Name: 为含量测定一氧化氮生物活性分析技术 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-06-18T12:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 28 s
Description: 学习一氧化氮代谢物检测方法，通过即时处理血液样本和快速组织采集，利用主动脉环评估内皮功能，结合生化分析定量硝酸盐、亚硝酸盐及亚硝基硫醇水平，为研究NO在健康和疾病中的作用提供可靠技术。

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作者感谢洪江博士以及Deepa Parathasarthy（MPH，BDS）提供的技术支持。

1. 全血采集
<ol>
	<li>使用含有 NEM/EDTA 的试管采集人类或实验动物的静脉血。</li>
	<li>立即在台式离心机中以 14,300 rcf（相对离心力）离心 7 分钟，以制备血浆和红细胞沉淀。</li>
	<li>制备血浆样本用于高效液相色谱（HPLC）和化学发光检测（CLD）分析。 
	HPLC：向血浆中加入等体积的冷甲醇，涡旋混匀后在 13,200 rpm 下离心 10 分钟，以沉淀血浆蛋白。收集上清液用于 HPLC 分析。 
	CLD：分装样本，并与磺胺嘧啶和氯化汞预孵育，以特异性测定亚硝基硫醇。</li>
	<li>制备红细胞沉淀用于 HPLC 和 CLD 分析。 
	HPLC：将红细胞沉淀按 1:4 比例加入含有 10 mM NEM、2.5 mM EDTA 和 10 mM 铁氰化物的低渗裂解液中，充分涡旋混匀，然后加入等体积甲醇，再次涡旋并在 13,200 rpm 下离心 10 分钟以沉淀蛋白。收集上清液用于 HPLC 分析。 
	CLD：将红细胞沉淀按 1:4 比例加入含有 10 mM EDTA、2.5 mM EDTA 和 10 mM 铁氰化物的低渗裂解液中。将样本分装至含有磺胺嘧啶和氯化汞的试管中，用于亚硝基硫醇的特异性检测。</li>
</ol>
2. 组织提取与制备
<ol>
	<li>为测定组织中一氧化氮代谢物的含量，首先需按照上述方法采集无血液组织以进行样品制备。通过左心室 apex 灌注生理缓冲液，进行完全的血液置换。待血液完全清除后，即可采集目标组织。</li>
	<li>将组织样品匀浆，并按照上述方法制备用于高效液相色谱（HPLC）和化学发光检测（CLD）分析的样品。</li>
</ol>
3. 血管环分离以评估内皮功能
组织浴槽
<ol>
	<li>将使用乙醚麻醉小鼠，直至其对脚趾夹捏无反应，并在手术前进行颈椎脱位。进行胸廓切开术以暴露胸主动脉和腹主动脉。将25号注射器插入左心室心尖处，并用充氧的Krebs-Henseleit缓冲液灌流以清除血液。</li>
	<li>剪开右心房以提供血液流出通道。取出腹主动脉并清除外膜。</li>
	<li>将血管切成2 mm长的环状片段，并安装在四通道组织浴槽（DMT 720MO, AD Instruments）中，浴槽内盛有生理缓冲液。</li>
	<li>血管环置于10 ml器官浴槽中，用充氧Krebs缓冲液（95% O2 和 5% CO2）在37 °C下维持。每个主动脉环施加1克的预张力（根据先前实验确定为最佳血管运动功能的起始张力）。使用八通道八极桥（Powerlab）和数据采集软件（Chart version 5.2.2）记录所有张力测量值。</li>
	<li>血管环在器官浴槽中平衡80分钟，每20分钟更换一次缓冲液。平衡80分钟后，向每个血管环中加入1 μM去氧肾上腺素以诱导次最大收缩。</li>
	<li>在稳定后，加入内皮激动剂（如乙酰胆碱）以测定一氧化氮（NO）的生成及血管舒张程度。在完成乙酰胆碱的剂量反应曲线后，冲洗浴槽，重新诱导收缩，随后加入外源性一氧化氮供体硝普钠，以评估平滑肌反应性并获得100%舒张的参考值。</li>
	<li>可在浴槽中加入一氧化氮清除剂，以明确展示NO的释放及其对血管舒张的抑制作用。</li>
</ol>
4. 代表性结果
使用专用的 ENO-20 高效液相色谱仪（HPLC）可提供一种易于操作、高通量的方法，用于在生物基质中特异性且灵敏地检测亚硝酸盐和硝酸盐。检测原理及原始色谱图如图1所示。该方法适用于任何生物样本中的亚硝酸盐和硝酸盐测定。基于化学发光检测器（CLD）的 NO 代谢物检测需要化学衍生化步骤，以确定 NO 的分子来源。用于化学发光检测器的同步氧化脱亚硝基和还原脱亚硝基实验装置如图2所示。右侧反应容器中装有含 800 mM 铁氰化物的 PBS 缓冲液（pH 7.4），左侧反应容器中装有乙酸中的碘化钾/碘混合液，用于还原脱亚硝基过程（图2A）。整个装置如图2B所示。图3展示了可特异性检测并定量亚硝酸盐、亚硝基硫醇、亚硝胺以及亚硝基血红素产物的分组脱亚硝基分析方法。该方法此前已有描述并经过验证4,5。这些重要的生物化学分析可轻松与离体主动脉环的功能研究相结合，以评估实验动物中内皮源性 NO 的生成。这种经典的药理学实验能够简便而准确地评估内皮 NO 的功能与生成。通过测定血管对乙酰胆碱等内皮激动剂的反应性，可直接评估内皮 NO 的生成，并进一步与在实验动物血液和组织中检测到的生物化学标志物进行关联分析。典型的乙酰胆碱剂量-反应曲线如图4所示。具有正常内皮功能的健康对照小鼠对乙酰胆碱产生舒张反应；而内皮功能障碍小鼠（高胆固醇血症小鼠）由于 NO 生成减少，对相同刺激的舒张反应减弱。
<img alt="气相色谱示意图，显示重氮化反应装置及色谱结果。" src="/files/ftp_upload/3722/3722fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 1"> 
图 1. 使用 ENO-20 检测亚硝酸盐和硝酸盐的原理及样品色谱图。（上图）ENO-20 检测亚硝酸盐和硝酸盐的方法示意图。（下图）向 ENO-20 注入 10 pmol 亚硝酸盐和硝酸盐的标准色谱图（100 μl 含 100 nM 亚硝酸盐和硝酸盐的溶液）。每种阴离子的检测灵敏度为 1 nM，进样体积为 100 μl。蛋白质或有色物质无干扰。
<img alt="色谱系统设置；数据分析；蛋白质纯化；实验设备；示意图。" src="/files/ftp_upload/3722/3722fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 2"> 
图 2. 采用铁氰化物氧化脱亚硝基化与碘化物/碘化物还原脱亚硝基化反应的CLD实验装置，通过气相检测吹扫出的NO气体。
<img alt="显示一氧化氮水平的还原性和氧化性脱硝基化图表，包含RSNO和亚硝酸盐分析。" src="/files/ftp_upload/3722/3722fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图3"> 
图3. （A部分）通过样品预孵育特异性化学试剂后，采用化学发光法检测亚硝酸盐、RSNO和RNNO的还原性脱硝基化实验结果。通过峰面积相减法可实现亚硝酸盐和RSNO的分别检测。（B部分）利用铁氰化物氧化性脱硝基化溶液进行亚硝酰血红素物质的化学发光检测。该方法特异性识别NO-血红素产物，与RSNO（如GSNO或SNO-白蛋白）或RNNO（如亚硝基吡咯烷和N-亚硝基白蛋白）无交叉反应。
<img alt="Acetylcholine dose-response graph; healthy vs. endothelial dysfunction mice; % relaxation comparison." src="/files/ftp_upload/3722/3722fig4.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 4"> 
图4. 离体 离体主动脉环的器官浴实验可直接测定内皮来源的一氧化氮（NO）生成水平，并可与高效液相色谱法（HPLC）和化学发光检测法（CLD）检测到的生物化学生物标志物进行相关性分析。该图显示由于NO生成减少，内皮功能障碍小鼠的舒张反应减弱。

<ol><li>Kelm, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nitric+oxide+metabolism+and+breakdown%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Nitric oxide metabolism and breakdown.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1411, 273-289 (1999).</li>
<li>Furchgott, R. F., Zawadzki, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+obligatory+role+of+endothelial+cells+in+the+relaxation+of+arterial+smooth+muscle+by+acetycholine%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The obligatory role of endothelial cells in the relaxation of arterial smooth muscle by acetycholine.</a> Nature. 288, 373-376 (1980).</li>
<li>Ignarro, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelium-derived+relaxing+factor+produced+and+released+from+artery+and+vein+is+nitric+oxide%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Endothelium-derived relaxing factor produced and released from artery and vein is nitric oxide.</a> Proc. Natl. Acad Sci. U.S.A. 84, 9265-9269 (1987).</li>
<li>Feelisch, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concomitant+S-%2C+N-%2C+and+heme-nitrosylation+in+biological+tissues+and+fluids%3A+implications+for+the+fate+of+NO+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Concomitant S-, N-, and heme-nitrosylation in biological tissues and fluids: implications for the fate of NO in vivo.</a> FASEB J. 16, 1775-1785 (2002).</li>
<li>Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+nitric+oxide+levels+in+the+red+cell%3A+validation+of+tri-iodide-based+chemiluminescence+with+acid-sulfanilamide+pretreatment%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Measurement of nitric oxide levels in the red cell: validation of tri-iodide-based chemiluminescence with acid-sulfanilamide pretreatment.</a> J. Biol. Chem. 281, 26994-27002 (2006).</li>
<li>Angelo, M., Singel, D. J., Stamler, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+S-nitrosothiol+%28SNO%29+synthase+function+of+hemoglobin+that+utilizes+nitrite+as+a+substrate%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">An S-nitrosothiol (SNO) synthase function of hemoglobin that utilizes nitrite as a substrate.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 8366-8371 (2006).</li>
<li>Bryan, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bound+NO+in+human+red+blood+cells%3A+fact+or+artifact%5BTitle%5D)+AND+%22Nitric+Oxide%22%5BJournal%5D)">Bound NO in human red blood cells: fact or artifact.</a> Nitric Oxide. 10, 221-228 (2004).</li>
<li>Feelisch, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+Processing+of+Nitrite+in+Hypoxia%3A+An+Intricate+Interplay+of+Nitric+Oxide-Generating+and+-Scavenging+Systems%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Tissue Processing of Nitrite in Hypoxia: An Intricate Interplay of Nitric Oxide-Generating and -Scavenging Systems.</a> J. Biol. Chem. 283, 33927-33934 (2008).</li>
<li>Bryan, N. S., Grisham, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+to+detect+nitric+oxide+and+its+metabolites+in+biological+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radic.+Biol.+Med%22%5BJournal%5D)">Methods to detect nitric oxide and its metabolites in biological samples.</a> Free Radic. Biol. Med. 43, 645-657 (2007).</li>
<li>Lundberg, J. O., Weitzberg, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NO+generation+from+inorganic+nitrate+and+nitrite%3A+Role+in+physiology%2C+nutrition+and+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.+Pharm.+Res%22%5BJournal%5D)">NO generation from inorganic nitrate and nitrite: Role in physiology, nutrition and therapeutics.</a> Arch. Pharm. Res. 32, 1119-1126 (2009).</li>
<li>Lundberg, J. O., Weitzberg, E., Gladwin, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+nitrate-nitrite-nitric+oxide+pathway+in+physiology+and+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Drug.+Discov%22%5BJournal%5D)">The nitrate-nitrite-nitric oxide pathway in physiology and therapeutics.</a> Nat. Rev. Drug. Discov. 7, 156-157 (2008).</li>
</ol>

未声明任何利益冲突。

本文所述用于定量多种生物区室中相关一氧化氮（NO）代谢物的方法，将有助于描绘健康与疾病状态下NO生物学的特征图谱，并可与血管内皮功能检测中NO的功能性测量结果相关联。这些方法仅需简单的样品前处理，且具备实现高通量分析的潜力。这些分子的相对含量有助于理解在多种疾病实验模型中，甚至在人类患者连续采集的样本中，NO的生成及其代谢去向。基于NO的生物标志物检测存在诸多陷阱，许多分析方法在样品制备过程中会人为产生部分代谢产物。由于亚硝酸盐可与半胱氨酸巯基发生反应6，并可能人为形成亚硝基硫醇7，因此在生物样品中准确测定亚硝酸盐含量至关重要。基于化学发光检测法（CLD）在厌氧条件下特异性检测亚硝酸盐时，因不同生物区室中存在特异性亚硝酸盐还原酶活性，可能导致结果不一致8。本文所描述的所有方法均有充分文献记录并经过验证，且已考虑采取措施以消除或减少人为干扰9。我们将阐述防止产生人为干扰的关键步骤。对NO代谢物进行多区室筛查，将有助于识别在人类疾病中具有诊断或预后价值的潜在生物标志物，进而推动建立可用于临床或标准实验室分析的标准化检测方法。近年来人们认识到人体内存在氮循...

<table><tbody><tr><td>N-乙基马来酰亚胺</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>23030</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7889</td><td></td></tr><tr><td>铁氰化钾</td><td>Fluka</td><td>60299</td><td></td></tr><tr><td>高效液相色谱仪</td><td>Eicom Corp</td><td>ENO-20</td><td></td></tr><tr><td>自动进样器</td><td>Alcott</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMT 肌张力测定仪</td><td>ADInstruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PowerLab 数据采集系统</td><td>ADInstruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>化学发光检测仪</td><td>EcoPhysics</td><td>CLD 88Y</td><td></td></tr><tr><td>离心机</td><td>Eppendorf</td><td>5415D</td><td></td></tr><tr><td>乙酰胆碱</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6625</td><td></td></tr><tr><td>R-(-) 去氧肾上腺素</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6126</td><td></td></tr></tbody></table>

用于评估一氧化氮生物活性的分析技术

Analytical Techniques for Assaying Nitric Oxide Bioactivity

一氧化氮（NO）是一种双原子自由基，在生物系统中极不稳定，半衰期极短（在循环血液中不足1秒）。1一氧化氮（NO）可被视为人体内产生的最重要信号分子之一，其调控着包括血压调节、免疫反应和神经通讯在内的多种基本生理功能。因此，在生物样本中对NO进行准确检测和定量，对于理解NO在健康与疾病状态中的作用至关重要。由于NO生理半衰期极短，研究人员已开发出多种针对NO生物化学反应产物的间接检测策略。对多种生物区室中相关NO代谢物的定量分析，可提供有关NO生物学功能的宝贵信息 体内 一氧化氮的生成、生物利用度及代谢。仅采集血液或血浆等单一隔室样本，往往无法准确评估机体整体的一氧化氮状态，尤其是在组织中的情况。在实验动物中实现血液与特定组织间的一氧化氮比较，将有助于弥合基础科学与临床医学在健康与疾病状态下NO生物标志物诊断和预后应用方面的差距。因此，将血浆或血液中的一氧化氮状态外推至特定目标组织已不再是一种有效的方法。为此，研究人员持续开发并验证新的方法，以实现对实验动物多个隔室中一氧化氮及其相关产物/代谢物的检测与定量。 体内一氧化氮（NO）生物化学的经典范式，从一氧化氮合酶生成NO，到可溶性鸟苷酸环化酶（sGC）的激活，最终氧化为亚硝酸盐（NO₂⁻）2-）和硝酸盐（NO3-可能仅代表一氧化氮（NO）部分作用 体内一氧化氮（NO）及其代谢产物与蛋白质硫醇、仲胺和金属相互作用，分别形成S-亚硝基硫醇（RSNOs）、N-亚硝胺（RNNOs）和亚硝酰基血红素，这些代表了NO的非cGMP依赖性效应，其在生理上的重要性可能与NO激活可溶性鸟苷酸环化酶（sGC）相当。对NO在生理学中作用的真正理解来源于 体内 同时采集多个区室样本的实验。一氧化氮（NO）研究方法是一门复杂且常令人困惑的科学，也是关于NO生物化学诸多争论和讨论的焦点。阐明涉及NO的新机制和信号通路，依赖于我们能够在复杂的生物基质中特异性、选择性和高灵敏度地检测并定量NO及其所有相关产物和代谢物的能力。本文介绍一种利用高效液相色谱法（HPLC）快速、灵敏分析亚硝酸盐和硝酸盐的方法，以及检测生物样品中游离NO的方法 体外 基于臭氧化学发光法，结合化学衍生化以确定一氧化氮的分子来源以及 离体 使用器官浴肌动描记法。

一氧化氮（NO）的内源性生成调控着多种生物学功能。越来越多的研究表明，基于NO的信号传导发生中断或失调与许多人类疾病相关。定量检测相关NO代谢物的方法可能为人类疾病提供新的诊断或预后生物标志物。

一氧化氮（NO）是一种双原子自由基，在生物系统中极不稳定，寿命极短（在循环血液中不足1秒）1。NO可能...

以下实验的总体目标是演示如何在生物样本中准确且特异性地检测一氧化氮代谢物。首先在采集血液样本后立即进行样本处理，以防止代谢物丢失或产生人为假象。同时，快速高效地进行组织采集，以最大限度减少缺氧环境对一氧化氮代谢物的影响。收集主动脉环并悬挂于器官浴槽中，以评估其内皮功能。此外，采用生化检测方法定量组织中的硝酸盐水平、亚硝酸盐水平以及硝基硫醇和其他硝化产物的相对含量。通过这些检测方法，对实验组与对照组动物进行恰当比较，可获得有关一氧化氮生成与代谢的有价值信息。与单一方法或检测相比，采用这种多系统方法的主要优势在于能够更全面地揭示一氧化氮在多个器官系统中的生物化学特性。这有助于我们理解这些代谢物中哪些可能具有预后或诊断价值，以及一氧化氮代谢物谱如何反映血管内皮中一氧化氮的生成与可利用性。由于该方法的每一步操作对维持样本完整性都至关重要，因此对该方法进行可视化演示尤为关键。由于样本采集和组织提取的细节非常精细，这些步骤仅通过阅读典型期刊的方法部分往往难以察觉。本实验操作将由我的实验室高级研究员洪 Jing 博士进行演示。本方案需要准备一个人体或实验动物样本，用于血液采集，且该实验动物的组织也将被检测。首先，使用25号针头插入下腔静脉采集全血。采集500至1000微升血液后，通过左心室尖端灌注生理缓冲液，将动物体内残留的血液完全灌注清除，使血液与缓冲液从下腔静脉流出，实现全血置换。静脉血采集后应立即收集至含有NEM和EDTA的1.5毫升离心管中。离心后，在14,300 RCF条件下离心7分钟。用移液器吸除红细胞沉淀上方的血浆，并将其转移至另一管中。取50微升血浆样品，加入等体积的冷甲醇，以此对分离的血浆样品进行HPLC前处理。涡旋混合物3到5秒，直至溶液变浑浊。然后在14,300 RCF下离心7分钟。为沉淀血浆蛋白，将上清液收集至另一个1.5毫升离心管中，并在4摄氏度下保存，直至可进行分析。为进行化学发光分析，取剩余的血浆体积（约为 200 至 400 微升），将其均分为两份。取其中一半血浆，加入相当于其体积 10% 的 5% 酸化硫化物，混匀后静置 10 分钟。此样本现已准备好用于 CLD 分析。五分钟后，通过加入10%体积的2%氯化汞来处理另一份血浆样品。在室温下，加入10%体积的酸化磺胺试剂。再等待10分钟，然后像处理血浆一样将此样品注入化学发光检测器（CLD）中。可将红细胞沉淀物制备用于HPLC或CLD分析。首先将一份细胞沉淀与四份低渗裂解液混合。如需进行CLD分析，需充分涡旋混匀该混合物。细胞的处理方法与血浆样本相同。首先加入等体积的甲醇，然后剧烈涡旋混合3至5秒，随后在14,300 RCF条件下离心7分钟。现在用移液器吸除上清液，并将其在4°C下保存，待用高效液相色谱法（HPLC）分析以测定组织中一氧化氮代谢物的水平。对于实验动物中感兴趣组织的样本，应首先按照前一节所述方法采集并制备血液；组织的采集应按常规操作进行，但需特别注意速度和效率，以避免组织发生缺氧。采集完成后，用含EDTA的PBS以1:5的比例对组织样本进行匀浆处理。然后按照前文所述红细胞（RBCs）的方法，制备匀浆组织用于HPLC和CLD分析。用乙醚麻醉成年小鼠，并确认其对脚趾夹捏无反应后，进行开胸手术。从胸骨沿中线向下至耻骨区域做一切口，以暴露胸腔和腹腔。接下来，用充氧的Krebs Alite缓冲液灌注动物。使用25号注射器将缓冲液注入左心室心尖。剪开右心房以提供血液流出通道。灌注完成后，剪除并移除可能覆盖腹主动脉的肝脏、肺脏及其他组织，以分离腹主动脉。接着，用镊子夹住心脏，轻柔地将主动脉从动物体后壁上剪下。将心脏和主动脉置于盛有冰块的培养皿中。将冷克雷布斯缓冲液加入培养皿中。仔细剪除并清除主动脉周围的脂肪和外膜。清洁时避免损伤血管内壁的内皮。每5分钟将主动脉转移至新鲜的冰冷含氧缓冲液中，以保持其代谢缓慢，防止缺氧。现在使用手术刀将主动脉切成3毫米长的环状节段。将这些节段转移至含有含氧克雷布斯缓冲液的四通道10毫升组织器官浴槽中。使用换能器旋钮，对每条主动脉环施加1.5克的预张力。根据经验结果，1.5克是获得最佳血管运动功能的合适起始张力。在小鼠中，使用八通道八角桥和数据采集软件监测并记录力的测量值，使环状组织平衡80分钟，每20分钟更换一次缓冲液，然后进行实验。待组织张力达到平衡后，向每个环状组织中加入100纳米芬内林以诱导次最大收缩。当环状组织张力稳定并维持在恒定张力水平时，对内皮激动剂（如乙酰胆碱）进行剂量-反应分析。这将测定一氧化氮的生成量以及血管舒张程度。在完成乙酰胆碱的剂量-反应实验后，用 Krebs 缓冲液冲洗浴槽，并向每个器官浴槽中加入 100 纳摩尔的芬那林以收缩血管。随后，再次测定平滑肌环对一氧化氮外源性供体（如硝普钠）的反应性，分别在有或无 ODQ（可溶性鸟苷酸环化酶抑制剂）存在的情况下进行。这种研究方法可测定血管的100%舒张值，同时证明可溶性鸟苷酸环化酶在介导一氧化氮引起血管舒张反应中的关键作用。由于ODQ会抑制乙酰胆碱诱导的一氧化氮依赖性舒张反应，因此在健康对照组小鼠的主动脉环出现舒张的同时，内皮功能障碍小鼠的主动脉环则因一氧化氮生成减少而表现出舒张程度降低。此外，还对对照组动物进行了特异性亚硝酸盐还原酶检测，并通过化学发光法检测亚硝酸盐含量。使用还原性脱亚硝基化检测法检测RSNO和RNNO。通过减去峰面积，测定亚硝酸盐和r sno水平。该方法有助于回答一氧化氮与血管生物学领域中的关键问题，例如这些一氧化氮代谢物的循环水平如何反映组织水平，以及在不同疾病状态下疾病相关代谢物如何变化？在单个动物的多个器官系统及全身循环中，确定这些重要的一氧化氮代谢物的稳态浓度及其半衰期，将有助于识别疾病过程的特异性分子特征，并帮助我们定义基于一氧化氮的新型治疗手段，从而使临床医生能够掌握更佳的生物标志物，以评估疾病的严重程度或进展。通常，初涉一氧化氮领域的研究人员会面临困难，因为许多现有方法的灵敏度不足以检测和定量生物样本中这些极低水平的一氧化氮代谢物。首先，不熟练的操作很可能在样品处理过程中产生干扰物质，导致数据错误及对结果的误读。

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医学

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基于化学发光的检测方法用于检测一氧化氮及其自氧化和亚硝化化合物衍生物

本方案描述了一种通过三碘化物化学发光法测定顶端分泌物中的亚硝酸盐，从而量化气液界面（ALI）分化培养的气道上皮细胞中一氧化氮（NO）生成的方法。...

气液界面分化的小鼠气管上皮细胞培养物中一氧化氮生成的测定

我们介绍一种使用美国食品药品监督管理局（FDA）批准的超顺磁性氧化铁（SPIO）——菲柔莫醇（Feraheme）对干细胞进行标记和追踪的技术。该细胞成像技术利用磁共振（MR）成像进行可视化，可便捷地用于患者干细胞移植成功或失败的长期监测与诊断。...

使用美国食品药品监督管理局批准的氧化铁纳米颗粒 Ferumoxytol 标记干细胞

学习一氧化氮代谢物检测方法，通过即时处理血液样本和快速组织采集，利用主动脉环评估内皮功能，结合生化分析定量硝酸盐、亚硝酸盐及亚硝基硫醇水平，为研究NO在健康和疾病中的作用提供可靠技术。

用于评估一氧化氮生物活性的分析技术

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