并连同少量附睾管完整切除。将附睾置于已加入冷冻保护剂的四孔培养皿中的一个孔内，在解剖显微镜下操作。在每侧附睾上做五到七条纵向切口。然后用镊子轻轻挤压每条切口，以挤出精子。将冷冻保护剂与附睾混合物在室温下孵育三到五分钟，以促进精子释放。孵育期间用手轻轻晃动培养皿两到三次。这将使精子通过抽吸游出。每个制备好的细管中加入五毫米的精子悬液，随后加入一厘米的空气。冷冻过程中，确保所有细管装载量一致非常重要。装载完全部15根细管后，仔细热封每根细管的两端。为保证精子存活率，需在10分钟内完成全部15根细管的操作过程。所有吸管准备好后，将其装入冷冻罐的精子柱中。首先，将冷冻罐放入泡沫盒中，使其在液氮中保持垂直漂浮状态。冷冻罐必须垂直漂浮10分钟，否则会影响精子的冷冻速率。然后将罐体浸入液氮中。精子由此实现冷冻保存，可长期存放在液氮中。在计划取精前约60小时。在进行体外受精（IVF）前，请按照书面方案对雌性动物进行超数排卵处理。每解冻一支冻存管，需提前至少一小时将所有培养基在37摄氏度、5%二氧化碳条件下预热平衡。所需材料包括一个35毫米的培养皿，内含一滴90微升的精子处理液，并以矿物油覆盖。准备一个含有3毫升IVF培养基的35毫米培养皿作为切割皿；每五只超排卵的雌性小鼠，准备一个IVF培养皿，即在四孔板的一个孔中加入500微升IVF培养基。为每个IVF培养皿准备一个洗涤皿，即含有3毫升KSOM培养基的35毫米培养皿，以及一个胚胎培养皿，即含有覆盖于油下的50微升KSOM培养基液滴的35毫米培养皿。在准备好所有所需材料后，迅速从储存液中取出一根麦管，放入37°C水浴中解冻2至3分钟。将吸管晾干。然后在棉塞下方的气柱处，在空气中做一斜切。在吸管的另一端，在另一气柱上方再做一次斜切。避免切断精子柱。现在使用200微升移液器从吸管末端吸取精子悬液，并将其滴加至精子处理液的中央。然后将培养皿孵育45至60分钟。精子孵育期间，分离超排卵雌性小鼠的输卵管壶腹部，并将其转移至切割皿中。使用30号针头或镊子撕开每根输卵管，释放出卵丘细胞复合体。将来自五只雌性小鼠的卵丘细胞复合体转移至每一份体外受精液（IVF）中。使用最少量的培养基进行操作。避免转移脂肪和血液，因为污染的培养基会抑制受精效率。孵育后，从STM液滴边缘收集10至15微升精子悬液，并将该悬液转移至一个IVF液滴中。现在将细胞共培养4至6小时以进行受精。受精后，在洗涤皿中用至少2K SOM溶液洗涤胚胎至少两次。然后进行培养。将胚胎置于KSOM培养液中，直至达到所需的发育阶段。来自五个Charles River近交系小鼠品系的精子被冷冻保存。这五个品系精子的活力保护率和快速前向运动活力保护率分别为81%至47%。在过去一年半中，不同品系小鼠使用冻融精子进行体外受精（IVF）的成功率介于26%至88%之间。通过精子冷冻保存技术，共存档了49个转基因小鼠品系，并随后利用体外受精技术在四种不同的雌性小鼠品系中成功恢复。这些品系包括C57BL/6、DBA/1和129/SV。一旦掌握该技术，若操作得当，精子冷冻保存过程可在30分钟内完成。进行此操作时，重要的是要将气流垂直导入罐中，并使用液氮。

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科研

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生物学

精子冷冻保存和恢复使用I ·冷冻包

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一种高通量的斑马鱼精子冷冻保存方法 体外 受精

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改良型MicroSecure玻璃化冷冻：一种安全、简便且高效的人类囊胚冷冻保存方法

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斑马鱼精原细胞的全睾丸针浸式超快速冷冻保存

近年来，欧洲鳗鲡的成熟诱导及精子冷冻保存方案已得到改进。本文介绍了目前最佳的实验方案，即使用人绒毛膜促性腺激素（hCG）诱导成熟，并以甲醇作为冷冻保护剂。...

欧洲鳗鲡（Anguilla anguilla）雄性个体的处理与激素诱导成熟及精子冷冻保存方法

本文介绍了一种改良的一细胞胚胎冷冻保存方法，以及一种将冻融胚胎与电穿孔技术相结合的方案，用于高效制备基因修饰小鼠。...

利用冻融胚胎高效制备基因修饰小鼠

本方案描述了一种半自动化的途径，旨在提高对濒危珊瑚物种精子进行处理和冷冻保存的效率与能力，以保护遗传多样性并支持珊瑚礁修复工作。...

一种支持珊瑚精子生物保存与水产养殖的半自动化冷冻保存工作流程

学习使用I·Cryo试剂盒对小鼠精子进行冷冻保存与复苏，通过液氮冷冻和体外受精技术实现基因修饰小鼠品系的长期保存与高效恢复，为生殖生物学研究提供可靠方法。

小鼠精子冷冻保存与复苏——使用 I·Cryo 试剂盒

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