为含量测定一氧化氮生物活性分析技术

以下实验的总体目标是展示如何准确、特异性地检测生物样品中的一氧化氮代谢物。这是通过在采集后立即首先处理血液样本来实现的，以防止代谢物损失或形成伪影。同时，进行快速有效的组织收获，以尽量减少低氧环境对一氧化氮代谢物的影响。

收集主动脉环并悬挂在器官浴中，以评估其内皮功能。此外，生化分析用于定量组织中硝酸盐水平、亚硝酸盐水平以及硝基硫醇和其他硝基饱和产物的相对水平。使用这些检测方法，对实验动物和对照动物进行适当的比较可以产生有关一氧化氮产生和代谢的宝贵信息。

与单一方法或分析相比，使用这种多系统方法的主要优点是，这将允许更广泛地了解多器官系统中的一氧化氮生物化学。因此，我们可以开始了解这些代谢物中的哪些可能具有预后或诊断效用，以及一氧化氮代谢物的库如何反映内皮一氧化氮的形成和可用性。该方法的目视演示至关重要，因为该过程中的每个步骤对于保持样品的完整性都至关重要。

由于样本采集和组织提取的精细细节，其中一些步骤在典型期刊的阅读方法部分并不明显。演示此程序的将是 Hong Jing 博士。我实验室的一位高级研究科学家 对于该协议，可以使用一个人或实验动物为实验动物采集血液，他们的组织也将接受检查。

首先，通过将 25 号针头插入下腔静脉来收集全血。一旦收集了 500 至 1000 微升，通过左心室根部注入生理缓冲液，使动物无残留血液，并允许血液和缓冲液通过下静脉 cva 排出时进行全血补充。采集后应立即将静脉血采集在含有 NEM 和 EDTA 的 1.5 毫升离心管中。

离心后，将血液以 14， 300 RCF 离心 7 分钟。用移液管从 RBC 沉淀中吸出血浆，并将其转移到单独的试管中。首先向 50 μL 血浆收集中加入 1：1 体积的冷甲醇，制备用于 HPLC 的分离血浆样品。

涡旋，使混合物剧烈旋转 3 到 5 秒，直到变得浑浊。然后将混合物在 14， 300 RCF 下离心 7 分钟。为了沉淀血浆蛋白，将 supernat 收集到单独的 1.5 ml 试管中，并将其储存在 4 摄氏度下，直到可以分析。

为了制备用于化学发光分析的血浆，取剩余的血浆体积（应约为 200 至 400 μL）并将其分成两个体积。加入 10% 体积的 5% 酸化硫化物，制备一半血浆，并等待 10 分钟。该样本现在已准备好进行 CLD 分析。

5 分钟后加入 10% 体积的 2% 氯化汞，制备另一半血浆。在室温下，加入 10% 体积的酸化磺胺。再等待 10 分钟，然后将该样品像血浆一样注入 CLD 中。

RBC 沉淀可用于 HPLC 和 CLD 的任一分析。首先将一份细胞沉淀与四份低渗裂解溶液混合。彻底涡旋混合物以进行 CLD 分析。

细胞的制备与血浆的制备相同。首先加入等体积的甲醇。然后剧烈涡旋混合物 3 到 5 秒，然后在 14， 300 RCF 下旋转 7 分钟。

现在吸出上清液并将其储存在 4 摄氏度，直到可以通过 HPLC 分析以确定一氧化氮代谢物的组织水平。在实验动物感兴趣的组织中，应首先如前所述收获和制备血液，组织的收获应照常进行，特别注意速度和效率，以免组织缺氧。收集后，以 1 比 5 的比例混合含有 PBS 的 N-E-M-E-D-T-A 的组织样品。

然后准备匀浆组织进行 HPLC 和 CLD 分析，如前面部分所述的 RBC。用达乙醚麻醉成年小鼠并确认它对脚趾捏没有反应后，进行开胸手术。从胸骨向下到耻骨区域做一个中线切口，以暴露胸腔和腹腔。

接下来，用含氧 Krebs Alite 缓冲液灌注动物。使用 25 号注射器将缓冲液注射到左心室心尖。右心房被切开，为血液提供出口。

灌注后，通过切开并去除肝脏、肺和其他可能覆盖主动脉的组织来隔离腹主动脉。接下来，用一对镊子握住心脏，轻柔地从动物后壁切开主动脉。将心脏和主动脉放入装满冰块的培养皿中。

培养皿中的冷 Krebs 缓冲液。小心切掉并清洁主动脉上的脂肪和外膜。清洁时避免损坏容器内的内皮。

保持主动脉代谢缓慢，以防止缺氧，每五分钟将其转移到新鲜的冰冷含氧缓冲液中。现在用手术刀将主动脉切成三毫米长的环形段。将片段转移到装有含氧 Krebs 缓冲液的四通道 10 毫升组织器官浴中。

使用换能器旋钮对每个主动脉环施加 1.5 克的预紧力。根据实证调查结果。1.5 克是最佳血管舒缩功能的适当起始张力。

在鼠标监视器中，使用八通道八进制电桥和数据采集软件记录力测量，让环平衡 80 分钟，每 20 分钟更换一次缓冲液，然后继续实验。组织张力平衡后，向每个环中加入 100 纳摩尔的茴香 rine 以进行次最大收缩。一旦环张力稳定并且张力水平稳定，就对内皮激动剂（如乙酰胆碱）进行剂量反应分析。

这将决定一氧化氮的产生和血管舒张的程度。在对乙酰胆碱产生剂量反应后，用 Krebs 缓冲液冲洗浴，并向每个器官浴中加入 100 纳摩尔的茴香碱以收缩血管。同样，然后确定平滑肌环对一氧化氮外源（例如硝基压迫钠侧）的反应性，有和没有 ODQ，一种可溶性 guile cyclase 的抑制剂。

这种类型的方法将确定血管的 100% 松弛值，并且还证明了可溶性 guile cyclase 在介导一氧化氮对血管松弛反应方面的基本性质。由于 ODQ 会阻止响应乙酰胆碱对硝基钠 IDE 的松弛，来自健康对照的主动脉环，小鼠松弛，而来自内皮功能障碍小鼠的主动脉环由于一氧化氮产生的减少而表现出松弛减少。还对对照动物进行了亚硝酸盐化学发光的组特异性 de nitro sation 测定。

使用还原性 de nitros 测定法检测 RSNO 和 RNNO。通过减去峰面积，测量亚硝酸盐和 r sno 水平。这种方法可以帮助回答一氧化氮和血管生物学领域的关键问题，例如这些一氧化氮代谢物的循环水平如何反映组织水平以及疾病代谢物在不同疾病条件下如何变化？

测定这些相关一氧化氮代谢物在多个器官系统和单个动物的整个循环中的稳态浓度和半衰期，将允许识别疾病过程的特定分子特征，并帮助我们定义新的基于一氧化氮的治疗方式，这将使临床医生能够获得更好的疾病严重程度或进展的生物标志物。一般来说，刚接触硝酸领域的个体会很挣扎，因为许多人对足够敏感的检测和量化生物样本中发现的这些低水平的三酸代谢。首先，一个非艺术技能可能会在样本处理过程中产生伪影，需要错误数据和对数据的误解。