Name: 解剖成年小鼠的椭圆囊和腺病毒介导的支撑细胞的感染 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-03-28T12:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 13 s
Description: 学习成年小鼠椭圆囊的解剖方法及腺病毒介导的支撑细胞感染技术。该实验流程可完整保留感觉上皮结构，为研究哺乳动物毛细胞再生与听力保护提供可靠的体外模型系统。

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作者感谢 Shimon P. Francis 博士提供了共聚焦显微图像。
本研究工作由国家聋哑与其他交流障碍研究所（NIDCD）院内研究部提供资助，额外支持来自 NIDCD 5R01 DC007613 项目。

1. 球囊解剖与培养
<ol>
 <li>使用批准的方案处死一只成年（4 周龄或以上）小鼠，并进行断头。</li>
 <li>剪开头部两侧的外耳道，将皮肤向前拉至鼻部。从后向前将头部沿中线切开，取出两侧脑组织，暴露骨迷路。</li>
 <li>去除耳蜗周围的颅骨组织，将骨迷路（包括鼓泡）转移至配备解剖显微镜的组织培养罩内（注意：腺病毒操作应在 II 级生物安全柜中进行）。</li>
 <li>在罩内，将每个耳蜗转移至含有无菌解剖液（M199，Gibco/Invitrogen #12350）的 35 mm 组织培养皿中（图 1A）。</li>
 <li>如果听泡仍完整（可在粗解剖过程中用拇指指甲插入听泡与耳蜗顶回之间将其分离），使用两把镊子（一把 #3 镊，一把 #5 镊）敲碎听泡（图 1B）。</li>
 <li>辨认骨性耳蜗标本的解剖标志：顶回、基底回、听小骨、前庭窗和蜗窗、第 VIII 脑神经根、半规管（图 1 C, D）。</li>
 <li>将内耳置于培养皿中，使内侧朝上，前庭窗、蜗窗及顶回位于皿底，第 VIII 脑神经根朝上。用 #3 镊夹住半规管区域以固定标本（图 1D）。</li>
 <li>使用装有 #11 刀片的手术刀，在神经根稍偏耳蜗顶回一侧处切下耳蜗顶回（图 1D）。</li>
 <li>翻转标本，使切面朝上。以前庭半规管作为手柄以稳定标本（图 1E）。</li>
 <li>使用 #5 镊从蜗轴处开始向下剥离至基底回。当到达耳蜗钩部向下弯曲的位置时，使用细探针（折断的 #55 镊的一半）轻轻挑起骨螺旋板的最后一段骨性支架（图 1F），暴露球囊。球囊下方紧邻的是镫骨底板，这是一个重要的解剖标志。椭圆囊紧邻镫骨底板（图 1G），周围被骨组织包绕。用探针小心凿除部分骨组织，使约 1/3 的椭圆囊暴露。使用 #55 镊小心取出椭圆囊（图 1H）。此操作通常会在拉出椭圆囊时一并带走色素化的顶上皮。然而，若顶上皮仍完整附着于椭圆囊，则可用 #55 镊将其去除。</li>
 <li>用于腺病毒感染（或活体成像实验）的椭圆囊必须在解剖过程中（感染前）去除耳石。此时，使用装有解剖液并配有细针头（通常为 26–28 号）的鲁尔锁式注射器。用 #55 镊夹住椭圆囊边缘（图 1I）。将针尖靠近椭圆囊，针尖斜面朝下。用解剖液的液流冲去耳石（图 1J）。或者，也可使用睫毛工具（Ted Pella, Inc. #113）轻轻刷去耳石。不进行腺病毒感染的椭圆囊通常在 24 孔组织培养板中以游离状态培养，并保留耳石完整（如需去除耳石，可在固定后进行，操作更简便，见下文）。</li>
 <li>所有椭圆囊解剖完成后，将解剖液更换为无菌培养基：DMEM F12（Gibco #11320），添加 5% 胎牛血清和 50 U/ml 青霉素 G（Sigma）。</li>
 <li>椭圆囊在 37 °C 和 5% CO2 条件下培养。若培养时间超过 48 小时，应每隔一天更换一半培养基。培养可维持一周或更长时间。</li>
</ol>
2. 支持细胞的腺病毒感染

重要提示：使用腺病毒必须遵循生物安全二级（BSL2）操作规程并获得相应资质。请咨询您所在机构的生物安全负责人，以获取有关BSL2操作规程的指导和培训。
<ol>
 <li>在解剖液（无血清）中如上所述解剖球囊。如上所述去除耳石。</li>
 <li>准备感染时，将1个球囊（毛细胞面向上）转移至Nunc微型培养皿（Fisher #12-565-68）的每个孔中，每孔含15 μL 无血清 DMEM F12（此步骤至关重要，因为血清可能使病毒失活）。使用1.5 mm显微刮匙（Fine Science Tools #10082-15）进行转移操作更为方便。</li>
 <li>我们使用的Ad-GFP为5型腺病毒，其病毒E1和E3基因已被删除，外源基因（GFP）由人巨细胞病毒（CMV）启动子驱动。该病毒购自Vector BioLabs（美国宾夕法尼亚州费城，<a href="http://www.vectorbiolabs.com/">vectorbiolabs.com</a>）。病毒原液的滴度为1.0-4.0×1010 PFU/mL。向每孔含球囊的培养液中加入0.5–2 μL病毒原液（图1L）。实际使用量需根据病毒种类及原液滴度进行调整。我们通常使每个球囊感染1.0–4.0×107 PFU的病毒量。</li>
 <li>将球囊在含病毒的培养基中于37 °C、5% CO2条件下培养2小时。2小时后，将球囊转移回含有含血清培养基的24孔细胞培养板中。在37 °C、5% CO2条件下继续培养过夜。</li>
 <li>次日可直接用于活细胞成像实验，或进行固定以进行毛细胞免疫组织化学染色（见下文）。病毒外源基因的表达随时间逐渐增强，因此若感染后24小时外源基因表达水平较低，可考虑在含血清培养基中额外延长培养24小时。若观察到毛细胞出现毒性反应，应减少病毒使用量。</li>
</ol>
3. 前庭囊固定、耳石去除及免疫化学染色
<ol>
 <li> 培养期结束后，将椭圆囊在4%多聚甲醛中固定，可选择在室温下于摇床上孵育3小时，或在4 °C下过夜。在0.1 M（1X）Sorensen磷酸缓冲液（pH 7.4）中清洗椭圆囊（每次15分钟，共洗3次）。上述步骤均在24孔组织培养板中进行。</li>
 <li>耳石去除：注意：在进行腺病毒感染前必须去除耳石（见上述步骤1.11）。然而，不进行感染的椭圆囊可在保留耳石完整的情况下进行培养和固定。在此情况下，可在固定后使用此处描述的步骤去除耳石。 检查椭圆囊是否残留有色素化的顶上皮组织。使用两把#55镊子小心去除残留的顶上皮。为去除耳石，将Sorensen磷酸缓冲液替换为750–1000 μl Cal-Ex脱钙剂（Fisher #CS510-1D）。使Cal-Ex作用于椭圆囊1分40秒（不得超过2分钟）。随后用0.1 M Sorensen磷酸缓冲液替换Cal-Ex，并清洗（每次5分钟，共洗5次）。</li>
 <li>将椭圆囊在硼氢化钠溶液（Sigma #452882，1%溶于去离子水）中孵育10分钟。再用0.1 M Sorensen磷酸缓冲液清洗椭圆囊（每次5分钟，共洗5次）。</li>
 <li>将椭圆囊置于封闭液（PBS + 2%牛血清白蛋白 + 0.8%正常山羊血清 + 0.4% Triton X-100）中，在室温下于摇床上孵育3小时。</li>
 <li>加入一抗，在4 °C下孵育过夜。使用抗Myosin 7a抗体（Proteus Biosciences #25-6790 或发育研究杂交瘤库中的#MYO7A 138-1），按1:100比例溶于封闭液，可标记所有毛细胞。为分别标记中央区和非中央区毛细胞，我们采用双重标记法，联合使用单克隆抗钙调蛋白抗体（Sigma #C 3545；1:150）和多克隆抗钙结合蛋白抗体（Chemicon #AB1778，Temecula, CA, USA；1:200）。二抗（通常为Invitrogen, Carlsbad, CA, USA生产的Alexa Fluor标记二抗）按1:500比例溶于封闭液，在室温下于摇床上避光孵育4小时。</li>
 <li>使用Fluoromount-G封片剂（Southern Biotech, Birmingham, AL, USA）将椭圆囊封固于玻璃载片上。</li>
</ol>
4. 代表性结果
采用该方法培养的椭圆囊保留了完整的毛细胞和支持细胞（图2）。健康培养物中的毛细胞显示为圆形的细胞核轮廓，周围环绕着较薄的肌球蛋白7a阳性细胞质区域（图2，上图）。支持细胞（以抗Sox2抗体标记）比毛细胞更小且排列更为紧密（图2，下图）。腺病毒感染椭圆囊中25–50%的支持细胞，而毛细胞无感染（图2，Ad-GFP图组）。需要注意的是，每种腺病毒的最佳工作滴度必须通过实验确定，因为病毒滴度过高可能导致毛细胞死亡。此外，在解剖过程中造成的机械损伤区域会大量吸收病毒。这些机械损伤区域表现为一条连续的、绿色荧光蛋白（GFP）表达水平极高的细胞带，且缺乏毛细胞，易于识别。这与未受损培养物中支持细胞呈散在分布的GFP表达形成对比（图2）。
<img src="/files/ftp_upload/3734/3734fig1.jpg" alt="内耳毛细胞结构的解剖过程；显微镜下的解剖学研究，带标注的示意图。" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图1"> 
图1. 球囊的解剖。A： 听泡（AB）。B： 使用两把坚固的镊子将听泡敲开。C： 骨性耳蜗（RW = 蜗窗，S = 镫骨动脉，C = 耳蜗，ST = 镫骨）。D： 使用手术刀片（SB）在第八脑神经（8th N）顶端方向切断耳蜗顶部。ASC = 前半规管。E： 用一把#3镊子牢固夹住标本，其中一个镊齿插入前半规管（ASC），另一个置于最外层骨质上（箭头所示），用镊子去除膜迷路。F： 去除膜迷路后，骨螺旋板的基底回在钩区附近可见。将细探针插入该骨性突起下方，将其抬起并移除（箭头所示）。G： 去除球囊后，椭圆囊（U）紧邻镫骨底板（SF）可见。H： 使用#55镊子（箭头所示）取出椭圆囊（U）。SF = 镫骨底板。I： 椭圆囊的耳石（O）部分被去除，其下可见感觉上皮（SE）。J： 使用连接26号针头的注射器喷出培养液流，将耳石（O）从椭圆囊上冲洗去除。图像底部可见针头的阴影（S）。K： 耳石被完全去除后的椭圆囊，感觉上皮（SE）清晰可见。L： 腺病毒感染：每个椭圆囊（U）被放置于微型培养板的独立孔中。通过移液将病毒加入孔中以感染支持细胞（P = 移液管尖）。
<img src="/files/ftp_upload/3734/3734fig2.2.jpg" alt="毛细胞示意图及荧光显微镜图像，显示Ad-GFP、Myosin 7a和Sox2蛋白的表达。" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图2"> 
图2. 支持细胞的腺病毒感染。 球囊被携带绿色荧光蛋白表达基因的腺病毒（Ad-GFP）感染。图中显示了同一球囊区域的毛细胞层和支持细胞层的共聚焦图像。毛细胞用抗Myosin 7a抗体标记（品红色）。支持细胞用抗Sox2抗体标记（红色）。示意图展示了球囊感觉上皮的结构以及毛细胞（HC）和支持细胞（SC）的位置。上方（U）和下方（L）图板所示的共聚焦（光学）切片位置由示意图中的虚线标示。上图板：在毛细胞核水平获取的共聚焦图像中，Ad-GFP信号出现在毛细胞之间的区域，且不与毛细胞标志物Myosin 7a重叠。下图板：在支持细胞核水平的共聚焦切片中，Ad-GFP信号与支持细胞标志物Sox2共定位。Ad-GFP感染仅导致支持细胞中表达GFP，而无毛细胞被感染。
<img src="/files/ftp_upload/3734/3734fig3.jpg" alt="在对照和 Ad-GFP 条件下毛细胞和支持细胞数量的柱状图比较。" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 3"> 
图 3. 腺病毒感染不会导致毛细胞或支持细胞死亡。 利用浓度为 4×108 PFU/mL 的 Ad-GFP 感染椭圆囊。使用抗 Myosin 7a（毛细胞标志物）和 Sox2（支持细胞标志物）抗体对椭圆囊进行标记。毛细胞和支持细胞数量在对照组椭圆囊与 Ad-GFP 感染的椭圆囊之间无差异。

<ol><li>Cunningham, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+adult+mouse+utricle+as+an+in+vitro+preparation+for+studies+of+ototoxic-drug-induced+sensory+hair+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">The adult mouse utricle as an in vitro preparation for studies of ototoxic-drug-induced sensory hair cell death.</a> Brain Res. , (2006).</li>
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<li>Ou, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+FDA-approved+drugs+and+bioactives+that+protect+hair+cells+in+the+zebrafish+%28Danio+rerio%29+lateral+line+and+mouse+%28Mus+musculus%29+utricle%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Assoc.+Res.+Otolaryngol%22%5BJournal%5D)">Identification of FDA-approved drugs and bioactives that protect hair cells in the zebrafish (Danio rerio) lateral line and mouse (Mus musculus) utricle.</a> J. Assoc. Res. Otolaryngol. 10, 191-203 (2009).</li>
<li>Chiu, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+the+zebrafish+lateral+line+to+screen+for+ototoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Assoc.+Res.+Otolaryngol%22%5BJournal%5D)">Using the zebrafish lateral line to screen for ototoxicity.</a> J. Assoc. Res. Otolaryngol. 9, 178-190 (2008).</li>
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<li>Cunningham, L. L., Cheng, A. G., Rubel, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caspase+Activation+in+Hair+Cells+of+the+Mouse+Utricle+Exposed+to+Neomycin%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Caspase Activation in Hair Cells of the Mouse Utricle Exposed to Neomycin.</a> Journal of Neuroscience. 22, 8532-8540 (2002).</li>
<li>Matsui, J. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caspase+inhibitors+promote+vestibular+hair+cell+survival+and+function+after+aminoglycoside+treatment+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Caspase inhibitors promote vestibular hair cell survival and function after aminoglycoside treatment in vivo.</a> J. Neurosci. 23, 6111-6122 (2003).</li>
<li>Matsui, J. I., Ogilvie, J. M., Warchol, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+caspases+prevents+ototoxic+and+ongoing+hair+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Inhibition of caspases prevents ototoxic and ongoing hair cell death.</a> J. Neurosci. 22, 1218-1227 (2002).</li>
<li>Nakagawa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+technique+for+inducing+local+inner+ear+damage%5BTitle%5D)+AND+%22Hear+Res%22%5BJournal%5D)">A novel technique for inducing local inner ear damage.</a> Hear Res. 176, 1-2 (2003).</li>
<li>Forge, A., Li, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptotic+death+of+hair+cells+in+mammalian+vestibular+sensory+epithelia%5BTitle%5D)+AND+%22Hear+Res%22%5BJournal%5D)">Apoptotic death of hair cells in mammalian vestibular sensory epithelia.</a> Hear Res. 139, 1-2 (2000).</li>
<li>Liu, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caspase+inhibitors+prevent+cisplatin-induced+apoptosis+of+auditory+sensory+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroreport%22%5BJournal%5D)">Caspase inhibitors prevent cisplatin-induced apoptosis of auditory sensory cells.</a> Neuroreport. 9, 2609-2614 (1998).</li>
<li>Taleb, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hsp70+inhibits+aminoglycoside-induced+hearing+loss+and+cochlear+hair+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stress+Chaperones%22%5BJournal%5D)">Hsp70 inhibits aminoglycoside-induced hearing loss and cochlear hair cell death.</a> Cell Stress Chaperones. 14, 427-437 (2009).</li>
<li>Taleb, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hsp70+inhibits+aminoglycoside-induced+hair+cell+death+and+is+necessary+for+the+protective+effect+of+heat+shock%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Assoc.+Res.+Otolaryngol%22%5BJournal%5D)">Hsp70 inhibits aminoglycoside-induced hair cell death and is necessary for the protective effect of heat shock.</a> J. Assoc. Res. Otolaryngol. 9, 277-289 (2008).</li>
<li>Francis, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Celastrol+Inhibits+Aminoglycoside-Induced+Ototoxicity+via+Heat+Shock+Protein+32+%28HSP32%29%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+and+Disease%22%5BJournal%5D)">Celastrol Inhibits Aminoglycoside-Induced Ototoxicity via Heat Shock Protein 32 (HSP32).</a> Cell Death and Disease. , (2011).</li>
<li>Wang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caspase+inhibitors%2C+but+not+c-Jun+NH2-terminal+kinase+inhibitor+treatment%2C+prevent+cisplatin-induced+hearing+loss%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Caspase inhibitors, but not c-Jun NH2-terminal kinase inhibitor treatment, prevent cisplatin-induced hearing loss.</a> Cancer Res. 64, 9217-9224 (2004).</li>
<li>Bird, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Supporting+cells+eliminate+dying+sensory+hair+cells+to+maintain+epithelial+integrity+in+the+avian+inner+ear%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Supporting cells eliminate dying sensory hair cells to maintain epithelial integrity in the avian inner ear.</a> J. Neurosci. 30, 12545-12556 (2010).</li>
<li>Sato, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+fractalkine+receptor+CX3CR1+on+cochlear+macrophages+influences+survival+of+hair+cells+following+ototoxic+injury%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Assoc.+Res.+Otolaryngol%22%5BJournal%5D)">Expression of fractalkine receptor CX3CR1 on cochlear macrophages influences survival of hair cells following ototoxic injury.</a> J. Assoc. Res. Otolaryngol. 11, 223-234 (2010).</li>
</ol>

未声明任何利益冲突。

感觉毛细胞易受到多种应激因素导致的死亡，包括衰老、噪声创伤以及接触耳毒性药物，如氨基糖苷类抗生素和抗肿瘤药物顺铂。在哺乳动物中，毛细胞的死亡会导致永久性听力损失和/或平衡功能障碍。体外模型系统是研究毛细胞死亡的细胞与分子机制，以及探索预防或逆转毛细胞死亡策略的重要工具。与成年哺乳动物耳蜗毛细胞不同，椭圆囊毛细胞在体外培养中存活良好。椭圆囊毛细胞对与耳蜗毛细胞毒性相同的治疗药物具有敏感性，且耳毒性所致毛细胞死亡与存活的细胞机制在椭圆囊和耳蜗毛细胞之间相似12-18。此外，当在体内验证椭圆囊模型系统所获得的数据时，该制备方法已被证实可可靠预测成熟耳蜗中毛细胞的存活与死亡情况12, 18-21。小鼠椭圆囊制备模型还允许我们通过使用转基因和基因敲除动物的椭圆囊来研究特定蛋白质的作用。
在应激条件下介导感觉毛细胞存活与死亡的信号机制尚不明确。然而，越来越多的证据表明，内耳中的其他细胞类型可能在决定应激毛细胞最终存活或死亡的过程中发挥重要作用11, 22, 23。椭圆囊模型系统可用于在成熟的哺...

A correction was made to <a href="http://www.jove.com/video/3734">Dissection of Adult Mouse Utricle and Adenovirus-mediated Supporting-cell Infection</a>. There was an error with a figure, the authors middle names were omitted, and the acknowledgements were updated.

Erratum: Dissection of Adult Mouse Utricle and Adenovirus-mediated Supporting-cell Infection

<table><tbody><tr><td>Medium 199</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>12350</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>11320</td><td></td></tr><tr><td>精细镊子（#55）</td><td>Fine Science Tools</td><td>11255-20</td><td></td></tr><tr><td>精细镊子（#5）</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-30</td><td></td></tr><tr><td>镊子（#3）</td><td>Fine Science Tools</td><td>11231-30</td><td></td></tr><tr><td>青霉素G</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3032</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Invitrogen</td><td>10082-139</td><td></td></tr><tr><td>Nunc 小型托盘</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-565-68</td><td></td></tr><tr><td>腺病毒-GFP</td><td>Vector Biolabs</td><td>1060*</td><td></td></tr><tr><td>Cal-Ex 脱钙剂</td><td>Fisher Scientific</td><td>CS510-1D</td><td></td></tr><tr><td>硼氢化钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>452882</td><td></td></tr><tr><td>抗肌球蛋白7a（多克隆抗体）</td><td>Proteus Biosciences</td><td>25-6790</td><td></td></tr><tr><td>抗肌球蛋白7a（单克隆抗体）</td><td>发育研究杂交瘤库</td><td>MYO7A 138-1</td><td></td></tr><tr><td>抗钙调蛋白抗体</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C 3545</td><td></td></tr><tr><td>抗钙结合蛋白抗体</td><td>Chemicon International</td><td>AB1778</td><td></td></tr><tr><td>Fluoromount G</td><td>SouthernBiotech</td><td>0100-01</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;表1&lt;/strong&gt;。 用于椭圆囊培养和腺病毒感染的试剂与工具</td></tr><tr><td colspan="4">* 注：Ad-GFP 通常由 Vector Biolabs 提供，储存滴度为 1×10&lt;sup&gt;10&lt;/sup&gt; PFU/mL。我们要求定制扩增，使储存病毒的滴度达到 1.2&amp;#215;10&lt;sup&gt;11&lt;/sup&gt; PFU/mL。</td></tr></tbody></table>

成年小鼠椭圆囊的解剖及腺病毒介导的支持细胞感染

Dissection of Adult Mouse Utricle and Adenovirus-mediated Supporting-cell Infection

听力损失和平衡功能障碍通常由内耳的感受器细胞——机械感觉毛细胞的死亡引起。由于目前尚无能够充分代表哺乳动物毛细胞的细胞系，毛细胞的研究依赖于原代器官培养。最成熟的体外（in vitro）成年哺乳动物毛细胞模型系统采用成年小鼠球囊的器官培养（图1）1-6。球囊是一种前庭器官，其毛细胞在结构和功能上均与听觉器官——柯蒂氏器中的毛细胞相似。成年小鼠球囊制备物代表了一种成熟的感受上皮，可用于研究调控这些细胞存活、稳态及死亡的分子信号。
哺乳动物的耳蜗毛细胞为终末分化的细胞，一旦丢失便无法再生。在非哺乳动物脊椎动物中，听觉或前庭毛细胞死亡后会伴随强烈的再生反应，从而恢复听觉和平衡功能7, 8。毛细胞的再生由胶质样支持细胞介导，这些支持细胞与感觉上皮中毛细胞的基底外侧表面相接触9, 10。支持细胞也是调控毛细胞存活与死亡的重要中介因子11。我们近期建立了一种利用腺病毒感染培养耳石器中支持细胞的技术。通过使用5型腺病毒（dE1/E3）将由CMV启动子驱动的含GFP的转基因递送至细胞，我们发现腺病毒能够特异性且高效地感染支持细胞。支持细胞的感染效率约为25–50%，而毛细胞未被感染（图2）。重要的是，我们发现腺病毒感染支持细胞不会对毛细胞或支持细胞产生毒性作用，因为在Ad-GFP感染的耳石器中细胞数量与未感染的耳石器相当（图3）。因此，在培养的耳石器中利用腺病毒介导的支持细胞基因表达，为研究支持细胞在毛细胞存活、死亡和再生过程中的作用提供了一个强有力的工具。

机械感受毛细胞是内耳中的感受器细胞。目前研究最为清楚的 体外 利用成年小鼠椭圆囊的器官培养作为成熟哺乳动物毛细胞的模型系统。本文展示了成年小鼠椭圆囊的解剖分离，并演示了在培养的椭圆囊中通过腺病毒介导感染支持细胞的方法。

听力损失和平衡功能障碍通常由机械感觉毛细胞死亡引起，这些细胞是内耳的感受器细胞。由于……

本演示展示了从小鼠耳石器中进行全器官培养的操作步骤。同时还将演示利用腺病毒转染培养耳石器中支持细胞的方法。该过程首先需要从内耳中精细分离耳石器。第二步是去除顶壁上皮。接着，去除耳石，保留感觉上皮完整。最后一步是利用腺病毒感染椭圆囊的支持细胞。这些技术可广泛应用于旨在研究成熟哺乳动物毛细胞和支持细胞的各种体外实验。内耳中的感觉受体细胞被称为毛细胞，这些细胞负责将声能或头部运动转化为向大脑传递的神经信号。听力损失通常由这些感觉毛细胞的死亡引起。为了研究感觉毛细胞死亡的潜在机制，拥有一个体外模型系统非常有用。我们将演示的方法利用成年小鼠椭圆囊的全器官培养。椭囊是内耳中的前庭器官，其毛细胞与听觉器官中的毛细胞相似，听觉器官称为柯蒂氏器。椭囊制备是研究成年哺乳动物毛细胞和支持细胞特征最明确的模型系统。此外，我们将展示本实验室近期开发的一种利用腺病毒感染椭囊支持细胞的方法。腺病毒技术使我们能够研究支持细胞在毛细胞存活、死亡和再生过程中的介导作用。在实验室中，我们利用这些技术来解决两个主要问题：第一，在应激条件下，决定毛细胞最终存活或死亡的细胞与分子信号是什么？其次，我们如何利用这些信息开发出用于预防或逆转听力损失的治疗方法，特别是临床疗法？我实验室的生物学家 Lindsey Maye 将演示这些技术。前庭囊（utricle）解剖的可视化演示非常重要，因为该组织体积微小且脆弱，极易受到机械损伤，尤其是在去除耳石和顶上皮的过程中。根据机构批准的动物护理和使用方案，对成年小鼠实施安乐死后断头，从尾侧至头侧将颅骨一分为二，并从两半颅骨中取出脑组织，以暴露骨迷路。接着，将骨蜗周围的颅骨组织修剪去除，将骨迷路转移至含有无菌培养基 199 的 35 毫米组织培养皿中。若听泡仍完整，使用两把坚固的镊子将听泡打破。请花一点时间辨认骨性标本上的解剖标志，包括耳蜗顶、底、岬、卵圆窗、圆窗、第八脑神经根以及半规管，这些结构在书面方案中所附的图像中均有显示。将标本置于培养皿中，使听小骨位于培养皿底部，第八脑神经根朝上。用镊子夹住半规管区域，使用带有11号刀片的手术刀，在神经根稍上方的耳蜗顶处将其切除。以前半规管作为操作手柄，固定并旋转标本，使切面朝上。现在使用5号镊子，从耳蜗的耳蜗轴开始向下至基底部取出耳蜗。然后使用由半对55号镊子制成的精细探针，抬起骨螺旋板的最后一条骨性突起，以暴露其下方的S结构，S结构下方即为镫骨底板。该图像显示了标记为 sf 的镫骨底板，这是识别邻近的球囊（标记为 U）位置的重要解剖标志，球囊紧邻镫骨底板。使用精细探针去除足够的骨质，以暴露约三分之一的球囊。然后使用 55 号镊子，从球囊边缘极近处或神经根部轻轻夹住并小心取出球囊。如果色素化的顶壁上皮仍附着于椭圆囊，则需使用精细镊子将其去除。若需利用耳石管进行腺病毒转染，则必须去除耳石。用解剖液充满注射器，并安装26或28号针头。用55号镊子夹住椭圆囊边缘，并用培养基液流冲洗耳石。或者，也可使用睫毛工具去除耳石。待所有椭圆囊均完成解剖后，将解剖用培养基更换为无菌培养基，将培养板置于37摄氏度、含5%二氧化碳的培养箱中孵育。所有腺病毒操作均需按照生物安全二级防护措施进行。准备感染时，使用微型刮匙将一个椭圆囊毛细胞转移至含有15微升无血清D-M-E-M-F 12培养基的无底培养板的一个孔中。向含有椭圆囊组织培养物的孔中加入1至4×10⁷空斑形成单位的腺病毒。将U型小管置于含病毒的培养基中，在37摄氏度、5%二氧化碳的湿化培养箱中孵育2小时。2小时后，将U型小管转移至含有含血清培养基的24孔组织培养板中。转移后，再次于37摄氏度、5%二氧化碳条件下过夜培养U型小管。U形管可用于次日的活体成像实验，也可用于免疫化学染色的固定。U形管在4%多聚甲醛中，于室温下在摇床上固定3小时，或在4摄氏度下过夜。随后，用0.1摩尔索伦森磷酸盐缓冲液在摇床上于室温下清洗U形管，每次15分钟，共清洗三次。如果先前未为腺病毒感染而去除耳石，则此时将椭圆囊浸入calx脱钙液中1至2分钟以去除耳石，随后用0.1摩尔Sorens磷酸盐缓冲液洗涤，再将椭圆囊浸入封闭液中，在室温下封闭3小时。封闭步骤完成后，用封闭液稀释一抗，加入含有椭圆囊的培养板中，在4摄氏度下孵育过夜。第二天，用磷酸盐缓冲液清洗耳石器和半规管。然后加入用封闭液稀释的二抗，在室温下避光于摇床上孵育四小时。最后，使用Flora Mount G将耳石器封片于玻璃载玻片上。这些共聚焦图像显示了同一耳石器区域中感染了表达绿色荧光蛋白的腺病毒后，毛细胞层和支持细胞层的情况。毛细胞用抗肌球蛋白七A抗体标记，呈洋红色。支持细胞用抗袜子蛋白2抗体标记，此处呈红色。可以看出，腺病毒GFP定位于支持细胞，而不在毛细胞中。该图显示，在掌握解剖技术后，以每毫升4×10⁸空斑形成单位的腺病毒GFP进行腺病毒感染，不会导致毛细胞或支持细胞死亡。一只动物的两个耳蜗可在10至15分钟内完成分离并投入培养。然而，在建立该实验流程时，必须注意在后续操作中处理组织时应保持耐心并小心谨慎。还可采用其他方法，如活体共聚焦成像、免疫组织化学、逆转录聚合酶链式反应（R-T-P-C-R）和蛋白质印迹（Western blotting），以研究支持细胞和毛细胞的死亡、存活及再生相关问题。观看本视频后，您应能够充分掌握如何分离椭圆囊以及如何利用腺病毒转导感染支持细胞。请记住，操作病毒可能存在生物安全风险，进行这些操作时应始终采取二级生物安全防护措施。

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通过圆窗膜进行病毒介导的基因递送至小鼠内耳的手术方法

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本报告重点介绍了利用小鼠背根神经节的器官型培养和分离的原代培养体系，以研究与神经元-胶质细胞相互作用、神经可塑性、神经炎症以及对病毒感染反应相关的多种机制。...

成年小鼠背根神经节外植体与分离细胞模型用于研究神经可塑性及对包括病毒感染在内的环境损伤的反应

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前庭和听觉感觉器官的三维类器官培养

本方案描述了携带目的基因缺失的小鼠尿路上皮类器官的生成与表征过程。方法包括小鼠尿路上皮细胞的获取、 离体 使用带有CMV启动子驱动Cre表达的腺病毒进行转导，以及 体外 以及 体内...

Ex Vivo 腺病毒-Cre 介导的小鼠尿路上皮细胞基因删除的类器官模型

本文描述了大量制备重组腺病毒的方法，这些病毒可用于转导天然啮齿类动物尿路上皮，从而实现外源基因的表达或内源性基因产物的下调。...

利用腺病毒介导的转导在天然膀胱尿路上皮中表达外源基因

血管纹对于耳蜗内电位的产生至关重要。本文介绍了用于单核测序或免疫染色的成年小鼠血管纹解剖方法。...

成年小鼠血管纹组织的解剖用于单核测序或免疫染色

学习成年小鼠椭圆囊的解剖方法及腺病毒介导的支撑细胞感染技术。该实验流程可完整保留感觉上皮结构，为研究哺乳动物毛细胞再生与听力保护提供可靠的体外模型系统。

成年小鼠椭圆囊的解剖及腺病毒介导的支持细胞感染

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