精子冷冻保存和恢复使用I ·冷冻包
December 12th, 2011
在这里，我们展示了新开发的我•小鼠精子冷冻保存冷冻套件。使用本试剂盒在5个小鼠品系，两个解冻的精子细胞阶段胚胎发育的持续改善。超过1.5年期间，49转基因小鼠精子冷冻保存归档与我•低温套件，后来通过试管婴儿成功收回。
该程序的总体目标是冷冻保存小鼠精子。这是通过首先使用冷冻保存吸管从小鼠 EPI 中收集精子来实现的。然后将吸管在液氮中冷冻并储存起来，直到在温水中解冻回收。
回收的小鼠精子最终用于体外受精。与现有方法相比，该试剂盒的主要优点是该试剂盒包含冷冻保存和回收小鼠精子所需的所有必要材料通常，在刚接触这种方法的个体中，可能会用处理和加载吸管勒死。首先，每行要冷冻保存的小鼠组装 15 个精子冷冻保存吸管。
首先，将每根 0.25 毫升吸管连接到 1 毫升注射器上，棉塞最靠近注射器。第二次将 8 厘米的 IVF 培养基装入每根吸管中，然后是 1 厘米的空气。第三，在 15 根吸管中的每根吸管上标记要保存的行的名称，以便为要冷冻保存的行添加。
用 240 μL 冷冻保护剂填充四孔培养皿的孔中。将 1 毫升移液器连接到冷冻罐的手柄上，以延长手柄。最后，在套件随附的泡沫绝缘盒中填充 15 厘米的液氮，然后盖上盖子安乐死。
两只可育成年雄性小鼠。对于要冷冻保存和手术的每条线，去除它们的 codal EPI。将鼠标置于背侧并打开腹侧体壁。
轻轻拉动巨大的尊重并去除任何多余的脂肪。接下来，找到附睾并用一小块快速尊重将其完整地去除。在解剖镜下，将 EPI 放入准备好的装有 CPA 的四孔培养皿的孔中。
在每个附睾上做五到七次纵向切割。然后用镊子轻轻挤压每个快速差异。要推出精子，请将 CPA 和附睾混合物在室温下孵育 3 到 5 分钟。
在孵育过程中，用手轻轻搅拌培养皿两到三次。这将使精子通过抽吸游出。在每根准备好的吸管中加入 5 毫米的精子悬浮液，然后加入 1 厘米的空气。
对于冷冻过程来说，所有吸管的负载相等是很重要的。装入所有 15 根吸管后，小心地热封每根吸管的两端。为确保精子存活，请在 10 分钟内完成所有 15 根吸管的流程。
准备好所有吸管后，将它们装入冷冻罐精子柱中。首先，将罐放入泡沫盒中，让它垂直漂浮在液氮中。10 分钟内，罐子必须垂直漂浮，否则会影响精子冻结速度。
然后将罐浸入液氮中。因此，精子被冷冻保存并准备好长期储存液氮。在计划的精子恢复前大约 60 小时。
按照书面协议在 IVF 前对女性进行超级排卵。对于每根要解冻的吸管，准备并在 37 摄氏度和 5% 二氧化碳下平衡所有介质至少一小时。这些材料包括一个 35 毫米的培养皿，其中有一滴 90 微升的精子处理培养基，上面覆盖着油。
一个 35 毫米的培养皿，其中含有 3 毫升 IVF 培养基作为切割皿，每 5 名超排卵女性准备一个 IVF 培养皿，该培养皿是装有 500 微升 IVF 培养基的四孔培养皿中的一孔。对于每个 IVF 培养皿，准备一个洗涤皿，这是一个 35 毫米的培养皿，里面有 3 毫升的 KSOM 和一个胚胎培养皿，这是一个 35 毫米的培养皿，里面有 50 微升的 KSOM 培养基，上面覆盖着油。准备好所有必需的材料后，迅速从仓库中取出吸管，并将其放入 37 摄氏度的水浴中两到三分钟。
擦干吸管。然后在棉塞下方的气柱上做一个斜切。在吸管的另一端，在另一个气柱上再做一个倾斜的切口。
避免切割精子柱。现在使用 200 微升移液管从吸管末端吸出精子悬液，并将其沉积在精子处理培养基的中心。落。然后将培养皿孵育 45 到 60 分钟。
在精子孵化过程中，分离超级排卵雌性的 ucs 并将它们转移到切割皿中。使用 30 号针头或镊子撕裂每个输卵管，释放卵丘细胞复合物。将 C C 从五名女性转移到每个 IVF 中。
嗯，用最少的媒体。避免转移脂肪和血液，因为肮脏的培养基会抑制受精效率。孵育后，从 STM 滴剂的外围收集 10 至 15 微升精子悬液，并将悬液放入一个 IVF 中。
现在将细胞共培养 4 到 6 小时以进行受精。受精后，将胚胎在洗涤皿中通过至少 2K SOM 洗涤。然后是文化。
胚胎在 KSOM 中，直到达到所需的发育阶段。冷冻来自 5 个 Charles River 近交小鼠品系的精子。来自这些精子的 5 个菌株的精子活力和快速进行运动的保护率在 81% 到 47% 之间。
在一年半的时间里，冷冻解冻精子的 IVF 率在不同菌株中从 26% 到 88% 不等。通过精子冷冻保存共存档了 49 个 GM 小鼠品系，然后通过 IVF 在 4 个不同的雌性品系中恢复。C 57 黑色 6 BC DBA 1 和 1 29 SV 一旦掌握了精子冷冻保存技术，如果作得当，可以在 30 分钟内完成。
对于此程序，垂直流向罐和液氮很重要。
概述
本研究介绍了用于有效冷冻保存小鼠精子的I•Cryo套件，并展示了在多个小鼠品系中改善的胚胎发育。该套件通过精子冷冻保存和随后通过体外受精（IVF）恢复，促进了转基因小鼠品系的归档。
关键研究组成部分
科学领域
- 生殖生物学
- 冷冻保存技术
- 体外受精（IVF）
背景
- 小鼠精子冷冻保存对于遗传学研究至关重要。
- 现有方法可能缺乏效率和易用性。
- I•Cryo套件旨在简化冷冻保存过程。
- 成功恢复精子对于IVF结果至关重要。
研究目的
- 评估I•Cryo套件在冷冻保存小鼠精子方面的有效性。
- 评估冷冻精子对胚胎发育的影响。
- 为未来研究归档转基因小鼠品系。
使用的方法
- 使用冷冻保存稻草收集小鼠附睾精子。
- 在液氮中冷冻精子以进行长期存储。
- 解冻精子以用于IVF程序。
- 评估不同品系中精子活力和IVF成功率。
主要结果
- 使用I•Cryo套件在5个小鼠品系中观察到胚胎发育的改善。
- 成功归档并恢复了49个转基因小鼠品系。
- 不同品系中精子活力率在81%至47%之间。
- 使用冷冻解冻精子的IVF率在26%至88%之间变化。
结论
- I•Cryo套件显著提高了精子冷冻保存的效率。
- 成功恢复转基因品系支持其在研究中的实用性。
- 进一步优化该方法可减少处理时间。
常见问题
Executive Industry Relevance
Mouse sperm cryopreservation provides a cost-effective and scalable solution for archiving genetically modified strains, reducing reliance on live animal colonies and mitigating risks of line loss. The I•Cryo kit enhances predictive confidence in strain preservation by improving post-thaw sperm motility and IVF-derived embryo development across multiple inbred backgrounds. This supports strategic portfolio management in preclinical research by enabling reliable long-term storage and on-demand recovery of valuable disease models.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables functional validation of genetic models by ensuring recoverability of sperm for IVF-based phenotypic screening.
- Operational Value: Reduces animal husbandry burden and costs associated with maintaining live colonies of low-throughput or inducible models.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Provides a standardized sperm source for consistent IVF assays, supporting reproducible compound effect evaluation in fertilization and early embryonic development.
- Operational Value: Facilitates assay readiness through cryobanked sperm, eliminating variability from male-to-male or batch-to-batch differences in fresh sample collection.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Maintains genetic integrity of disease models over time, enabling longitudinal studies and cross-generational experimental continuity.
- Operational Value: Supports multi-site collaboration by allowing distribution of cryopreserved sperm instead of live animals, reducing transport complexity and biosafety concerns.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery workflow from early model generation through preclinical validation, serving as a bridge between genetic engineering and functional phenotyping via IVF.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by enabling recovery of cryopreserved sperm for IVF, allowing assessment of genetic modifications on fertility and early embryogenesis.
- Screening: Enables standardized IVF-based assays using thawed sperm, improving reproducibility in evaluating sperm function, capacitation, and fertilization competence.
- Analytics: Generates quantitative readouts such as sperm motility (% progressive), rapid progressive motility, and embryo development rates, which inform go/no-go decisions on model stability.
- Translational Research: Connects genetic modification to developmental outcomes by enabling IVF with cryopreserved sperm, supporting biomarker-linked phenotypic screening in preimplantation embryos.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable cryobanking platform for ongoing archiving and recovery of GM lines, reducing redundant rederivation efforts across projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in model preservation by demonstrating improved motility and embryo development over basic CPA methods.
- Operational Value: Standardizes cryopreservation workflow through kit-based components, reducing user variability and training time.
- Strategic Value: Lowers long-term costs of strain maintenance and reduces risk of irreversible line loss due to breeding failure, genetic drift, or pathogen outbreak.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of GM lines for archiving based on strategic value, with confidence in future recoverability.
Implementation Considerations
- Requires technical proficiency in sperm collection, straw handling, and heat sealing to ensure sample integrity.
- Depends on access to liquid nitrogen storage and controlled thawing equipment (37°C water bath) for consistent post-thaw performance.
- Necessitates standardized IVF media and superovulation protocols for reliable fertilization and embryo culture outcomes.
- Performance may vary across genetic backgrounds, necessitating strain-specific optimization of incubation and washing steps.
- Limited by the need for fertile females and IVF expertise for sperm recovery, restricting direct application to natural mating-based assays.
