Name: 使用内核生物测定真菌孢子发生和霉菌毒素生产的定量 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-04-23T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 1 s
Description: 了解利用内核生物测定法定量分析真菌孢子发生和霉菌毒素生产的方法。该技术结合孢子计数与高效液相色谱，可准确评估种子生理对真菌繁殖发育的影响，为标准化跨实验室研究提供可靠框架。

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感谢Brandon Hassett和Carlos Ortiz提供的技术协助。本研究得到了美国国家科学基金会（NSF）对Michael Kolomiets博士资助的项目（项目编号：IOB-0544428、IOS-0951272和IOS-0925561）以及美国农业部国家食品与农业研究所（NIFA）植物育种与教育资助项目（AFRI，项目编号：#2010-85117-20539）对Seth Murray博士、Thomas Isakeit博士和Michael Kolomiets博士的资助。

1. 玉米籽粒生物测定
<ol>
	<li>在实验前两周，将真菌病原体接种于马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）培养基上，在 28 °C 条件下培养。</li>
	<li>选择大小和形状相似的籽粒，最好为扁平状，以便其能平稳地平放在生物测定小瓶底部，并将其放入 50 ml 离心管中。所选籽粒应为在同一环境下同期生产的，以确保种子年龄和代谢物组成相近。</li>
	<li>在室温下振荡处理，对籽粒进行表面灭菌：先用 70% 乙醇处理 5 分钟，再用无菌水洗涤 1 分钟，接着用 6% 次氯酸钠处理 10 分钟。随后继续振荡，用无菌水冲洗三次，每次 5 分钟。将籽粒在经高压灭菌的毛巾上轻轻吸干。</li>
	<li>为促进黄曲霉（Aspergillus flavus）的侵染，使用 18 号针头在籽粒胚部一侧制造深度约为 0.5 cm 的微小伤口。然而，根据我们的经验，轮枝镰刀菌（Fusarium verticillioides）侵染需要更大的伤口，因此应使用剃须刀片在胚部一侧切出深度为 0.5 mm 的切口。</li>
	<li>通过在约 5 ml 经高压灭菌的 0.01% Tween-20 溶液中刮取培养平板上的菌落以释放孢子，并使用至少四层经高压灭菌的纱布进行重力过滤以去除菌丝体，从而制备接种孢子悬液。使用血细胞计数板测定孢子浓度，并将其调整至每毫升含 106 个孢子，适用于黄曲霉（A. flavus）或轮枝镰刀菌（F. verticillioides）。若使用其他病原菌或寄主物种，需评估适宜的接种浓度以实现有效侵染。</li>
	<li>在塑料容器（29.2 cm × 18.7 cm × 8.3 cm）内铺设五层纸巾并加入 100 ml 无菌水，以构建一个湿度培养箱。该培养箱无需密封防漏或密闭，实验过程中需定期补充水分以保持纸巾湿润。</li>
	<li>将四粒籽粒放入经高压灭菌的 20 ml 玻璃闪烁瓶中，并记录其质量。加入 200 μl 孢子悬液进行接种，盖紧瓶盖后涡旋振荡，使孢子悬液均匀覆盖籽粒表面。随后略微松开瓶盖以保证空气自由交换，并将小瓶置于湿度培养箱中。</li>
</ol>
注意：对于本方法中未描述的种子或真菌，所需的接种量可能不同，应通过实验确定。
<ol start="8">
	<li>将种子在28 °C、12小时光照/12小时黑暗的光周期条件下培养7天，或培养至达到所需状态为止。</li>
</ol>
2. 分生孢子计数
<ol>
	<li>感染期结束后，向含有感染籽粒的闪烁瓶中加入 5 ml 经高压灭菌的 0.01% Tween-20，充分涡旋振荡 1 分钟。</li>
	<li>使用宽口移液器吸头，立即用移液器分别将两份 200 μl 的孢子悬液转移至含有 1.8 ml 0.01% Tween-20 的 2.0 ml Eppendorf 管中，进行稀释（可根据感染程度按需调整稀释倍数）。</li>
	<li>使用血细胞计数板对每份 200 μl 的孢子悬液重复计数两次4，并比较不同处理间的分生孢子数量水平。</li>
</ol>
3. 黄曲霉毒素定量
<ol>
	<li>将1个样品的籽粒加入50 ml搅拌杯中，加入20 ml 80%甲醇和0.05 g NaCl，盖上盖子，高速搅拌1分钟。</li>
	<li>将一张褶皱滤纸置于干净的收集容器上，将提取液倒入滤纸中进行过滤。</li>
	<li>转移10 ml滤液至干净容器中，加入20 ml蒸馏H2O，并充分混匀。</li>
	<li>将样品通过1.5 μm玻璃微纤维滤膜过滤至干净的杯子中。</li>
	<li>取1 ml过滤后的提取液加入Afla Test柱中，使用压缩空气以每秒1-2滴的速度将提取液强制通过层析柱，直至完全排空。</li>
	<li>用1 ml蒸馏H2O洗涤层析柱两次，每次以每秒1-2滴的速度使液体通过柱体，直至空气通过。</li>
	<li>用1 ml HPLC级纯甲醇以每秒1-2滴的速度洗脱层析柱，洗脱液收集至玻璃比色皿中。</li>
	<li>向洗脱液中加入1 ml Afla Test显色剂，充分混匀。将比色皿放入已校准的荧光计中，于60秒时读数。</li>
</ol>
注意：使用 Aflatest FGIS 方案时，荧光计的测量值是基于最初用 100 ml 溶剂提取 50 克样品计算得出的。如果考虑用水稀释样品的情况，则上柱的 1 ml 溶液相当于 0.166 克样品。因此，在修改方案时，必须考虑样品量和初始提取液的差异。例如，将 2 克籽粒用 20 ml 80% 甲醇提取，相当于 0.1 克/毫升。当取 1 ml 该样品与 2 ml 水混合后，液体中样品的比例变为 0.033 克/毫升。如果该样品的荧光计读数为 100 ppb，则实际浓度应基于样品比例与 0.166 克之间的关系进行换算，即 ppb = (0.166 克 × 100 ppb) / 0.1 克，结果为 166 ppb。有关其他黄曲霉毒素定量方法，请参见参考文献 7。
4. 烟曲霉毒素B1（FB1）分析
<ol>
	<li>当真菌在玉米粒上培养时，在室温下用10 ml乙腈/水（50/50，v/v）不搅拌地过夜提取样品。随后，将提取液（2 ml）与去离子水（6 ml）混合，并直接将此混合液（8 ml）上样至C-18固相萃取柱。</li>
	<li>上样前，先用2 ml乙腈冲洗C-18固相萃取柱，再用2 ml水冲洗，以进行预处理。</li>
	<li>上样后，依次用2 ml水和2 ml乙腈/水（15/85，v/v）洗涤柱子。使用2 ml乙腈/水（70/30，v/v）洗脱用于HPLC分析的样品（含FB1）。</li>
	<li>将0.1 ml柱洗脱液转移至含有0.1 ml硼酸盐缓冲液（0.05 M硼酸/0.05 M硼砂[50/50，v/v]，pH 8.5）和0.1 ml邻苯二甲醛（OPA）（0.1 mg/ml溶于含0.5%巯基乙醇的乙腈中）的样品瓶中，对FB1进行OPA衍生化。</li>
	<li>加入0.5 ml乙腈/0.01 M硼酸（40/60，v/v）终止反应，反应时间为10分钟。</li>
	<li>使用配备分析型Zorbax ODS柱（4.6 × 150 mm）和可变波长Shimadzu RF-10Axl荧光检测器（激发波长335 nm，发射波长440 nm）的Shimadzu HPLC LC-20AT系统分析FB1。</li>
	<li>采用线性梯度洗脱（流动相A：乙腈/0.1 M磷酸钠（40/60），pH 3.3；流动相B：乙腈/0.1 M磷酸钠（60/40），pH 3.3），梯度程序如下：10分钟内从100% A线性升至100% B，保持100% B 5分钟。</li>
	<li>通过HPLC分析FB1标准品，利用峰面积绘制标准曲线。随后，通过将样品的峰面积与FB1标准曲线比较，定量样品中FB1的含量。</li>
</ol>
5. 麦角固醇分析
<ol>
	<li>将真菌在玉米粒上培养 7-14 天。</li>
	<li>培养结束后，向每个小瓶中加入 10 ml 氯仿:甲醇（2:1, v/v）。加入后充分振荡样品，然后将小瓶置于室温避光条件下孵育 24 小时。</li>
	<li>24 小时后，离心样品，收集上清液并通过 0.45 µm 尼龙膜过滤。</li>
	<li>将样品直接注入配备 4.6 U ODS-C18 柱（200 Å, 250 ± 4.6 mm）和 Shimadzu SPD-20A UV/VIS 检测器（设定检测波长为 282 nm）的 Shimadzu HPLC LC-20AT 系统中。</li>
	<li>以甲醇（100%）作为流动相，流速为 1.5 mL/min。通过将样品的峰面积与由 HPLC 级麦角固醇生成的标准曲线进行比较，确定样品中麦角固醇的含量。</li>
</ol>
6. 典型结果
接种后，在湿度培养箱中培养两到三天，真菌菌丝应开始在籽粒上出现。处理后七天，处理组植株上的营养生长应清晰可见，而对照组植株应无感染迹象（图1B，顶部）。更长时间的培养有利于更旺盛的营养生长（图1B，底部）。在本文所述条件下（图2G），A. flavus 野生型菌株NRRL 3357的定殖、黄曲霉毒素积累和分生孢子产生的最大值分别出现在第8、第6和第8天（图2，A-C）。然而，当以单位麦角固醇为基准比较真菌毒素污染水平和分生孢子形成时，其最高水平分别出现在第4天和第6天（图2，D-E）。图2F总结了这些依赖于真菌生物量的最大值观察结果。有趣的是，在接种后4至6天期间，籽粒发生核酸降解，这可通过时间进程样品中的总RNA变化观察到（图2H，底部）。
包括我们自身研究在内的多项研究已探讨了F. verticilliodies对玉米籽粒的侵染2,8,9,10,11,12，并成功将7至13天作为观察的时间点。采用本文所述方法，伏马菌素含量范围为3,500–8,000 ng/g籽粒4,13，麦角固醇含量范围为5,000–10,000 ng/g籽粒14,13。图3展示了高效液相色谱图中伏马菌素（上图）和麦角固醇（下图）的代表性峰。麦角固醇的测定也可通过吸光度光谱法进行15。
<img alt="籽粒感染实验流程图和显微图像；生物量和真菌毒素产量分析。" src="/files/ftp_upload/3727/3727fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 1"> 
图 1. 子囊菌生物量、产孢及真菌毒素产量的定量流程图，以及籽粒生物测定中营养生长的代表性结果。A) 描述用于定量评估玉米籽粒上真菌致病性的基本生物学参数的方法流程图。B) 籽粒生物测定的代表性结果。上方：在B73遗传背景下，A. flavus (NRRL3357) 在玉米籽粒上的营养生长情况。种子接种200 μl浓度为106 孢子/mL的孢子悬液，接种后7天拍摄照片。下方：B73遗传背景的玉米籽粒接种F. verticillioides后13天的感染情况。接种方式为每粒籽粒接种200 μl浓度为106 孢子/mL的孢子悬液。
<img alt="玉米-曲霉生物测定图示，显示真菌生长、黄曲霉毒素积累及侵染进程。" src="/files/ftp_upload/3727/3727fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 2"> 
图 2. 黄曲霉菌籽粒生物测定的时间进程。B73 玉米籽粒接种 200 μl 浓度为 106 个孢子/ml 的 Aspergillus flavus 分生孢子悬浮液，于 2–8 天内培养（G）。所有数值均基于 4 粒籽粒的干重平均值（n = 3–4；均值 ± 标准误）。A）定殖程度（以麦角固醇为指标）、（B）黄曲霉毒素含量和（C）产孢量通过上述方法进行定量。E）黄曲霉毒素和（F）产孢量以麦角固醇测定的真菌生物量为函数进行展示。F）麦角固醇、黄曲霉毒素积累量和产孢量的最大值相对于真菌生物量的变化——每种物质观测到的最大值设为 100%。（H）时间进程样品中每泳道 1 μg 总 RNA。
<img alt="显示伏马菌素B1和麦角甾醇检测峰的色谱图；包含数据分析。" src="/files/ftp_upload/3727/3727fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 3"> 
图3. 从感染了Fusarium verticillioides（M3125）的籽粒中分离得到的伏马菌素B1（上图）和麦角甾醇（下图）的代表性高效液相色谱（HPLC）色谱图。

<ol><li>Tsitsigiannis, D. I., Keller, N. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxylipins+as+developmental+and+host-fungal+communication+signals%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Oxylipins as developmental and host-fungal communication signals.</a> Trends Microbiol. 15, 109-118 (2007).</li>
<li>Gao, X., Shim, W. -B., Göbel, C., Kunze, S., Feussner, I., Meeley, R., Balint-Kurti, P., Kolomiets, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruption+of+a+maize+9-lipoxygenase+results+in+increased+resistance+to+fungal+pathogens+and+reduced+levels+of+contamination+with+mycotoxin+fumonisin%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Plant-Microbe+Interact%22%5BJournal%5D)">Disruption of a maize 9-lipoxygenase results in increased resistance to fungal pathogens and reduced levels of contamination with mycotoxin fumonisin.</a> Mol. Plant-Microbe Interact. 20, 922-933 (2007).</li>
<li>Brodhagen, M., Tsitsigiannis, D. I., Hornung, E., Goebel, C., Feussner, I., Keller, N. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reciprocal+oxylipin-mediated+cross-talk+in+the+Aspergillus+-+seed+pathosystem%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Reciprocal oxylipin-mediated cross-talk in the Aspergillus - seed pathosystem.</a> Mol. Microbiol. 67, 378-391 (2008).</li>
<li>Gao, X., Brodhagen, M., Isakeit, T., Brown, S. H., Göbel, C., Betran, J., Feussner, I., Keller, N. P., Kolomiets, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inactivation+of+the+lipoxygenase+ZmLOX3+increases+susceptibility+of+maize+to+Aspergillus+spp%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Plant-Microbe+Interact%22%5BJournal%5D)">Inactivation of the lipoxygenase ZmLOX3 increases susceptibility of maize to Aspergillus spp.</a> Mol. Plant-Microbe Interact. 22, 222-231 (2009).</li>
<li>Gao, X. Q., Kolomiets, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Host-derived+lipids+and+oxylipins+are+crucial+signals+in+modulating+mycotoxin+production+by+fungi%5BTitle%5D)+AND+%22Toxin+Rev%22%5BJournal%5D)">Host-derived lipids and oxylipins are crucial signals in modulating mycotoxin production by fungi.</a> Toxin Rev. 28, 79-88 (2009).</li>
<li>Mukherjee, M., Kim, J. -E., Park, Y. -S., Kolomiets, M. V., Shim, W. -B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulators+of+G+protein+signaling+in+F.+verticillioides+mediate+differential+host-pathogen+responses+on+non-viable+versus+viable+maize+kernels%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Plant+Pathol%22%5BJournal%5D)">Regulators of G protein signaling in F. verticillioides mediate differential host-pathogen responses on non-viable versus viable maize kernels.</a> Mol. Plant Pathol. 12, 479-491 (2011).</li>
<li>Zheng, M. Z., Richard, J. L., Binder, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+review+of+rapid+methods+for+the+analysis+of+mycotoxins%5BTitle%5D)+AND+%22Mycopathologia%22%5BJournal%5D)">A review of rapid methods for the analysis of mycotoxins.</a> Mycopathologia. 161, 261-273 (2006).</li>
<li>Bacon, C. W., Bennett, R. M., Hinton, D. M., Voss, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scanning+electron+microscopy+of+Fusarium+moniliforme+within+asymptomatic+maize+kernels+and+kernels+associated+with+equine+leukoencephalomalacia%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Dis%22%5BJournal%5D)">Scanning electron microscopy of Fusarium moniliforme within asymptomatic maize kernels and kernels associated with equine leukoencephalomalacia.</a> Plant Dis. 76, 144-148 (1992).</li>
<li>Munkvold, G. P., Hellmich, R. L., Rice, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+fumonisin+concentrations+in+kernels+of+transgenic+Bt+maize+hybrids+and+nontransgenic+hybrids%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Dis%22%5BJournal%5D)">Comparison of fumonisin concentrations in kernels of transgenic Bt maize hybrids and nontransgenic hybrids.</a> Plant Dis. 83, 130-138 (1999).</li>
<li>Sagaram, U. S., Shaw, B. D., Shim, W. -B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fusarium+verticillioides+GAP%21%2C+a+gene+encoding+a+putative+glycolipid-anchored+surface+protein%2C+participates+in+conidiation+and+cell+wall+structure+but+not+virulence%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol%22%5BJournal%5D)">Fusarium verticillioides GAP!, a gene encoding a putative glycolipid-anchored surface protein, participates in conidiation and cell wall structure but not virulence.</a> Microbiol. 153, 2850-2861 (2007).</li>
<li>Shim, W. -B., Flaherty, J. E., Woloshuk, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+Fumonisin+B1+biosynthesis+in+maize+germ+and+degermed+kernels+by+Fusarium+verticillioides%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Food+Protect%22%5BJournal%5D)">Comparison of Fumonisin B1 biosynthesis in maize germ and degermed kernels by Fusarium verticillioides.</a> J. Food Protect. 66, 2116-2122 (2003).</li>
<li>Shim, W. -B., Woloshuk, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+fumonisin+B1+biosynthesis+and+conidiation+in+Fusarium+verticillioides+by+a+cyclin-like+%28C-type%29+gene%2C+FCC1%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Micrbiol%22%5BJournal%5D)">Regulation of fumonisin B1 biosynthesis and conidiation in Fusarium verticillioides by a cyclin-like (C-type) gene, FCC1.</a> Appl. Environ. Micrbiol. 67, 1607-1612 (2001).</li>
<li>Conversation with: Won-Bo Shim. , (2011).</li>
<li>Shin, J. -H., Shim, W. -B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+PPR1+and+PPR2%2C+genes+encoding+regulatory+subunits+of+protein+phosphatase+2A+in+Fusarium+verticillioides%5BTitle%5D)+AND+%22Phytopathol%22%5BJournal%5D)">Characterization of PPR1 and PPR2, genes encoding regulatory subunits of protein phosphatase 2A in Fusarium verticillioides.</a> Phytopathol. 99, S119(2009).</li>
<li>Breivik, O. N., Owades, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spectrophotometric+Semimicrodetermination+of+Ergosterol+in+Yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Yeast.+Agric.+and+Food+Chem%22%5BJournal%5D)">Spectrophotometric Semimicrodetermination of Ergosterol in Yeast.</a> Yeast. Agric. and Food Chem. 5, 360-363 (1957).</li>
</ol>

我无任何利益冲突需要披露。

本文所述方法已得到广泛验证，能够稳定地获得可量化的真菌定植、产孢及真菌毒素生成结果。此外，这些方法也适用于其他易受产毒真菌污染的植物种子（如花生、小麦、棉花、开心果等）。为确保植物与病原菌互作分析的有效性，必须保持种子的活性。在籽粒胚部一侧制造微小伤口，有助于接种感染，同时维持种子的存活能力。
 有效进行的籽粒检测已被证明可与田间试验结果相一致。在之前的一项研究中4，籽粒生物测定显示，lox3-4突变体品系比野生型植株更易受到黄曲霉毒素污染。该结果与四项独立田间试验所观察到的结果完全一致4。这表明，籽粒生物测定可能是用于确定和/或预测大规模条件下植物-病原物互作结果的有效工具。

<table><tbody><tr><td>马铃薯葡萄糖琼脂</td><td>Fisher Scientific</td><td>S71659A</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP337-100</td><td></td></tr><tr><td>塑料培养容器</td><td>Sterilite</td><td>1713LAB06</td><td></td></tr><tr><td>搅拌器</td><td>Vicam</td><td>20200</td><td></td></tr><tr><td>24 cm 折叠滤纸</td><td>Vicam</td><td>31240</td><td></td></tr><tr><td>1.5 &amp;mu;m 玻璃微纤维</td><td>Vicam</td><td>31955</td><td></td></tr><tr><td>Afla Test 柱</td><td>Vicam</td><td>G1024</td><td></td></tr><tr><td>Afrla 测试开发人员</td><td>Vicam</td><td>32010</td><td></td></tr><tr><td>甲醇</td><td>Vicam</td><td>35016</td><td></td></tr><tr><td>乙腈</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC14952-0025</td><td></td></tr><tr><td>乙醇</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC39769-0025</td><td></td></tr><tr><td>C-18 固相萃取柱（Prep SEP SPE C18 柱）</td><td>Fisher Scientific</td><td>60108-304</td><td></td></tr><tr><td>邻苯二甲醛（OPA）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>79760-5g</td><td></td></tr><tr><td>硼酸</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP168-500</td><td></td></tr><tr><td>硼砂</td><td>Fisher Scientific</td><td>RDCS0330500</td><td></td></tr><tr><td>巯基&amp;#8211;乙醇</td><td>Fisher Scientific</td><td>45-000-231</td><td></td></tr><tr><td>岛津高效液相色谱 LC-20AT（泵）</td><td>岛津公司</td><td>LC-20AT</td><td></td></tr><tr><td>Zorbax ODS 色谱柱（4.6×150 mm）</td><td>安捷伦科技</td><td>443905-902</td><td></td></tr><tr><td>Shimatzu RF-10Axl 荧光检测器</td><td>岛津公司</td><td>RF-10AXL</td><td></td></tr><tr><td>磷酸钠</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC38987-0010</td><td></td></tr><tr><td>FB1 标准品</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F1147-1mg</td><td></td></tr><tr><td>氯仿</td><td>VWR 国际公司</td><td>MK444410</td><td></td></tr><tr><td>13 毫米针筒式滤器，配有 0.45 微米尼龙膜（HPLC）</td><td>Pall Corporation</td><td>4426</td><td></td></tr><tr><td>麦角固醇</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>45480-50G-F</td><td></td></tr><tr><td>闪烁瓶</td><td>VWR 国际公司</td><td>66021-602</td><td></td></tr><tr><td>氯化钠</td><td>Vicam</td><td>G1124</td><td></td></tr></tbody></table>

利用籽粒生物测定法量化真菌定殖、产孢及真菌毒素的产生

Quantification of Fungal Colonization, Sporogenesis, and Production of Mycotoxins Using Kernel Bioassays

由种子感染性真菌引起的谷物腐烂对全球谷类作物生产构成了最大的经济挑战之一，更不必说其对人类和动物健康造成的严重风险。在各类谷物生产中，玉米 arguably 是受影响最严重的作物，其籽粒完整性的病原体诱导损失以及种子的霉菌毒素污染尤为突出。对于玉米种植者以及食品和饲料加工业而言，最普遍且最具问题的两种霉菌毒素是黄曲霉毒素和伏马毒素，分别由Aspergillus flavus和Fusarium verticillioides产生。
近期关于植物-病原体分子互作的研究在揭示植物对真菌侵染及真菌毒素污染响应的特定机制方面展现出巨大潜力1,2,3,4,5,6。由于许多实验室正利用籽粒实验研究植物-病原体互作，因此亟需一种标准化的方法来量化不同的生物学参数，以便不同实验室的结果能够相互比较和解读。为了实现对种子进行稳健且可重复的定量分析，我们开发了实验室内的籽粒实验方法，以及后续用于量化真菌生长、生物量和真菌毒素污染程度的技术流程。实验中，将四粒灭菌的玉米籽粒接种于玻璃小瓶内，加入真菌悬浮液（106）并在预设条件下培养一定时间。随后选取样品小瓶，分别通过血细胞计数板对分生孢子进行计数，利用高效液相色谱法（HPLC）基于麦角固醇含量分析生物量，采用AflaTest荧光光度法测定黄曲霉毒素含量，并通过高效液相色谱法（HPLC）定量伏马菌素含量。

种子感染性真菌对谷类作物造成的破坏已促使大量研究致力于深入理解植物与病原体之间的相互作用。为了在实验室条件下研究种子与真菌的相互作用，我们开发了一种可靠的方法，通过籽粒生物测定来定量分析真菌繁殖、生物量及真菌毒素污染情况。

由种子感染性真菌引起的谷物腐烂对全球谷物生产构成了最大的经济挑战之一，更不用说其带来的严重风险……

本实验的总体目标是准确量化霉菌毒素的生物合成、腐败及真菌生长，以研究种子与真菌之间的分子互作关系。该目标通过以下步骤实现：首先建立籽粒生物测定体系，随后对真菌进行计数，最后定量分析霉菌毒素。最后，测定真菌生物量。最终，通过孢子计数技术结合高效液相色谱法对柯达生物量和次级代谢产物进行定量，可以获得反映种子生理学对产毒真菌的繁殖发育及次级代谢影响的结果。推广该技术的主要优势在于能够在多个实验室之间标准化实验方法，从而使不同实验室的结果具有可比性和交叉解读性。该方法有助于解答分子水平种子-微生物互作领域中的关键问题，例如致病性真菌如何劫持植物脂质代谢作为其致病策略。通常，初次接触该方法的研究人员可能会遇到困难，因为不同菌株的曲霉（angi）表现出不同的生长和发育模式。因此，在进行迷宫实验前两周，必须针对您所研究的真菌-种子互作体系优化实验条件。籽粒生物测定培养。将真菌病原体接种于马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）上，在28摄氏度下培养。当准备开始实验时，选取年龄、形状和大小相似的籽粒，放入50毫升离心管中。表面。用70%乙醇处理籽粒进行灭菌，在室温下振荡试管5分钟。接着，用无菌水振荡1分钟，再用6%次氯酸钠振荡10分钟。最后用无菌水冲洗3次，每次振荡5分钟。然后将籽粒在高压灭菌毛巾上吸干，以接种黄曲霉（Aspergillus flavus）。使用18号针头在每粒籽粒的胚侧制造一个深约0.5厘米的小伤口。若进行镰刀菌（Fusarium verticillioides）接种，则用剃刀片在籽粒上切出一个深约0.5毫米的切口。通过向培养皿中加入 5 毫升高压灭菌的 0.1% Tween 20 溶液制备接种物悬液，并使用细胞刮刀刮取孢子。通过重力沉降去除菌丝体，将溶液至少经四层高压灭菌的纱布过滤。使用血细胞计数板计算孢子浓度，并将其调整至每毫升 10⁶ 个孢子。对于这两种真菌物种，在塑料容器中制作一个保湿室，方法是铺入五张纸巾并加入100毫升无菌水。然后将四粒籽粒分别放入每个高压灭菌锅中。在安装小瓶中放入20毫升玻璃瓶。称重并记录其质量。向每个小瓶盖中加入200微升孢子悬浮液，并涡旋以使悬浮液均匀涂覆在籽粒表面。然后松开瓶盖以充分允许空气交换，并将小瓶放入湿度培养箱中。在28摄氏度、12小时光照/12小时黑暗的光周期条件下培养籽粒七天，或直至达到所需状态。感染期结束后，向含有感染籽粒的模拟小瓶中加入5毫米的经高压灭菌的0.01% Tween 20，涡旋振荡充分混匀一分钟。使用宽口VRE移液枪头，立即通过将两个独立的200微升等分试样转移至含有1.8毫升0.01% Tween 20的2毫升离心管中，对孢子悬液进行稀释。使用血细胞计数板对每份样品重复计数两次。为定量黄曲霉毒素，将单个样品的籽粒加入50毫升组织捣碎杯中，加入20毫升80%甲醇和0.05克氯化钠。盖紧后高速匀浆1分钟。将一张湿润的滤纸置于干净的收集容器上，倒入提取液进行过滤。取10毫升滤液转移至另一干净容器中，加入20毫升蒸馏水，充分混匀。将样品通过1.5微米的玻璃微纤维滤膜过滤至洁净的容器中。取1毫升滤过提取液加入ALE检测柱中，用压缩空气以每秒1至2滴的速度将滤过提取液压过层析柱。用1毫升蒸馏水洗涤层析柱两次，每次均以每秒1至2滴的速度使蒸馏水通过层析柱，直至空气穿出为止。以每秒一至二滴的速度，用1毫升HPLC级甲醇洗脱层析柱，洗脱液收集至玻璃Q Vet中。向EIT中加入1毫升显色剂并充分混匀。将Q Vet放入经校准的荧光计中，于60秒时读数。进行黄曲霉毒素B1或FB1分析时，向每个籽粒生物测定样品中加入10毫升乙腈-水（50:50）溶液，在室温下避光振荡提取过夜。将提取物与6 mL去离子水混合，然后上样至已用2 mL乙腈和2 mL水预处理的C18固相柱。上样后，依次用2 mL水和2 mL水中的乙腈洗涤柱子。最后用2 mL水中的乙腈洗脱含FB1的样品，用于HPLC分析。将1毫升柱EIT转移至含有0.1毫升硼酸盐缓冲液和0.1毫升醛的离心管中，对FB one进行衍生化，并孵育10分钟。加入0.5毫升乙腈和0.01摩尔硼酸溶液以终止反应。采用乙腈-0.1摩尔磷酸钠溶液的线性梯度，通过HPLC分析FB one。将样品与FB标准曲线进行比较，以分析类固醇培养物，即真菌在玉米上培养7至14天。孵育期结束后，向每个小瓶中加入10毫升氯仿-甲醇溶液。充分振荡样品，然后将小瓶置于室温避光条件下孵育24小时。将样品在 5,000 RPM 条件下离心 3 分钟。然后用 0.45 微米尼龙膜过滤上清液。将样品直接注入 HBLC 柱，并以 1.5 毫升/分钟的流速用 100% 甲醇洗脱。通过将峰面积与高效液相色谱级或goole生成的标准曲线进行比较，对样品进行定量。在接种后，于湿度培养箱中培养两到三天，菌丝生长应开始在籽粒上显现，如此处所示。接种后经处理的籽粒上，菌丝体的营养生长在七天后应清晰可见，而对照组应无感染；延长孵育时间有利于更旺盛的营养生长。该图显示，黄曲霉野生型 NR RL 3 3 5 7 在第4天、第6天和第8天时，分别表现出最高的定植率、黄曲霉毒素积累量和科迪烯醇（kedia）产量。然而，当比较单位菌丝体（per unit of rol）的真菌毒素污染和定植水平时，最高水平分别出现在第4天和第6天。此处展示的是采用本视频中所述方法通过高效液相色谱（HPLC）得到的伏马菌素（fumonisin）和玉米赤霉烯酮（rol）的代表性色谱图。伏马菌素含量范围为每克籽粒 3,500 至 8,000 纳克，rol 含量范围为每克籽粒 5,000 至 10,000 纳克。籽粒生物测定完成后，根据实验样品数量的不同，可在两至四天内完成对毒素、真菌毒素及真菌生物量的测定。在进行该实验操作时，重要的是需始终尽可能在无菌环境下进行。完成本实验后，还可采用其他方法，如植物化学分析、代谢组学、脂质组学、蛋白质组学、转录组学或其他相互作用组学技术，以回答更多科学问题，例如哪些基因、蛋白质和激素通路参与了这种重要的跨生物界相互作用。

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Immunology and Infection

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用于真菌性叶部玉米病原菌侵染活细胞成像的离体玉米叶鞘

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